Summary
توضح هذه المخطوطة توليف أنبوب نانوي واحد-الجدار الكربون (سوكنت)-مترافق MALAT1 جابمير العقاقير الحمض النووي اليغنوكليوتيد (سوكنت-ضد-MALAT1)، مما يدل على إيصال موثوقة سوكنت وقوية التأثير العلاجي ل مكافحة--MALAT1 في المختبر والمجراه. الأساليب المستخدمة للتوليف، والتعديل، والتصريف، وشرح لحقن سوكنت-مكافحة--MALAT1.
Abstract
أنبوب نانوي واحد-الجدار الكربون (سوكنت) هو نوع جديد من نانوحبيبات، التي كانت تستخدم لتقديم أنواع متعددة من المخدرات داخل الخلايا، مثل البروتينات والنوكليوتيد والعقاقير الاصطناعية جزيء صغير. سوكنت أبعادا قابلة للتخصيص، مساحة سطحية كبيرة، ويمكن ربط مرونة مع المخدرات من خلال تعديلات مختلفة على سطحه؛ ولذلك، نظام مثالي لنقل الأدوية إلى خلايا. الكشف فضله منذ فترة طويلة (لنكرناس) مجموعة من الجيش الملكي النيبالي فضله أطول من 200 nt, التي لا يمكن ترجمتها إلى البروتين ولكنها تلعب دوراً هاما في العمليات البيولوجية والفيزيولوجية المرضية. الرئة المرتبطة بورم خبيث غدية نسخة 1 (MALAT1) لنكرنا عالية مصانة. وثبت أن مستويات أعلى من MALAT1 المرتبطة بسوء التشخيص لأنواع السرطان المختلفة، بما في ذلك الورم النخاعي المتعدد (مم). ونحن قد كشفت عن أن ينظم MALAT1 الموت خلية وإصلاح الحمض النووي في مم؛ وهكذا، يمكن اعتبار MALAT1 كهدف علاجي ملم. ومع ذلك، الكفاءة في تقديم اليغو العقاقير لتمنع/ضربة قاضية MALAT1 الحية في ما زال مشكلة. في هذه الدراسة، نحن تعديل سوكنت مع الوتد-2000 ومترافق اليغو MALAT1 المضادة لأنه اختبار إنجاز هذا المركب في المختبر، حقن الوريد مع نموذج ماوس مم نشرها والتقيد تثبيط كبيرة لتطور مم، مما يشير إلى أن سوكنت مكوكية تسليم مثالي لمكافحة MALAT1 جابمير الحمض النووي.
Introduction
سوكنت هو نانوماتيريال رواية التي يمكنها توفير أنواع مختلفة من المخدرات، مثل البروتينات، والجزيئات الصغيرة، والأحماض النووية، ستابلي وكفاءة مع قابلية التحمل مثالية وسمية الحد الأدنى في المختبر1 و المجراة في2. سوكنت فونكتيوناليزيد كبيرة ذات قابلية الذوبان في توافق مع الحياة والمياه ويمكن استخدامها مكوك لجزيئات أصغر، ويمكن حملها على اختراق غشاء الخلية3،،من45.
لنكرناس مجموعة من الحمض النووي الريبي (> 200 nt) التي يتم نسخها من الجينوم مرناً ولكن لا يمكن ترجمتها إلى بروتينات. تزايد الأدلة أظهرت أن لنكرناس المشاركة في تنظيم التعبير الجيني6 ويشاركون في البدء والتقدم لمعظم أنواع السرطان، بما في ذلك مم7،8،9. MALAT1 نسخة فضله التخصيب النووي 2 (NEAT2) و حفظت عاليا لنكرنا10. MALAT1 معترف بها في البداية في المنتشر الخلية الصغيرة غير الرئة السرطان (NSCLC)11، ولكن قد تم overexpressed في عدة أورام5،،من1213؛ هو واحد من لنكرناس أعرب عن أشد ويرتبط مع سوء تشخيص في مم8،14. مستوى التعبير MALAT1 أعلى بكثير في دورة فادح extramedullary مم المرضى مقارنة بتلك التي شخصت فقط ملم15.
في دراسة سابقة، وقد أكدنا أن أوليجوس MALAT1 مكافحة قوة تؤدي إلى تلف الحمض النووي والمبرمج في مم16 باستخدام الحمض النووي جابمير النوكليوتيد العقاقير تستهدف MALAT1 (مكافحة-MALAT1) في الخلايا ملم. الحمض النووي جابمير تتألف من الحمض النووي العقاقير وربط 2 '--OMe-الكشف، الذي يمكن أن يدفع الانقسام MALAT1 ب النشاط مرة ملزمة"رناسي ح"17. لا تزال حدود كفاءة المجراة في تسليم العقاقير أوليجوس في الاستخدام السريري.
لاختبار أداء فونكتيوناليزيد أثر سوكنت لمكافحة MALAT1 جابمير أوليجوس، جابمير MALAT1 المضادة هو مترافق الحمض النووي إلى دسبي-PEG2000-أمين سوكنت. ثم يتم حقن سوكنت-ضد-MALAT1 عن طريق الوريد في نموذج نشر ماوس مم؛ ويلاحظ تثبيط ملفتة للنظر بعد أربعة علاجات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات قبل IACUC عيادة كليفلاند (رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة).
1-تجميع سوكنتس فونكتيوناليزيد
- ميكس 1 ملغ من سوكنتس و 5 ملغ من دسب-PEG2000-أمين و 5 مل من الماء المعقم نوكلاس خالية في قنينة زجاج التﻷلؤ (20 مل). اهتز جيدا لحل جميع المواد الكاشفة تماما.
- Sonicate القنينة في سونيكاتور حمام مياه على مستوى سلطة من 40 ث عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT، 20 دقيقة × 3، تغيير الماء كل 20 دقيقة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة). ثم الطرد المركزي أنه في 24,000 س ز ح 6 وجمع الحل طافية. ويمكن تخزين هذا الحل سوكنت الوظيفية عند 4 درجة مئوية لمدة شهرين.
- أضف 1 مل من محلول سوكنت من الخطوة 1، 2 إلى جهاز الطرد مركزي تصفية موكو كاتشين 100، تليها 4 مل الماء المعقم نوكلاس مجاناً. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 4,000 س ز على RT لإزالة الزائدة دسب-PEG2000-أمين. كرر إضافة 4 مل من الماء والطرد المركزي 5 x. سوف يترك أكثر من 0.5 مل من بقايا سوكنت الحل في عامل التصفية بعد كل استخدام الطرد المركزي.
- قياس تركيز الحل سوكنت بقايا في عامل التصفية باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية/VIS في 808 نانومتر بعد الغسيل النهائي. عادة ما يكون التركيز النهائي حوالي 50 مغ/لتر (المحسوب وفقا لطريقة وضعها كام et al.18).
ملاحظة: ضمان أن SWCNTs دسب-شماعة-فونكتيوناليزيد هي للذوبان في الماء بعد الخطوة 1، 4 ومستقرة في مختلف الحلول البيولوجية دون تجميع مرئية بعد بضعة أسابيع.
2- تصريف MALAT1 مكافحة جابمير الحمض النووي يحف به 2 '-O الكشف المعدلة إلى سوكنت فونكتيوناليزيد
- إضافة 0.5 ملغ من سالفو-LC-سبدب إلى 450 ميليلتر من دسب-PEG2000-أمين فونكتيوناليزيد سوكنت. إضافة 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 10 وثم احتضانها ح 2 في الرايت
- لإزالة الزائدة سالفو-LC-سبدب، إضافة رد فعل من الخطوة 2، 1 إلى جهاز الطرد مركزي تصفية موكو كاتشين 100، تليها 4 مل مياه خالية من نوكلاس. الطرد المركزي ل 10 دقيقة في س 4,000 ز في تكرار الرايت إضافة 4 مل من الماء والطرد المركزي 5 س.
- إضافة 200 نانومتر تعديل ثيول المضادة-MALAT1-Cy3 جابمير الحمض النووي إلى 1.5 مل حل القيمة التجارية، واحتضان لمدة 90 دقيقة في نق الرايت المنتج مع عمود 5 برنامج العمل الوطني، أثر البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. الوت مكافحة--MALAT1--Cy3 مع 500 ميكروليتر معقمة خالية من نوكلاس 1 × برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: ويمكن تخزين سوكنت فونكتيوناليزيد مع القيمة المضافة، التي قد تنشق سندات ثنائي كبريتيد شكلت أثناء تخزين جابمير MALAT1 مكافحة ثيولاتيد الحمض النووي. يمكن إزالة القيمة المضافة حسب العمود 5 مرشحيه قبل الاقتران مع سوكنت. - جمع الحل دسبي-PEG2000-أمين سوكنت سولفو-LC-سبدب-تعامل اليسار في عامل التصفية، وتمييع مع 500 ميليلتر من حل مكافحة--MALAT1-Cy3. ثم احتضان أنه في 4 درجات مئوية عن 24 ساعة. ويمكن تخزين MALAT1 سوكنت المضادة مترافق عند 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. عقب الإجراء نفسه، يمكن توليفها سوكنت مترافق مع التدافع اليغو العقاقير واستخدامها كعنصر تحكم سوكنت.
3-الذيل حقن الوريد من سوكنت--مكافحة--MALAT1
-
إنشاء نموذج نشر ماوس ملم.
- لتحقيق أفضل النتائج للمقارنة، ترتيب عشوائي إيماءة 14. CB17-بركدكسسيد/ي الفئران (8 أسابيع) في مجموعات المحاكمة أو عنصر تحكم (سبعة في كل مجموعة) مع نفس نسبة الذكور والإناث.
- مقاعد البدلاء عملية تنظيف وتعقيم أنه مع الكحول 70%.
- استخدام مصباح تدفئة الحارة الماوس لتساعد في ذيل الوريد لتظهر. كبح جماح الماوس بشكل صحيح مع ريسترينير حقن ذيل.
- حقن الخلايا 5 × 106 MM.1S-لوك-مشري في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الوريد الذيل دون تخدير. اضغط مكان الحقن بمسحه الكحول لمارك س. 30 الماوس حقن وإعادته إلى قفص نظيفة.
-
يبدأ العلاج في اليوم السابع بعد حقن الخلايا MM.1S.
- حقن 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على MALAT1-سوكنت-مكافحة الوريد ذيل الماوس. استخدم برنامج تلفزيوني يحتوي على سوكنت-عنصر التحكم كعنصر تحكم.
- اضغط على مكان الحقن بمسحه الكحول لمدة 30 ثانية.
- مراقبة النزيف المحلية في الذيل والسلوك العام للماوس لمدة 1 دقيقة، وثم إعادته إلى قفص نظيف. مراقبة جميع حقن الفئران مرة أخرى قبل العودة القفص على الرف، للتأكد من أن يتم التسامح مع الحقن جيدا.
-
تكرار الحقن كل 7 أيام حتى انتهاء التجربة.
- إنهاء هذه التجربة عندما يتحلل الصحة العامة للماوس: عند عدم الأكل أو الشرب، مظهر شاحب آثار أقدام، أي نزيف تحت الجلد، ضيق في التنفس، انخفاض النشاط، شل السفلية، و/أو كتلة ملموس في ويلاحظ البطن.
4-تقييم تطور المرض
- تقييم الحالة العامة للفئران كل يوم بعد حقن الخلايا MM.1S-لوك-مشري. إيلاء اهتمام خاص إذا وضع الفئران يشل أطرافهم السفلي.
-
تقييم نمو الورم باستخدام نظام تصوير المجراة في 1 × أسبوع قبل الحقن سوكنت-مكافحة--MALAT1.
- إعداد جديدة 15 ملغ/مل د-لوسيفرين مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- تخدير الفئران مع isoflurane المبخر (3-5% لتحريض و 1 – 3% للصيانة، تبعاً لحالة الفئران).
- ضخ 150 مغ/كغ لوسيفرين د في كل الماوس إينترابيريتونيلي، 5 دقيقة قبل التصوير؛ ثم، صورة الفئران في موقف معرضة مع طيف نظام التصوير.
- جمع صور متسلسلة من الفئران كل 2 دقيقة، حتى يتم التوصل إلى تشبع التﻷلؤ. قم بضبط الوقت الفاصل الزمني وفقا للامتصاص د-لوسيفرين/الإشارة.
- استخدام CO2 التضحية الفئران حالما يتم التوصل إلى إنهاء هذه التجربة.
-
أن هذا نموذج نشر مم، عملية الفئران كما يلي.
- وزن الماوس قبل التشريح.
- جمع الدم من القلب لفحص تعداد الدم الكامل (CBC) يقوم بها جهاز عداد خلايا الدم. التهم من خلايا الدم البيضاء وخلايا الدم الحمراء، وكذلك نسبة الخلايا الليمفاوية، هي المؤشرات الأولية.
- عزل الطحال وتزن عليه. حساب نسبة وزن الطحال/الجسم؛ تنظر > 0.5% كتوسيع الطحال.
- جمع أنسجة نخاع العظم والطحال، والعقدة الليمفاوية والكلى والأنسجة مع ورم خبيث مرئية.
- جمع العمود الفقري إذا كان الماوس المتقدمة شلل من السفلية.
- استخراج البروتين والحمض النووي الريبي من عينات نخاع العظام.
- إصلاح جميع الأنسجة المتبقية في الفورمالين.
- ديكالسيفيكيشن، تزج عينات العظام في 0.25 م يدتا الحل (pH 8.0) لمدة 5 أيام بعد 24 ساعة تثبيت.
- تزج جميع العينات في الكحول 75% للتخزين على المدى الطويل.
- قارن قوة الإشارة من لوسيفراس في نفس الوقت النقاط في المجموعتين. من كلا الفريقين، سجل تواريخ تضحية كل الماوس وحساب منحنيات البقاء على قيد الحياة من الفريقين مع البرمجيات.
ملاحظة: ويرد في الشكل 1جميع الإجراءات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإظهار تأثير تثبيط المضادة-MALAT1 جابمير الحمض النووي في مم، نحن ترسيتها على التعبير عن MALAT1 واستخدمه في الخلايا H929 و MM.1S. ثمان وأربعين ساعة في وقت لاحق، تم جمع الخلايا لتحليل كفاءة تدق لأسفل ووضع المبرمج في الخلايا transfected مع المضادة-MALAT1 جابمير أو مراقبة الحمض النووي. وأظهرت أن الحمض النووي جابمير مكافحة MALAT1 ترسيتها عن التعبير MALAT1 في خلايا H929 و MM.1S كفاءة نتائج qRT PCR (الشكل 2أ). تم تحديد مركز المبرمج بالتدفق الخلوي، التي كشفت MALAT1 أسفل ينظم الناجمين عن المبرمج إلى حد كبير (الشكل 2ب).
تشير هذه النتائج إلى أن أوليجوس MALAT1 المضادة تمنع ملم فعلياً في المختبر. ومع ذلك، تقديم كفاءة أسلوب/مكوكية لمكافحة MALAT1 أوليجوس المجراة في الحاجة إلى وضع، الذي هو أيضا عقبة أوليجوس العقاقير في التطبيق السريري؛ ومن ثم لدينا مصلحة في سوكنت. سوكنت هو نانوماتيريال رواية لإيصال الأدوية، التي يمكن أن تتطور هيدروفيليسيتي وديسولوبيليتي بعد إدخال التعديلات المناسبة عليه؛ ولذلك، فإنه نقل البضائع في أشكال مختلفة، مثل المخدرات اليغنوكليوتيد. للتحقق من كفاءة سوكنت المجراة في التسليم، ونحن أولاً فونكتيوناليزيد سوكنت مع دسب-PEG2000-الأمينات، التي وهبت خصوصية hydrophilicity والملزم ل سوكنت19. ثم، عولج هذا سوكنت الوظيفية مع سالفو-LC-سبدب لإنشاء مجموعات سلفهيدريل الحرة، التي سيتم استخدامها للاتصال مع اليغو. إلى متزاوجة اليغو مكافحة--MALAT1 وسوكنت سولفو-LC-سبدب-معاملة، تم تعديل نهايات 5 ' اليغو مكافحة MALAT1 مع جماعات ثيول (S-S)؛ لتعقب التسليم واضح، تعديل نهايات 3 ' اليغو مكافحة MALAT1 مع سينين 3 (Cy3). بعد جميع الخطوات التوليف، تم الحصول على سوكنت--مكافحة--MALAT1-Cy3 (الشكل 1)12. ثم إضافته إلى متوسط الثقافة من الخلايا H929-التجارة والنقل والتجارة والنقل MM.1S--للتحقق من كفاءة التسليم.
كما هو مبين في الشكل 2ج، سوكنت-مكافحة--MALAT1--Cy3 كفاءة تم تسليمها إلى نواة لخلايا ملم وقمعها إلى حد كبير على مستوى MALAT1 الذاتية في خلايا H929 و MM.1S (الشكل 2د). دراسة سمية وسلامة سوكنت في الخلايا الطبيعية، تمت إضافة سوكنت-مكافحة--MALAT1--Cy3 في الأجل المتوسط من بميك-1 الخلايا بتركيزات مختلفة؛ وكان ليبوفيكتاميني مراقبة العلاج؛ المتوسط العادي كعنصر أساسي (الشكل 2ه). بعد ذلك، تم اكتشاف بقاء الخلية استخدام عدة فحص صلاحية خلية في يوم 1، 2، واليوم 3. تم العثور على لا يوجد فرق كبير في تثبيط بقاء الخلية بين سوكنت--مكافحة--MALAT1-Cy3 ومراقبة العلاج في جرعات مختلفة والنقاط الزمنية. وكان هناك أي فرق مقارنة بالمتوسط العادي (NC) أما، مما يشير إلى أن سمية سوكنت-مكافحة--MALAT1--Cy3 مماثلة لمراقبة العلاج، الذي قد سمية محدودة ومقبولة للخلايا الطبيعية في جرعات عالية.
بعد ذلك، أنشئ نموذج الإنسان ملم تنشر ماوس لتقييم آثار العلاج MALAT1-سوكنت-مكافحة المجراة. أولاً، تم حقن كل الماوس مشمولان-بيج (من 8 أسابيع من العمر) مع 5 × 106 MM.1S-لوك-مشري الخلايا عن طريق الوريد (الشكل 3). تم حقن مجموعة فئران 14 مع الخلايا MM.1S؛ فيما بينها، تم ترتيب الفئران سبعة عشوائياً إلى مجموعة معاملة سوكنت-مكافحة--MALAT1-Cy3، وسبعة آخرين في السيطرة على المجموعة. MALAT1-سوكنت-مكافحة ومراقبة سوكنت أوليجوس تم حله في 0.5 مل من 1 x PBS وحقن عن طريق الأوردة الذيل 7 أيام بعد حقن الخلايا السرطانية. وتكرر المعاملة سوكنت-مكافحة--MALAT1--Cy3 كل 7 أيام حتى انتهاء التجربة. لتقييم عبء الورم، لاحظ الإشارة لوسيفرين المجراة في تصوير نظام (إيفيس) 30 دقيقة بعد حقن لوسيفرين 1 × أسبوع قبل الحقن سوكنت-اليغو. ووجدنا أن الإشارات لوسيفرين من الفئران في المجموعة المعالجة سوكنت-مكافحة--MALAT1 كانت ملحوظة أقل مقارنة مع تلك المجموعة المعالجة سوكنت لمراقبة بعد 21 يوما علاج (من يوم 28). وضعهم الصحي والبقاء على قيد الحياة تم إيداع وتسجيل كل يوم وأوجزت في منحنى كابلان-ماير. من هذه النتائج، خلصنا إلى أن العلاج سوكنت-ضد-MALAT1 عن طريق الحقن الوريدي يمكن أن يحقق أوليجوس MALAT1 المضادة للخلايا السرطانية فعلياً. نحن، ثم، محدودة عبء الورم وتمديد إعمار للفئران (p = 0.04) كما هو متوقع، وهي مماثلة للنتائج في المختبر. أننا لم نجد أي آثار جانبية هامة من العلاج في الفئران خلال فترة التجربة كلها، الذي أشار إلى أن حقن سوكنت-ضد-MALAT1 لعلاج آمنة للفئران؛ ولذلك، سوكنت نظام التسليم المجراة في آمنة وموثوق بها لمكافحة MALAT1.
الشكل 1 : رسم تخطيطي للتوليف، الاستيعاب، و المجراة في الانفصال من اليغو جابمير سوكنت-مكافحة--MALAT1-Cy3- سوكنت (A) وكان فونكتيوناليزيد مع دسب-PEG2000-الأمينات، وفي وقت لاحق، مترافق مع مكافحة--MALAT1--Cy3 عن طريق الربط ثنائي كبريتيد توسط سالفو-LC-سبدب. (ب) سوكنت مترافق مكافحة--MALAT1 تم حقن ماوس مع MM.1S-لوك-مشري الخلايا عن طريق الوريد الذيل. (ج) مترافق سوكنت مكافحة MALAT1 تخترق غشاء فسفوليبيد بلير من خلال الإدراج أو الالتقام. (د) MALAT1--سوكنت--مكافحة تم تعبئتها داخل اندوسوميس المبكر بعد امتصاص الخلايا؛ ثم دخلول المبكر من النضج دخلول الراحل واندمجت مع يحلول تشكل اندوليسوسومي. اندوليسوسومي يساعد على إطلاق مكافحة--MALAT1 من سوكنت كسر السندات ثنائي كبريتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : MALAT1-سوكنت-مكافحة تم إيصالها بكفاءة مع الحد الأدنى من السمية والتي يسببها المبرمج في خطوط الخلايا مم- اليغو جابمير سوكنت-مكافحة--MALAT1 أو سوكنت لمراقبة اليغو تم transfected من ليبوفيكتاميني إلى خلايا H929 و MM.1S، على التوالي. ثمان وأربعين ساعة في وقت لاحق، ونحن تجمعها الخلايا (أ) تحليل التعبير MALAT1 بكر قرة والتحليل المبرمج (ب) التدفق الخلوي. (ج) H929-التجارة والنقل والتجارة والنقل MM.1S الزنزانات مثقف يشترك مع سوكنت--مكافحة--MALAT1-Cy3 لمدة 48 ساعة؛ كان تحديد فعالية التسليم مجهر الأسفار (أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر). (د) ofMALAT1 مستوى التعبير تم الكشف عن طريق قرة-بكر، التي تبين أنها طرقت بنجاح إلى أسفل في الخلايا H929 و MM.1S (* * ف < 0.01، * * * ف < 0.001). (ه) سوكنت ومراقبة معاملة أضيفت إلى مستنبت خلايا بميك-1 في جرعات مختلفة. وتم قياس الانتشار استخدام عدة فحص سلامة خلية. وقد تم تعديل هذا الرقم من هو جين تاو et al.16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : MALAT1-سوكنت-مكافحة قمعت الورم النخاعي المتنامية في نموذج نشر الماوس مم MM.1S-خلية-شيدت. تم حقن الخلايا 5 × 106 MM.1S-لوك-متشيري (A) عن طريق الوريد لعروق ذيل الفئران مشمولان البيج المشع (سبعة في كل مجموعة)؛ تم حقن 50 ميكروليتر سوكنت-مكافحة--MALAT1 أو حل سوكنت لمراقبة كل 7 أيام عن طريق الوريد الذيل من اليوم السابع بعد حقن الخلايا MM.1S. واستخدمت إيفيس لرصد نمو الورم. العبء الشلل والورم أطرافهم هند (ب) استخدمت كنقاط النهاية، وتم تحليل بيانات البقاء على قيد الحياة بتحليل كابلان-ماير. وقد تم تعديل هذا الرقم من هو جين تاو et al.16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتبين الأدلة أن لنكرناس المشاركة في تنظيم العديد من إجراءات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية في حالات السرطان، بما في ذلك مم7،،من89؛ لديهم القدرة على أن تكون هدفا لعلاج السرطان، التي يمكن أن تتحقق بالعقاقير النوكليوتيد20،،من2122. وافق العديد من العقاقير اليغنوكليوتيد العقاقير، بما في ذلك فوميفيرسين للفيروس المضخم للخلايا التهاب الشبكية23، ميبوميرسين متماثل الكوليستيرول الأسرية24، نوسينيرسين "الولايات المتحدة للأغذية" والدواء (FDA) ضمور العضلات الشوكي25، واتيبليرسين ل ضمور العضلات دوشين26. في هذه الدراسة، علينا تعديل جابمير MALAT1 مكافحة الحمض النووي مع 2 '--OMe-الجيش الملكي النيبالي ومترافق أنه مع سوكنت الوظيفية. سوكنت يحمل ويسلم أوليجوس MALAT1 المضادة مكوك، الذي ليس فقط تحسين تقارب اليغو-الهدف بسبب مرونته وتحميل متعددة ولكن أيضا استقرت أوليجوس وساعدت في منع تدهور نوكلاس أثناء الولادة27 .
يمكن أن يساعد تعديل مناسب على السطح سوكنتس من الحصول على تشتت موثوق بها في البيئات المائية ذات الصلة فسيولوجيا والنهوض بهم28،بيوديستريبوشن29. كنا دسب-PEG2000-أمين لتعديل سوكنت، الذي أظهر graft في سوكنت وتحسين قابلية الذوبان مائي لذلك، وعلاوة على ذلك، أظهرت استقرار ممتازة دون التكتل في الوسائط البيولوجية30. استخدمت سالفو-LC-سبدب كروسلينكير في التجربة، مما ساعد على سوكنت فونكتيوناليزيد ربط مكافحة MALAT1 جابمير الحمض النووي من خلال الربط ثنائي كبريتيد، وتسليمها بعد ذلك إلى خلايا. عندما توغلوا سوكنت في خلايا مم، أنها اتخذت اندوسوميس المبكر (الرقم الهيدروجيني ~ 6.0)، التي نضجت ثم إلى أواخر اندوسوميس (الرقم الهيدروجيني ~ 5.0) مصحوبا انخفاض درجة حموضة قيمة31. ميزة الارتباط الوتد أن الترابط مستقر في درجة الحموضة > 6، بل تصل إلى 75 – 95% المخدرات المرتبطة بشماعة أطلق سراحه في غضون 2 ساعة مرة واحدة درجة الحموضة أصبح أقل من 5.532،،من3334. اندوسوميس تحمل سوكنت-ضد-MALAT1 اندمجت مع ليسوسوميس (~ 4.5 درجة الحموضة) تشكل اندوليسوسومي، ومن ثم ثنائي كبريتيد السندات كانت تحفزها ثيول الليزوزومية ريدكتيز، التي تم تفعيلها على الوجه الأمثل في درجة حموضة منخفضة35. وهذا، أفرج عنهم بعد ذلك، مكافحة الحرة--MALAT1 جابمير الحمض النووي. وفقا لنتائج التجربة في المختبر وفي الحية، سوكنت تسليم MALAT1-سوكنت-مكافحة فعالة، وساعدت في التصرف على نحو مماثل في مهمة لمكافحة--MALAT1 في المختبر.
تمرير سوكنتس فونكتيوناليزيد عن طريق بلير فسفوليبيد عبر نمطين: الإدراج36،37 والالتقام38،39. تساعد هذه الإجراءات سوكنت تسليم الشحنات إلى الخلايا دون مقاطعة تثبيت أغشية الخلية، وبالتالي تخفيض سمية سوكنت. نحن حقن 50 ميليلتر من سوكنت--مكافحة--MALAT1 (~ 40 مغ/لتر) في كل الماوس (~ 20 ز)؛ وهكذا، كان تركيز المخدرات النهائي 0.1 مغ/كغ، وأقل بكثير من الجرعة ونحن المستخدمة في التجارب السمية (2 مغ/لتر و 4 مغ/لتر). السابقة أظهرت النتائج، سوكنت له تأثير مشابه كمعاملة عنصر التحكم (على سبيل المثال، ليبوفيكتاميني) في نمو الخلايا والبقاء في مطابقة جرعات. مراقبة العلاج كاشف مشترك للخلية تعداء ويعتقد أن لها سمية محدودة ومقبولة للخلايا؛ وبالتالي، نحن نعتقد سوكنت له فقط سمية الحد أدنى للخلايا الطبيعية.
مكوك للعقاقير النوكليوتيد، الأيض اعتبار هام آخر للسلامة من سوكنت. وقد ثبت أن سوكنت فونكتيوناليزيد يفرز أساسا عن طريق الكلي، دون السمية الكبيبي وانبوبي40. أننا لم نجد الكلي الأعراض المتصلة بالضعف، مثل قلة البول، زرام، وذمة، وتغيير المظهر الكلي، إلخ، في الفئران التي قبلت حقن سوكنت. وهكذا، قد سوكنتس أي آثار سمية بسبب أي تراكم غير طبيعي في ماوس مع وظيفة الكلي طبيعية.
نحن الأول من متزاوجة النوكليوتيد الشعور المضادة استهداف لنكرنا مع سوكنت فونكتيوناليزيد واستخدامه لعلاج ملم. سوكنت هو نوع من نانوماتيريال الرواية، الذي يضم شرليتي متسقة وقطرها اختياري، وتوزيع طول. بعد العلاج الروغان، SWCNTs تطوير قابلية الذوبان في الماء، وتوافق مع الحياة وتصبح مكوكية بيولوجية مثالية لتسليم بضائع عديدة عبر غشاء الخلية، وبالتالي زيادة توزيع المخدرات وتعزيز أثر المعالجة. وبالإضافة إلى ذلك، سوكنت قد استقرار الجزيئات اليغنوكليوتيد الشعور المضادة من الهضم نوكلاس1. كما تظهر النتائج، فونكتيوناليزيد سوكنت-ضد-MALAT1 سلمت MALAT1 داخل الخلايا مم كفاءة ويعوق مم نمو هائلة في خطوط الخلايا في المختبر وفي نموذج ماوس تنشر في الحية. حتى الآن، ونحن لم تلاحظ أي سمية بسبب المعاملة سوكنت في هذه التجارب. وتوضح هذه الدراسة أن سوكنت هو وسيلة الولادة المأمونة والفعالة للمخدرات اليغنوكليوتيد العقاقير، ولديه القدرة على استخدامها كناقل لجزيئات علاجية في المرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون بمعهد أبحاث ليرنر البروتين، الجينوم، وأساسيات التصوير لما قدمته من المساعدة ودعم. التمويل: كان يؤيد هذا العمل ماليا بالمعاهد الوطنية للصحة/NCI منحة R00 CA172292 (J.J.Z.) وأموال بدء التشغيل (ل J.J.Z.) والسريرية ومتعدية العلوم التعاونية (كتس) قضية Western Reserve جامعة الأساسية استخدام الطيار غرانت (إلى J.J.Z.). هذا العمل استخدام المجهر SP8 إيكا [كنفوكل] التي تم شراؤها بتمويل من "المعاهد الوطنية للصحة سيج" المنح 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
