Summary
Burada, biz su ekstresinin etkilerini değerlendirmek Ruta graveolens gemi ağ oluşumu üzerinde bir tüp oluşumu tahlil kullanarak bir jelli Bodrum matris.
Abstract
Angiogenesis, endotel hücre proliferasyonu, farklılaşma ve göç gibi farklı süreçler içeren, yeni kan damarlarının oluşumuna yol açabilecek ve çeşitli sinyal iletim yollarından oluşan bir olgudur. Burada, tüp oluşumu tahlil doğal ürünlerin anjiyogenez üzerinde etkisini değerlendirmek ve ilgili moleküler mekanizmaları araştırmak için basit bir in vitro yöntemi olduğunu göstermektedir. Özellikle, Ruta graveolens (rgwe) su özü varlığı, endotel hücreleri artık bir hücre hücre ağı oluşturmak mümkün ve insan göbek ven endotel hücre üzerinde rgwe etkileri (HUVEC) tüp oluşumu tarafından kaldırılmıştır MEK kurucu aktivasyonu.
Introduction
Angiogenesis, önceden mevcut olanlarla yeni kan damarlarının oluşumuna yol açan ve embriyogenit ve organ büyümesi sırasında meydana gelen fizyolojik bir süreçtir. Yetişkinlikte, anjiyojenez sadece bisiklet yumurtası, gebelik sırasında plasenta, ve yara iyileşmesi ve onarımı sırasında aktive edilir. Anjiyojenez, endotelyal hücrelerin çoğalmasına, farklılaştırmaya ve bozulmamış bir vasküler ağ oluşturmak için göç edebilme yeteneğine bağlıdır1. Ancak, enflamatuar, metabolik ve romatizmal hastalıklar gibi çeşitli hastalıklarda anjiyojenik süreçler değiştirilir ve anjiyojenez aşırı olur. Ayrıca, kontrollü anjiyojenik süreçler de tümör progresyonu ve metasrik1uyarır. Bu nedenlerden dolayı, son on yıl içinde, araştırma çalışmaları kanser, oküler, eklem veya cilt bozuklukları2,3aşırı anjiyogenezi inhibisyonu amaçlayan yeni terapötik stratejilerin gelişmesine odaklanmaktadır.
Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) mevcut antianjiyojenik tedavilerin ana hedefini temsil eder4, ve birçok ANTI-VEGF monoklonal antikorlar geliştirilmiştir ve aşırı anjiyogenezi önlemek için sentezlenmiş. Ancak, bu sentetik ilaçlar şiddetli yan etkileri gösterir ve olumsuz maliyet-to-fayda oranı5,6var. Bu nedenle, tamamlayıcı ve şu anda kullanılan ilaçlar ile birleştirmek için minimal yan etkileri ile aşırı anjiyogenezi sınırlamak için yeni terapötik stratejiler bulmak zorunludur. Bu yeni ilaçlar, yüksek kimyasal çeşitlilik ve biyokimyasal özgüllük ile karakterize doğal ürünler arasında bulunabilir.
Bu yazıda, RGWE 'nin HUVECs 'in bir jelli Bodrum Matrix in vitro5' te tübüller oluşturabilme yeteneğinin etkisini değerlendirmek için basit bir yöntem öneriyoruz. Nitekim, rgwe gibi flavonoidler ve polifenoller gibi ikincil metabolitlerin bir karışımı olan rutin büyük bileşen5. Birçoğu zaten anti-inflamatuar ve vazokoruyucu ajanlar olarak test edilmiştir7,8,9,10,11. Dahası, Geçenlerde göstermiştir ki RGWE, ama rutin değil, HUVEC yeteneği bir jelli Bodrum matrisinde tübüller oluşturmak için inhibe edebiliyoruz ve bu fenomen MEK-ERK yolu tarafından aracılı olduğunu, potansiyel bir tedavi aracı olarak RGWE gösteren mümkün aşırı yeni kan damar oluşumu önlemek5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE hazırlık
- Toplamak R. graveolens bir botanikçi gözetiminde ilkbahar/yaz aylarında bitkilerin yaprakları.
Not: Bu durumda, yaprakları Napoli Botanik Bahçesi 'nde şifalı bitkiler deneysel bölümünde toplanan, Italya5. Bitki spontan, çok yıllık ve Akdeniz bölgelerinde mevcut (Şekil 1). - Tartmak 250 g yaprakları ve ince makas ile onları doğrayın.
- Bir konik Flask yaprakları koymak ve 1 L damıtılmış su eklemek 250 g doğranmış yaprakları ve bir kaynatmak için 110 °C ' de 60 dakika için getirmek. aşırı buharlaşma önlemek için alüminyum folyo ile Flask kapak.
- Su özü temsil eden Sıvı fazdan haşlanmış yaprakları ayırmak için 3 mm-huni filtre kağıdı kullanın.
- Sıvı fazı bir 0,22 μm filtre ile filtreleyebilir, bir Beaker içinde toplayın. Parafilm ile kabı kapak ve ekstresi dondurmak-80 °c gece.
- Parafilm bir iğne ile 10-15 delik yapmak ve bir lyophilizer ekstresi lyophilize. Toz elde etmek için birkaç gün sürebilir unutmayın.
- Elde edilen tozu tartın, onu aliquots 'a böler ve gerekli olana kadar 4 °C ' de saklayın. Bir yıl boyunca saklamak mümkündür.
- Deneyler için gerekli olduğunda, bir stok çözüm hazırlamak, standart bir konsantrasyon 50 mg/mL damıtılmış su ile toz seyreltilmesi. Küçük hacimli (örn. 1 mL) farklı bir şekilde ayırın. Bu hazırlık, kullanılıncaya kadar-20 °C ' de depolanabilir ancak moleküllerin oksidasyonları nedeniyle birkaç gün boyunca 4 °C ' de depolanamaz. Dondurmayı ve çözülme kaçının.
2. hücre kültürü
- Endotel hücre büyüme ortamında HUVECs yetiştirmek: endotel bazal orta 1 μg/mL hidrokortizon ve 1 ng/mL epidermal büyüme faktörü,% 10 FBS ve penisilin/Streptomycin 37 °C ' de 5% CO2atmosferinde tamamlayıcı olarak desteklenmektedir.
- Zaman 80% confluent, her geçit 1:3 oranında Hücreleri Böl. Büyüme faktörlerine yanıt olarak belirgin farklar göstermez iki ila beş pasajlar, hücreleri kullanın. Altıncı geçişte sonra, hücreler parlak hale gelir ve jelli Bodrum matrisinde tüpler oluşturmayın.
3. transfeksiyon
- HUVECs% 70 konfluent olduğunda, istenilen gen ile transfekt.
- 100 mm 'lik bir plaka için, kontrol olarak 1 μg boş pCDNA3 vektörü ve ilgi geni (Bu durumda kurucu aktif MEK [caMEK]) içeren 1 μg pCDNA3 vektörü kullanın.
- 3 μL lipofektamin 2.000 ile karmaşık 1 μg DNA, azaltılmış serum orta ile seyreltilmiş (bkz. malzeme tablosu) 200 μL son hacmine. orta hücrelerden çıkarın ve 1 ml taze komple orta ile değiştirin; ardından, transfendirme çözümünü hücrelere ekleyin. 37 °C ' de,% 5 CO2ile kuluçinörün hücrelerine inkübe edilir. Ayrıca, üreticinin talimatlarını takiben, lipofektamin 2.000 farklı diğer transfeksiyon ajanlar kullanmak mümkündür.
- Transfeksiyondan sonra 7 mL komple taze orta 3 h ekleyin ve sonra, daha sonra 37 °C ' de hücreler için 24-48 h ile bir sonraki ilerlemeler devam etmeden önce inküye yapın. Transfeksiyon sonrası gün, orta taze komple orta ile değiştirin.
4. tüp oluşumu tahlil
- Serin bir 96-kuyu plaka ve Pipet uçları 4 °C ' de 1 saat boyunca jelli Bodrum hazırlanmadan önce.
- Bodrum hazırlık anda, buz üzerine plaka koymak (0 °C) ve ekleyin 50 her iyi soğuk matris μL eklemek kabarcıklar oluşumundan kaçınarak. Matris oda sıcaklığında katı hale gelen bu yana prosedür sırasında matris içeren şişe buz üzerinde tutulması gerektiğini unutmayın.
- En az 30 dakika için% 5 CO2 Ile 37 °c ' de kuluçvanın plakasını yerleştirin ve bodrumun polimerize edilmesini sağlar.
- Bu arada, hücreleri topla. HUVECs 'i 1 mL 'Lik bir 0,25% Trypsin/0.53 mM EDTA çözeltisi ile yıkayın; sonra, Trypsin-EDTA çözeltisi 2 mL ekleyin ve 5 dakika için 37 °C ' de inküye. hücre katmanının tamamen dağınık olduğunu doğrulamak için ters bir mikroskop altındaki hücreleri Inceleyin. Sonra, hücrelerin askıya alındığı orta toplamak ve 3 dakika için 264 x g santrifüjleme ile ayrılmış hücreleri hasat 1 ml fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) onları resuspend.
- Hücreleri saymak için 0,2 mL PBS 0,5 mL ve 0,3 mL% 0,4 tripan mavi çözeltisi hücre süspansiyonu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, bir BüRkEr odasında hücreleri saymak.
- 2 x 104 hücreli/50 μL konsantrasyonunda tam ortamda hücreleri resuspend. 2 x 104 hücrelerin konsantrasyonunda jelli Bodrum üzerine tohum ve onlara yerleşmek izin.
- Hücrelerin sayısına dikkat edin. Çok fazla veya çok az hücre, jel Bodrum üzerinde doğru şekilde tüpler oluşturmayabilir.
- Artan doz RGWE hazırlayın (0,01, 0,1, ve 1 mg/mL), kültür orta veya rutin (12, 120, ve 300 μg/mL) stok solüsyonu seyreltilmesi, tüm son hacim içinde 50 μL/Well, ve onları ekleyin 50 μL/Well hücre süspansiyonu. Her kuyunda son hacim 100 μL olacaktır. Her deneysel durum için dört ila altı kuyu hazırlayın. Bir kontrol olarak, 1:50 oranında kültür ortamında distile su (araç) seyreltik.
- 37 °C ve 5% CO2 ' de kuluçoradaki hücreleri 6 ila 24 saat arasında değişen bir süre için inkübe etmek.
- 6 ' dan 24 saat tohumdan sonra yayılan bir zaman aralığında hücreleri gözlemlemek, 10X büyütme bir faz kontrast mikroskop kullanarak. HUVECs 6 h içinde tüp benzeri yapıları oluşturmak edebiliyoruz ama 12-18 h sonra daha iyi sonuçlar gözlemlemek mümkündür. her bir kuyu üzerinde tüp benzeri yapıları fotoğraf ve her iyi üç ila beş rasgele alanlara ortalama görüntü.
- Görüntü satın aldıktan sonra, hücreler Bodrum matrisinden ayrılabilir ve tedavinin hücre sayısına etkisini değerlendirmek için sayılır. Her bir kuyu için, orta çıkarın, 24 U/mL konsantrasyonunda dispaz ekleyin ve 1 saat için 37 °C ' de plaka koymak. Sonra, her iyi, hangi hücrelerin askıya alınır ve 3 dk için 264 x g santrifüjleme ile ayrılmış hücreleri hasat orta toplamak 0,2 ml PBS onları resuspend. Hücreleri saymak için 0,2 mL PBS 0,5 mL hücre süspansiyonu ve 0,3 mL% 0,4 tripan mavi çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika sonra, BüRkEr odasındaki hücreleri saymak.
- Tüp oluşumu tahlil sonuçlarını ölçmek için, en az üç tüp katılmak şube noktalarının sayısını saymak mümkündür. Uygun görüntü yazılımını kullanarak, her mikrografadaki her alan için şube noktalarının sayısını saymak ve ortalama ± standart hata (SE) her deneysel koşul için hesaplayın. İstatistiksel önemini değerlendirmek için iki kuyruklu t-testi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rgwe 'nin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için, bir tüp oluşumu tahlili, bir jel Bodrum matrisinde yürütülmüştür. Üzerine yetiştirdiğinizde, HUVECs, uzatılmış görünen ve birbirleriyle bir hücre hücresi ağı oluşturmak için birbirine bağlayan hücrelerden kaynaklanan tüp benzeri yapıları oluşturur (Şekil 2). Şekil 3' te, biz kontrol koşullarına kıyasla rgwe Ile tedavi HUVECs dalları sayısının önemli ölçüde düşük olduğunu göstermektedir. Özellikle, varlığında 0,1 mg/mL ve 1 mg/mL RGWE, şube sayısı tarafından düşük 40% ve 60%, sırasıyla, kontrol koşulu ile karşılaştırıldığında. Rutin RGWE5büyük bileşeni olarak belirtildiği için, BIZ HUVEC tüp oluşumu tahlil üzerindeki etkisini analiz etti. Şekil 4' te gösterildiği gibi, rutin tek başına HUVECs 'in bir hücre hücresi ağı oluşturabilme yeteneğini etkilememektedir. Daha sonra, biz tüp oluşumu RGWE kaynaklı inhibisyonu temel moleküler mekanizmaları araştırmak için tüp oluşumu tahlil kullanılır. MEK/ERK hücre içi sinyalizasyon yolu anjiyojenik süreçlerde önemli bir rol oynar. Camek tarafından transfere edilen huvecs rgwe ile tedavi edildi ve jel Bodrum matrisinde yetiştirilmiş. Şekil 5' te görüldüğü gibi, camek-transfinyal endotel hücrelerinde, rgwe artık tüp oluşumunu inhibe ederken, sahte transfürli hücreler, kontrol olarak kullanıldığında, hala jelli Bodrum matrisinde bir hücre hücresi ağı oluşturur ve rgwe 'ye yanıt verir, böylece gösterir RGWE 'nin angiogenezdeki etkisinin MEK-ERK yolu tarafından aracılık edildiğini belirtir.
Resim 1: Ruta graveolens. Bir Ruta graveolens Shrub. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: HUVECs, jelli bir Bodrum matrisinde tüp benzeri yapılar oluşturur. HUVECs 'in polistiren çanak (sol) ve jelledli Bodrum matrisinde (sağda) kültürlü mikroskopik fotoğrafları. Ölçek çubuğu = 10 μm.
Şekil 3: RGWE HUVECs 'de tüp oluşumunu inhibe eder. (A) rgwe (0, 0,01, 0,1 ve 1,0 mg/ml) ile tedavi edilen bir jelli Bodrum matriks üzerinde kültürlü HUVECs yüksek güçlü mikroskobik fotoğraflar. Ölçek çubuğu 10 μm ' dir. (B) rgwe varlığında HUVEC şube noktasının (koyu gri) yüzdesi (0,01, 0,1, ve 1,0 mg/ml) tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla (0 mg/ml) ve tedavi HUVECs üzerinde tripan mavi dışlama testi (açık gri) (0,01 , 0,1 ve 1 mg/ml) veya değil (0 mg/mL) RGWE ile 24 h. *p < 0,01 vs. kontrol koşulu (0 mg/ml). Sonuçlar üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE olarak ifade edilir. İstatistiksel önem iki kuyruklu t-testi ile elde edildi.
Şekil 4: rutın HUVEC tüp oluşumunu etkilemez. (A) HUVECs 'in yüksek güçlü mikroskobik fotoğrafları, jelli bir Bodrum matrisinde işlenmiş ve tedavi (12, 120, 300 μg/ml) veya (0 μg/ml) ile 24 saat rutin. Ölçek çubuğu 10 μm ' dir. (B) rutin (12, 120 ve 300 μ/ml) artan dozlarda varlığında HUVEC şube noktasının (koyu gri) yüzdesi, kontrol koşullarına (0 μg/ml) ve tedavi edilen HUVECs üzerinde tripan mavi dışlama testine (açık gri) göre (12 , 120 ve 300 μ/mL) ya da değil (0 μg/mL) ile 24 h için rutin. Sonuçlar üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE olarak ifade edilir. İstatistiksel önem iki kuyruklu t-testi ile elde edilmiştir.
Şekil 5: mek yolu, RGWE etkilerini HUVEC tüp oluşumuna aracılık eder. (A) HUVECs 'in yüksek güç mikroskobik fotoğrafları, boş vektörden (sahte transfeksiyon) veya camek ile transfeksiyonlu, jelli Bodrum matrisinde eritilir ve artan dozlarda rgwe (0, 0,01, 0,1 ve 1 mg/ml) ile tedavi edilir. Ölçek çubuğu 10 μm ' dir. (B) huvecs 'deki şube noktalarının sayısının yüzdesi (koyu gri) ve Huvecs 'de camek (açık gri) ile transfürleştirilmiş ve rgwe (0,01, 0,1 ve 1 mg/ml) artan dozlarda ile tedavi (0 mg/mL). *p < 0,01 vs kontrol koşulu; § p < 0,05 vs. hücreler boş vektörden TRANSFERIT ve rgwe aynı miktarda tedavi. Sonuçlar üç bağımsız deneylerin ortalama ± SE olarak ifade edilir. İstatistiksel önem iki kuyruklu t-testi ile elde edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğal bileşikler yüksek kimyasal çeşitlilik ve biyokimyasal özgüllük ile karakterize ve potansiyel olarak terapötik moleküllerin bir kaynağını temsil eder. Burada, biz bitki R. graveolens su özü elde etmek için nasıl göstermek ve bir kolay gerçekleştirmek için tüp oluşumu tahlil önermek, güvenilir, ve nicel yöntemi anjiyojenez ÜZERINDE rgwe etkilerini araştırmak için yararlı. Bu R. graveolens yaprakları kaynatmak için önemlidir 1 h tam su özü elde emin olmak için. Daha az 1 h için kaynatma tüm moleküllerin çıkarılması için izin vermedi, ve özü beklenen biyolojik etkisi uygulamak olamazdı.
Tüp oluşumu tahlil yeni kan damarlarının oluşumuna yol birkaç adımda temel moleküler mekanizmaları incelemek için bir in vitro test temsil eder. Bu tahlil, araştırmacılar angiogenesis modüle edilebilir bileşikleri belirlemek için izin verir, yanı sıra proteinler ve sinyalizasyon Cascades dahil. Dahası, bu tahlil, aynı zamanda, endotel hücre proliferasyonu, yapışma, göç, ve proteaz aktivite, kan damarının oluşumunda tüm önemli mekanizmalar etkileyebilecek maddeleri test etmek için araştırmacılar sağlar. Test sadece bu tür kullanarak, biz rgwe göstermek, ama onun ana bileşeni rutin, huvecs yeteneği hücre canlılığı etkilemeden tüp benzeri yapıları oluşturmak için azaltabilir ve bu etkisi mek-erk yolu aktivasyon bağlıdır. Ancak, doğru sayıda hücre ile test gerçekleştirmek önemlidir. Aslında, çok az veya çok fazla hücre tüplerin doğru oluşumuna izin veremedi. Bu nedenle, doğru sayıda hücre bulmak için bir ön test gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Dahası, hücre pasajları sayısı, doğru tüp oluşumu tahlil elde etmek için, bu yana hücre numarası kadar önemlidir, hücreler iki kez beş kez paslanmış olması gerekir. Geçiş 6 ' dan sonra, doğru tüp oluşumunu zarar verebilir yaşlanma mekanizmaları ortaya çıkar.
Tüp oluşumu assay çok tekrarlanabilir bir tahlil olduğunu ve endotel hücrelerin fizyolojisi üzerinde ışık tutuyor, tüp oluşumu üç boyutlu çalışma için altın standart olmasa bile8,9,10, 11' den itibaren. Üç boyutlu kollajen ve fibrin modelleri vasküler tubulogenesis, sprouting ve endotel hücreli-periksit etkileşimi araştırmaları için daha iyi olduğu gösterilmiştir. Ancak, jel Bodrum matris üzerinde tüp oluşumu tahlil ile karşılaştırıldığında, bu testler daha fazla zaman ve para tüketen11, ilk iyi bir test daha fazla odaklı vivo çalışmalar için temel olabilir ön sonuçlar elde etmek olduğunu düşündürmektedir. Son olarak, tüp oluşumu tahlil 24 saat içinde yapılabilir, çünkü dönüştürülmüş olmayan huvecs 6 h12,13içinde tüp benzeri yapıları oluşturabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu iş Fondi di Ateneo tarafından Luca Colucci-d 'Amato ve VALERE program fonları tarafından Maria Teresa Gentile ve AıSC Fund IG18999 Maurizio Bifulco 'ya finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
