Summary
Здесь мы оцениваем влияние экстракта воды Рута graveolens на формирование сети судов с помощью трубки формирования асссировки на гелеобразной матрицы подвала.
Abstract
Ангиогенез является явление, которое включает в себя различные процессы, такие как пролиферация эндотелиальных клеток, дифференциация и миграция, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включают в себя несколько путей трансдукции сигнала. Здесь мы показываем, что анализ формирования трубки является простым методом in vitro для оценки влияния натуральных продуктов на ангиогенез и для исследования молекулярных механизмов. В частности, в присутствии экстракта воды Рута graveolens (RGWE), эндотелиальные клетки больше не в состоянии сформировать сеть клеток и что RGWE воздействие на человека пупочной вены эндотелиальной клетки (HUVEC) образование трубки отменяется составной активации МЭК.
Introduction
Ангиогенез является физиологическим процессом, который приводит к образованию новых кровеносных сосудов из уже существующих и происходит во время эмбриогенеза и роста органов. В зрелом возрасте ангиогенез активируется только в велосипедных яичниках, в плаценте во время беременности, а также во время заживления ран и ремонта. Ангиогенез зависит от способности эндотелиальных клеток размножаться, дифференцироваться и мигрировать, образуя нетронутую сосудистую сеть1. Однако при некоторых нарушениях, таких как воспалительные, метаболические и ревматические заболевания, изменяются ангиогенные процессы и становится чрезмерным ангиогенез. Кроме того, неконтролируемые ангиогенные процессытакже стимулируют прогрессирование опухоли и метастазирование 1. По этим причинам, в последнее десятилетие, исследования сосредоточены на разработке новых терапевтических стратегий, направленных на ингибирование чрезмерного ангиогенеза при раке, глазной, суставной или кожных заболеваний2,3.
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) представляет собой основную цельтекущей антиангиогенной терапии 4, и несколько анти-VEGF моноклональных антител были разработаны и синтезированы для предотвращения чрезмерного ангиогенеза. Тем не менее, эти синтетические наркотики показывают серьезные побочные эффекты и имеют неблагоприятное соотношение затрат на выгоду5,6. Поэтому крайне важно найти новые терапевтические стратегии, чтобы ограничить чрезмерный ангиогенез с минимальными побочными эффектами, чтобы дополнить и в сочетании с в настоящее время используется наркотиков. Эти новые препараты можно найти среди натуральных продуктов, которые характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической спецификой.
В этой статье мы предлагаем простой метод для оценки влияния RGWE на способность HUVECs формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала in vitro5. Действительно, RGWE представляет собой смесь вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и полифенолы, среди которых колея является основным компонентом5. Многие из них уже протестированы как противовоспалительные и вазопротекторные средства7,8,9,10,11. Кроме того, мы недавно показали, что RGWE, но не rutin, способен подавлять способность HUVEC формировать трубочки на гелеобразной матрице подвала и что это явление опосредовано meK-ERK путь, указывая RGWE в качестве потенциального терапевтического инструмента, способного предотвратить чрезмерное образование новых кровеносных сосудов5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка РГВЕ
- Соберите Листья R. graveolens из растений в течение весенне-летних месяцев под наблюдением ботаника.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, листья были собраны в экспериментальной секции лекарственных растений в Ботаническом саду Неаполя, Италия5. Растение спонтанное, многолетнее, и присутствует в средиземноморских регионах(рисунок 1). - Взвесить 250 г листьев и мелко нарезать их ножницами.
- Положите листья в коническую колбу и добавить 1 л дистиллированной воды до 250 г нарезанных листьев и довести это до кипения при температуре 110 градусов по Цельсию в течение 60 минут. Накройте колбу алюминиевой фольгой, чтобы избежать чрезмерного испарения.
- Используйте фильтровальную бумагу 3 мм, чтобы отделить отварные листья от жидкой фазы, представляющей экстракт воды.
- Фильтр жидкой фазы через фильтр 0,22 мкм, собирая его в стакан. Обложка стакан с parafilm и заморозить экстракт на -80 градусов по Цельсию в одночасье.
- Сделайте 10 - 15 отверстий с помощью иглы в парафильме и лиофилизируют экстракт в лиофилизаторе. Обратите внимание, что это может занять несколько дней, чтобы получить порошок.
- Взвесьте полученный порошок, разделите его на aliquots и храните его при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока это необходимо. Его можно хранить в течение года.
- При необходимости для экспериментов приготовьте бульонный раствор, разбавляя порошок дистиллированной водой до стандартной концентрации 50 мг/мл. Разделите его на малообъемные (например, 1 мл) аликвоты. Этот препарат может храниться при -20 градусов до использования, но не может храниться при 4 градусах Цельсия в течение более чем нескольких дней из-за окисления молекул. Избегайте замерзнуть и оттепели.
2. Культура клеток
- Культивировать HUVECs в эндотелиальной среде роста клеток: эндотелиальная базальная среда дополнена 1 мкг/мл гидрокортизона и 1 нг/мл эпидермального фактора роста, 10% FBS, и пенициллин / стрептомицин при 37 градусах по Цельсию в атмосфере 5% CO2.
- Когда 80% слияния, разделить клетки в соотношении 1:3 каждый проход. Используйте клетки от двух до пяти проходов, которые не показывают явных различий в ответ на факторы роста. После шестого прохода клетки становятся старческими и не образуют трубки на гелеобразной подвальной матрице.
3. Трансфекция
- Когда HUVECs являются 70% слияния, трансфектируют их с желаемым геном.
- Для 100-мм пластины используйте 1 мкг пустого вектора pCDNA3 в качестве контроля и 1 мкг вектора pCDNA3, содержащего ген интереса (в данном случае, в обязательно мята активных MEK (caMEK).
- Комплекс 1 мкг ДНК с 3 л липофектамина 2000, разбавленный пониженной сывороточкой средой (см. Таблица Материалов) до конечного объема 200 Л. Удалить среду из клеток и заменить его 1 мл свежей полной среды; затем добавьте трансфектирующее раствор в клетки. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусахЦельсия, с 5% CO 2. Можно также использовать другие трансфекционные агенты отличаются от липофектамина 2000, следуя инструкциям производителя.
- Добавьте 7 мл полной свежей среды 3 ч после трансфекции, а затем, дальнейшее инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 - 48 ч, прежде чем приступить к следующему анализу. На следующий день после трансфекции замените среду свежей полной средой.
4. Труба Формирование Ассай
- Охладите 96-ну хорошую тарелку и пипетку советы на 4 КК в течение 1 ч, прежде чем готовить гелеобразный подвал.
- В момент подготовки подвала, положить пластину на лед (0 градусов по Цельсию) и добавить 50 qL холодной матрицы в каждом колодце, избегая образования пузырьков. Обратите внимание, что матричная флакон должна храниться на льду во время процедуры, так как матрица становится твердой при комнатной температуре.
- Положите пластину в инкубатор на 37 градусов с 5% CO 2, по крайней мере 30 минут, чтобы подвал полимеризации.
- В то же время, урожай клеток. Вымойте HUVECs с 1 мл раствора 0,25% трипсина/0,53 мм EDTA; Затем добавьте 2 мл раствора трипсин-ЭДТА и инкубировать при 37 градусах По 5 мин. Наблюдайте за клетками под перевернутым микроскопом, чтобы убедиться, что клеточный слой полностью рассеян. Затем соберите среду, в которой клетки подвешены, и соберите отдельные клетки центрифугированием при 264 х г в течение 3 мин. Переприостановите их в 1 мл фосфатно-буферного солевой раствора (PBS).
- Чтобы подсчитать клетки, добавьте 0,2 мл клеточной подвески до 0,5 мл PBS и 0,3 мл 0,4% пробана синего раствора. После 5 минут при комнатной температуре посчитайте клетки в камере Бюркера.
- Resuspend клетки в полной среде в концентрации 2 х 104 клетки /50 ЗЛ. Семя их на гелеобразный подвал в концентрации 2 х 104 клетки в хорошо, и пусть они оседают на нем.
- Обратите внимание на количество клеток. Слишком много или слишком мало клеток не может образовывать трубки в правильном направлении на гелеобразном подвале.
- Приготовьте увеличивающиеся дозы RGWE (0,01, 0,1 и 1 мг/мл), разбавляя запасной раствор в культуре среднего или колютина (12, 120 и 300 мкг/мл), все в конечном объеме 50 л/ну, и добавьте их к 50 л/хорошо клеточной подвески. Окончательный объем в каждой скважине будет 100 л. Подготовьте от четырех до шести скважин для каждого экспериментального состояния. В качестве контроля разбавляют дистиллированную воду (транспортное средство) в культурной среде в соотношении 1:50.
- Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение времени в диапазоне от 6 до 24 ч.
- Наблюдайте за клетками в пределах временной дальности, охватывающей от 6 до 24 ч после посева, используя фазовый контрастный микроскоп при увеличении 10X. HUVECs способны формировать трубчатые структуры в пределах 6 ч, но можно наблюдать лучшие результаты после 12 - 18 ч. Фотография трубчатых структур на каждом колодце и изображение в среднем от трех до пяти случайных полей в каждом колодце.
- После получения изображения клетки можно отсоединить от матрицы подвала и посчитать, чтобы оценить влияние лечения на количество клеток. Для каждого колодца удалите средство, добавьте диспазу в концентрации 24 U/mL и положите тарелку при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. Затем, из каждой скважины, соберите среду, в которой клетки подвешены и собирают отдельные клетки центрифугированием при 264 х г в течение 3 мин. Отрежь их в 0,2 мл PBS. Чтобы подсчитать клетки, добавьте 0,2 мл клеточной суспензии до 0,5 мл PBS и 0,3 мл 0,4% пробана синего раствора. После 5 минут при комнатной температуре подсчитайте клетки в камере Бюркера.
- Для количественной оценки результатов исследования формирования трубки можно подсчитать количество ветких точек, в которые соединяются не менее трех трубок. Используя соответствующее программное обеспечение изображения, подсчитайте для каждого поля в каждом микрографе количество точек ветки и вычислите среднее значение стандартной ошибки (SE) для каждого экспериментального состояния. Используйте двуххвостый t-тест для оценки статистической значимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы оценить влияние RGWE на ангиогенез, мы провели анализ формирования трубки на гелеобразной матрице подвала. При культивировании на нем, HUVECs форме трубки, как структуры, которые происходят из клеток, которые появляются удлиненные и которые соединяют друг с другом, чтобы сформировать сеть клеток (Рисунок 2). На рисунке 3, мы показываем, что количество филиалов в HUVECs лечение RGWE было значительно ниже, по сравнению с условиями контроля. Примечательно, что при наличии 0,1 мг/мл и 1 мг/мл RGWE, количество ветвей ниже на 40% и 60%, соответственно, по сравнению с состоянием контроля. Так как рута была указана в качестве основного компонента RGWE5, мы проанализировали его влияние на HUVEC трубки формирования анализа. Как показано на рисунке 4, колея сама по себе не в состоянии повлиять на способность HUVECs формировать сеть клеток. Затем мы использовали анализ формирования трубки для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе индуцированного RGWE ингибирования образования трубки. Внутриклеточного сигнального пути MEK/ERK играет ключевую роль в ангиогенных процессах. HUVECs транссексуалов caMEK были обработаны RGWE и культивируется на гелеобразной матрицы подвала. Как показано на рисунке 5, в caMEK-транс-транс-инфицированных эндотелиальных клеток, RGWE больше не ингибирует образование трубки, в то время как макет-транс-инфицированных клеток, используемых в качестве контроля, по-прежнему образуют сеть клеток на gelled подвале матрицы и реагируют на RGWE, таким образом, указывая что эффект RGWE в ангиогенезе опосредовано пути MEK-ERK.
Рисунок 1: Рута graveolens. Кустарник Рута graveolens. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: HUVECs образуют трубку, как структуры на гелеобразной матрицы подвала. Представитель микроскопические фотографии HUVECs культивируется в полистирола блюдо (слева) и на гелеобразной матрицы подвала (справа). Шкала бар 10 мкм.
Рисунок 3: RGWE ингибирует образование труб в HUVECs. (A) Высокомощные микроскопические фотографии HUVECs культивируется на гелеобразной матрицы подвала, обработанные RGWE (0, 0,01, 0,1 и 1,0 мг/мл). Шкала бар 10 мкм. (B) Процент huVEC точки ветви (темно-серый) в присутствии RGWE (0,01, 0,1 и 1,0 мг/мл) по сравнению с необработанными клетками (0 мг/мл) и трипан синий тест исключения (светло-серый) на HUVECs лечение (0,01 , 0,1 и 1 мг/мл) или нет (0 мг/мл) с RGWE на 24 ч...р. Результаты выражаются в виде среднего - SE трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была получена с помощью двуххвостого тестаt.
Рисунок 4: Рутин не влияет на формирование трубки HUVEC. (A) Высокомощные микроскопические фотографии HUVECs, посеянных на гелеобразной матрице подвала и обработанных (12, 120 и 300 мкг/мл) или нет (0 мкг/мл) с колеей на 24 ч. Шкала бар 10 мкм. (B) Процент HUVEC точки ветви (темно-серый) в присутствии увеличения дозы рутения (12, 120, и 300 м/мл) по сравнению с условиями контроля (0 мкг/мл) и трипан синий тест исключения (светло-серый) на HUVECs лечение (12 , 120 и 300 мл/мл) или нет (0 мкг/мл) с колеей на 24 ч. Результаты выражаются в виде среднего - SE трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была получена с помощью двуххвостого тестаt.
Рисунок 5: ПУТЬ MEK опосредует RGWE эффекты на образование трубки HUVEC. (A) Высокомощные микроскопические фотографии HUVECs трансфицируются пустым вектором (макет трансфекции) или с caMEK, посеяны на гелеобразной матрице подвала и обработаны с увеличением дозЫ RGWE (0, 0,01, 0,1 и 1 мг/мл). Шкала бар 10 мкм. (B) Процент числа ветвей точек в HUVECs макет-транс-инфицированных (темно-серый) и в HUVECs трансфицируются caMEK (светло-серый) и лечение с увеличением дозЫ RGWE (0,01, 0,1 и 1 мг/мл) по сравнению с контролем состояний (0 мг/мл). - стр. 0,01 против условия управления; § р Злт; 0,05 против клеток, трансфицируемых с пустым вектором и обработанных с тем же количеством RGWE. Результаты выражаются в виде среднего - SE трех независимых экспериментов. Статистическая значимость была получена с помощью двуххвостого тестаt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Природные соединения характеризуются высоким химическим разнообразием и биохимической специфичностью и представляют собой источник потенциально терапевтических молекул. Здесь мы покажем, как получить экстракт воды из завода R. graveolens и предлагаем исследование образования трубки как простой в выполнении, надежный и количественный метод, полезный для исследования влияния RGWE на ангиогенез. Важно варить R. graveolens листья на 1 ч, чтобы убедиться, чтобы получить полный экстракт воды. Кипение менее 1 ч не позволяло извлечения всех молекул, а экстракт не мог оказать ожидаемого биологического эффекта.
Анализ формирования труб представляет собой тест in vitro для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе нескольких шагов, которые приводят к образованию новых кровеносных сосудов. Этот анализ позволяет исследователям определить соединения, способные модулировать ангиогенез, а также белки и сигнальные каскады участие. Кроме того, этот анализ позволяет исследователям проверить вещества, которые могут влиять, в то же время, пролиферации эндотелиальной клетки, сливки, миграции и протеазы деятельности, все важные механизмы в формировании кровеносных сосудов. Используя только этот вид теста, мы показываем, что RGWE, но не его основной компонент рутеции, способен уменьшить способность HUVECs формировать трубчатые структуры, не влияя на жизнеспособность клеток, и что этот эффект зависит от активации пути MEK-ERK. Тем не менее, важно выполнить тест с нужным количеством ячеек. В самом деле, слишком мало или слишком много клеток не может позволить правильное образование труб. По этой причине желательно провести предварительный тест, чтобы найти правильное количество клеток. Кроме того, количество клеточных проходов так же важно, как и число клеток, так как, чтобы получить правильный результат формирования трубки, клетки должны проходить два-пять раз. После прохождения 6 возникают механизмы сенесценции, которые могут ухудшить формирование правой трубки.
Анализ формирования трубки является очень воспроизводимым анализом, и он проливает свет на физиологию эндотелиальных клеток, даже если это не золотой стандарт для трехмерного исследования образования трубки8,9,10, 11. Трехмерные модели коллагена и фибрина, как было показано, лучше для исследований сосудистого тубулогенеза, прорастания и эндотелиального взаимодействия клеток-перицитов. Однако, по сравнению с трубой формирования анализа на гелеобразной матрицы подвала, эти тесты больше времени и денег, потребляющих11, предполагая, что первый может быть хорошим тестом для получения предварительных результатов, которые могут быть основой для более целенаправленной в vivo исследований. Наконец, промывка образования трубки может быть проведена в 24 ч, так как непреобразованные HUVECs способны образовывать трубчатые структуры в пределах 6 ч12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Fondi ди Ateneo Лука Колуччи-D'Amato и VALERE Программа средств Для Марии Терезы Джентиле и AIRC фонд IG18999 Маурицио Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
