Summary
Här utvärderar vi effekterna av vattenextrakt av ruta graveolens på fartygs nätet bildas med hjälp av en slang formation assay på en geléartad källare matris.
Abstract
Angiogenes är ett fenomen som omfattar olika processer, såsom endotelcellproliferation, differentiering, och migration, som leder till bildandet av nya blodkärl och involverar flera signaltransduktionvägar. Här visar vi att röret formation analysen är en enkel in vitro -Metod för att utvärdera effekterna av naturliga produkter på angiogenes och att undersöka de molekylära mekanismerna inblandade. I synnerhet, i närvaro av vatten extraktet av ruta graveolens (rgwe), endotelceller inte längre kan bilda ett cell-cell-nätverk och att rgwe effekter på mänskliga navel Strängs endotelceller cell (huvec) rör bildning avskaffas genom en konstitutiv aktivering av MEK.
Introduction
Angiogenes är en fysiologisk process som leder till bildandet av nya blodkärl från redan existerande och uppträder under embryogenes och orgel tillväxt. I vuxen ålder, angiogenes aktiveras endast i cykling äggstock, i moderkakan under graviditeten, och under sårläkning och reparation. Angiogenes beror på förmågan hos endotelceller att förgöra, differentiera, och migrera för att bilda en intakt vaskulär nätverk1. Emellertid, i flera sjukdomar, såsom inflammatoriska, metabola, och reumatiska sjukdomar, angiogena processer ändras och angiogenes blir överdriven. Dessutom, okontrollerad angiogena processer stimulerar också tumörprogression och metastaser1. Av dessa skäl, under det senaste decenniet, forskningsstudier är inriktade på utveckling av nya terapeutiska strategier som syftar till att hämma överdriven angiogenes i cancer, ögon, LED, eller hudsjukdomar2,3.
Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) representerar det huvudsakliga målet för nuvarande antiangiogena terapier4, och flera anti-VEGF monoklonala antikroppar har utvecklats och syntetiserats för att förhindra överdriven angiogenes. Emellertid, dessa syntetiska droger visar allvarliga biverkningar och har en ofördelaktig kostnad till nytta förhållandet5,6. Därför, det är absolut nödvändigt att hitta nya terapeutiska strategier för att begränsa överdriven angiogenes med minimala biverkningar att komplettera och kombinera med närvarande används droger. Dessa nya läkemedel kan hittas bland naturliga produkter som kännetecknas av en hög kemisk mångfald och biokemiska specificitet.
I denna artikel, föreslår vi en enkel metod för att utvärdera effekterna av rgwe på förmågan hos huvecs att bilda tubuli på en geléartad källare matris in vitro-5. I själva verket, RGWE är en blandning av sekundära metaboliter såsom flavonoider och polyfenoler bland vilka rutin är den viktigaste komponenten5. Många av dem har redan testats som anti-inflammatoriska och vasoskyddande medel7,8,9,10,11. Dessutom har vi nyligen visat att rgwe, men inte rutin, kan hämma huvec förmåga att bilda tubuli på en geléartad källare matris och att detta fenomen förmedlas av MEK-erk väg, vilket indikerar rgwe som ett potentiellt terapeutiskt verktyg som kan förhindra överdriven ny blodkärlsbildning5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE förberedelse
- Samla R. graveolens blad från växter under vår/sommarmånaderna under överinseende av en botaniker.
Anmärkning: I detta fall var bladen samlades in på experimentell del av Medicinal växter i botaniska trädgården i Neapel, Italien5. Växten är spontan, perenn och förekommer i Medelhavsregionerna (figur 1). - Väg 250 g blad och finhacka dem med sax.
- Lägg bladen i en konisk kolv och tillsätt 1 L destillerat vatten till 250 g hackade blad och koka upp vid 110 ° c i 60 min. Täck kolven med aluminiumfolie för att undvika överdriven avdunstning.
- Använd 3 mm-trattfilterpapper för att separera de kokta bladen från vätskefasen som representerar vatten extraktet.
- Filtrera vätskefasen genom ett 0,22 μm-filter och samla upp det i en bägare. Täck bägaren med parafilm och frys extraktet vid-80 ° c över natten.
- Gör 10-15 hål med en nål i parafilm och lyophilize extraktet i en frystorkat. Observera att det kan ta ett par dagar att få pulvret.
- Väg det erhållna pulvret, dela in det i alikvoter och förvara det vid 4 ° c tills det behövs. Det är möjligt att lagra den i ett år.
- När det är nödvändigt för experimenten, Förbered en stamlösning, späda pulvret med destillerat vatten till en standard koncentration på 50 mg/mL. Separera den i små volymer (t. ex. 1 mL) alikvoter. Denna beredning kan förvaras vid-20 ° c tills den används men kan inte förvaras vid 4 ° c i mer än ett par dagar på grund av oxidationer av molekylerna. Undvik frysning och Tina.
2. cell odling
- Odla huvecs i endotelceller celltillväxt medium: endotelceller basal medium kompletterat med 1 μg/ml hydrokortison och 1 ng/ml Epidermal tillväxtfaktor, 10% FBS, och penicillin/streptomycin vid 37 ° c i en atmosfär av 5% Co2.
- När 80% confluent, dela upp cellerna vid förhållandet 1:3 varje passage. Använda celler från två till fem passager, som inte visar uppenbara skillnader i svar på tillväxtfaktorer. Efter den sjätte passagen, celler blir senescent och inte bildar rör på den geléartad källaren matris.
3. transfektion
- När HUVECs är 70% confluent, transfect dem med önskad gen.
- För en 100 mm platta, Använd 1 μg tom pCDNA3 vektor som kontroll och 1 μg pCDNA3 vektor som innehåller genen av intresse (konstitutivt aktiva MEK [caMEK], i detta fall).
- Komplex 1 μg DNA med 3 μL lipofectamin 2 000, spädd med reducerat serum medium (se tabell över material) till den slutliga volymen av 200 μl. ta bort mediet från cellerna och Ersätt det med 1 ml färskt komplett medium; Lägg sedan till den transfecting lösningen i cellerna. Inkubera cellerna i inkubatorn vid 37 ° c, med 5% CO2. Det är möjligt att också använda andra transfektion agenter skiljer sig från lipofectamine 2 000, enligt tillverkarens anvisningar.
- Tillsätt 7 mL komplett färskt medium 3 h efter transfektion och, sedan, ytterligare Inkubera cellerna vid 37 ° c för 24-48 h innan du fortsätter med nästa analyser. Dagen efter transfektion, ersätta mediet med färskt komplett medium.
4. test av rör bildning
- Kyl en 96-brunn plattan och pipettspetsarna vid 4 ° c i 1 h innan du förbereder den geléartad källaren.
- Vid tidpunkten för källaren förberedelse, sätta plattan på isen (0 ° c) och tillsätt 50 μL av kall matris i varje brunn samtidigt undvika bildandet av bubblor. Observera att den Matrix-innehållande injektionsflaskan ska förvaras på is under ingreppet eftersom matrisen blir fast vid rumstemperatur.
- Sätt plattan i inkubatorn vid 37 ° c med 5% CO2 i minst 30 min för att låta källaren polymerisera.
- Under tiden, skörda cellerna. Tvätta Huvekerna med 1 mL av en 0,25% trypsin/0,53 mM EDTA-lösning; Tillsätt sedan 2 mL av trypsin-EDTA-lösningen och inkubera vid 37 ° c i 5 min. Observera cellerna under ett inverterat Mikroskop för att kontrollera att cell skiktet är helt spridda. Sedan, samla in mediet där cellerna är suspenderade och skörda de fristående cellerna genom centrifugering på 264 x g för 3 min. Omsuspendera dem i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- För att räkna cellerna, tillsätt 0,2 mL av cellsuspensionen till 0,5 mL PBS och 0,3 mL av 0,4% trypan blå lösning. Efter 5 min vid rumstemperatur, räkna cellerna i en Bürker kammare.
- Omsuspendera cellerna i fullständigt medium vid koncentrationen 2 x 104 celler/50 μl. frö dem på den geléartad källaren vid koncentrationen av 2 x 104 celler per brunn och låt dem bosätta sig på den.
- Uppmärksamma antalet celler. För många eller för få celler får inte bilda rör på rätt sätt på den geléartad källaren.
- Förbered ökande doser av RGWE (0,01, 0,1 och 1 mg/mL), utspädning av stamlösningen i odlingsmedium eller rutin (12, 120, och 300 μg/mL), allt i den slutliga volymen av 50 μL/brunn, och tillsätt dem till 50 μL/brunn av cellsuspension. Den slutliga volymen i varje brunn kommer att vara 100 μL. Förbered fyra till sex brunnar för varje försöks tillstånd. Som kontroll, späd destillerat vatten (fordon) i odlingsmediet vid ett förhållande av 1:50.
- Inkubera cellerna i inkubatorn vid 37 ° c och 5% CO2 under en tid mellan 6 och 24 timmar.
- Observera cellerna inom ett tidsintervall som spänner från 6 till 24 h efter sådd, med hjälp av ett fas-kontrast Mikroskop vid en förstoring av 10X. HUVECs kan bilda rör-liknande strukturer inom 6 h men det är möjligt att observera bättre resultat efter 12-18 h. fotografera rör-liknande strukturer på varje brunn och bild i genomsnitt från tre till fem slumpmässiga fält i varje brunn.
- Efter bild förvärvet kan cellerna lossas från Källar matrisen och räknas för att utvärdera effekten av behandlingen på antalet celler. För varje brunn, ta bort mediet, tillsätt dispas vid en koncentration av 24 U/ml, och sätta plattan vid 37 ° c för 1 h. Sedan, från varje brunn, samla in mediet där cellerna är suspenderade och skörda de fristående cellerna genom centrifugering vid 264 x g för 3 min. Omsuspendera dem i 0,2 ml PBS. För att räkna cellerna, tillsätt 0,2 mL cellsuspension till 0,5 mL PBS och 0,3 mL av 0,4% trypan blå lösning. Efter 5 min vid rumstemperatur, räkna cellerna i Bürker kammaren.
- För att kvantifiera resultaten av röret formation assay, är det möjligt att räkna antalet gren punkter där minst tre rör ansluta sig. Med hjälp av lämplig bildprogram vara, räkna för varje fält i varje Mikrograf antalet förgrenings punkter och beräkna medelvärdet ± standardfelet (SE) för varje försöks tillstånd. Använd ett tvåsidiga t-test för att utvärdera statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utvärdera påverkan av rgwe på angiogenes, genomförde vi ett rör formation assay på en geléartad källare matris. När den odlas på den, bildar HUVECs rör-liknande strukturer som kommer från celler som verkar långsträckta och som ansluter varandra för att bilda ett cell-cell-nätverk (figur 2). I diagram 3visar vi att antalet filialer i HUVECs som behandlades med rgwe var signifikant lägre jämfört med kontrollvillkoren. I synnerhet, i närvaro av 0,1 mg/mL och 1 mg/mL RGWE, antalet grenar är lägre med 40% och 60%, respektive, jämfört med kontrollvillkoret. Eftersom rutin har angetts som den viktigaste komponenten i RGWE5, analyserade vi dess effekt på huvec rör-formation assay. Som framgår av figur 4, kan inte rutin ensamt påverka HUVECs förmåga att bilda ett cell-cell-nätverk. Sedan använde vi röret formation analysen för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom RGWE-inducerad hämning av rör bildning. MEK/ERK intracellulär signaleringsväg utövar en central roll i angiogena processer. Huvecs transfekterade av camek behandlades med rgwe och odlas på geléartad källare matris. Som visas i figur 5, i camek-transfected endotelceller, rgwe inte längre hämmar rör formation, medan mock-transfected celler, som används som kontroll, fortfarande bildar ett cell-cell-nätverk på den geléartad källaren matrisen och är lyhörda för rgwe, vilket indikerar att RGWE ' s effekt i angiogenes förmedlas genom MEK-ERK-vägen.
Figur 1: ruta graveolens. En ruta graveolens buske. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: huvecs bildar rör-liknande strukturer på en geléartad källare matris. Representativa mikroskopiska fotografier av huvecs odlade i polystyren skålen (vänster) och på geléartad källare matris (höger). Skalstapel = 10 μm.
Figur 3: RGWE hämmar rör bildningen i HUVECs. (A) hög effekt mikroskopiska fotografier av huvecs odlade på en geléartad källare matris som behandlats med rgwe (0, 0,01, 0,1, och 1,0 mg/ml). Skalstapeln är 10 μm. (B) den procentuella andelen av huvec-grenpunkten (mörkgrå) i närvaro av rgwe (0,01, 0,1 och 1,0 mg/ml) jämfört med obehandlade celler (0 mg/ml) och det blå uteslutnings testet för trypan (ljusgrå) på behandlade HUVECs (0,01 , 0,1 och 1 mg/mL) eller inte (0 mg/mL) med RGWE för 24 h. *p < 0,01 jämfört med kontrollvillkoret (0 mg/ml). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. Den statistiska signifikansen erhölls genom ett tvåsidiga t-test.
Figur 4: rutin påverkar inte HUVEC-rörs bildningen. (A) hög effekt mikroskopiska fotografier av huvecs seedade på en geléartad källare matris och behandlade (12, 120 och 300 μg/ml) eller inte (0 μg/ml) med rutin för 24 h. Skalstapeln är 10 μm. (B) den procentuella andelen huvec-grenpunkt (mörkgrå) i närvaro av ökande doser av rutin (12, 120 och 300 μ/ml) jämfört med kontrollvillkor (0 μg/ml) och det blå uteslutnings testet (ljusgrå) på HUVECs som behandlats (12 , 120 och 300 μ/mL) eller inte (0 μg/mL) med rutin för 24 h. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. Statistisk signifikans erhölls genom ett tvåsidiga t-test.
Figur 5: mek-utbildningsavsnitt förmedlar RGWE-effekter på HUVEC-rörbildning. (A) hög effekt mikroskopiska fotografier av huvecs transfekterade med tom vektor (mock transfektion) eller med camek, seedade på den geléartad källaren matrisen och behandlas med ökande doser av rgwe (0, 0,01, 0,1, och 1 mg/ml). Skalstapeln är 10 μm. (B) den procentuella andelen av antalet förgrenade punkter i huvecs mock-transfekterade (mörkgrå) och i huvecs transfekterade med camek (ljusgrå) och behandlade med ökande doser av rgwe (0,01, 0,1 och 1 mg/ml) jämfört med kontroll tillstånd (0 mg/mL). *p < 0,01 jämfört med kontrollvillkoret; § p < 0,05 vs. celler som transfekterade med den tomma vektorn och behandlas med samma mängd rgwe. Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SE av tre oberoende experiment. Den statistiska signifikansen erhölls genom ett tvåsidiga t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naturliga föreningar kännetecknas av en hög kemisk mångfald och biokemiska specificitet och utgör en källa till potentiellt terapeutiska molekyler. Här visar vi hur man får vattenextrakt från växten R. graveolens och föreslå röret formation assay som en enkel att utföra, tillförlitlig och kvantitativ metod användbar för att undersöka rgwe effekter på angiogenes. Det är viktigt att koka R. graveolens bladen för 1 h för att vara säker på att få hela vatten extraktet. Kokande för mindre än 1 h tillät inte för utvinning av alla molekyler, och extraktet kunde inte utöva den förväntade biologiska effekten.
Röret formation assay representerar ett in vitro-test för att studera de molekylära mekanismerna bakom flera steg som leder till bildandet av nya blodkärl. Detta test gör det möjligt för forskare att identifiera föreningar som kan modulera angiogenes, samt proteiner och signalering kaskader inblandade. Dessutom, detta test gör det möjligt för forskare att testa ämnen som kan påverka, på samma gång, endotelceller proliferation, vidhäftning, migration, och proteas aktivitet, alla viktiga mekanismer i blod kärls bildningen. Med endast denna typ av test, visar vi att RGWE, men inte dess viktigaste komponent rutin, kan minska HUVECs förmåga att bilda rör-liknande strukturer utan att påverka cellernas lönsamhet och att denna effekt beror på MEK-ERK väg aktivering. Det är dock viktigt att utföra testet med rätt antal celler. Faktum är att för få eller för många celler inte kunde tillåta rätt bildandet av rören. Av denna anledning är det lämpligt att utföra ett preliminärt test för att hitta rätt antal celler. Dessutom, antalet cellpassager är lika viktigt som cell nummer eftersom, för att få rätt rör formation assay, celler måste vara blint två till fem gånger. Efter passage 6, åldras mekanismer uppstår som kan försämra rätt rör formation.
Röret formation analysen är en mycket reproducerbar analys, och det kastar ljus på fysiologi endotelceller, även om det inte är den gyllene standarden för tredimensionell studie av rör formation8,9,10, 11. Tredimensionellt kollagen och fibrin modeller har visat sig vara bättre för undersökningar av vaskulär tubulogenes, Sprouting, och endotelceller-pericyte interaktion. Men jämfört med röret formation assay på geléartad källare matris, dessa tester är mer tids-och pengar konsumerar11, vilket tyder på att den första kan vara ett bra test för att få preliminära resultat som kan vara grunden för mer fokuserade in vivo studier. Slutligen kan röret formation analysen utföras i 24 h, eftersom icke omvandlad huvecs har möjlighet att bilda rör-liknande strukturer inom 6 h12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Fondi di Ateneo till Luca Colucci-d ' Amato och VALERE program medel till Maria Teresa Gentile och AIRC Fund IG18999 till Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
