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Cancer Research

सिंगल वॉल कार्बन नैनोट्यूब (SWCNT) द्वारा Vivo में मल्टीपल मायलोमा सेल ग्रोथ का दमन-डिलीवर MALAT1 Antisense ओलिगोस्पर्मिया

Published: December 13, 2018 doi: 10.3791/58598
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Cancer Biology, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Medical Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि एक एकल दीवार कार्बन नैनोट्यूब (SWCNT) के संश्लेषण का वर्णन-संयुग्मित MALAT1 antisense gapmer डीएनए oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), जो SWCNT के विश्वसनीय वितरण और शक्तिशाली उपचारात्मक प्रभाव को दर्शाता है एंटी MALAT1 इन विट्रो में और vivo में. संश्लेषण, संशोधन, विकार, और SWCNT-विरोधी MALAT1 के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन कर रहे हैं ।

Abstract

सिंगल वॉल कार्बन नैनोट्यूब (SWCNT) एक नए प्रकार की nanoparticle है, जिसे कोशिकाओं में कई तरह की दवाओं को डिलीवर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जैसे प्रोटीन, oligonucleotides, और सिंथेटिक छोटे-अणु ड्रग्स । SWCNT अनुकूलन आयामों, एक बड़े सतही क्षेत्र है, और flexibly अपनी सतह पर विभिंन संशोधनों के माध्यम से दवाओं के साथ बांध कर सकते हैं; इसलिए, यह कोशिकाओं में दवाओं के परिवहन के लिए एक आदर्श प्रणाली है । लंबे समय से कोडिंग RNAs (lncRNAs) के एक क्लस्टर कर रहे है decoding आरएनए से अधिक २०० nt, जो प्रोटीन के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता है लेकिन जैविक और pathophysiological प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । मेटास्टेसिस-एसोसिएटेड फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता प्रतिलिपि 1 (MALAT1) एक उच्च संरक्षित lncRNA है । यह प्रदर्शन किया गया था कि उच्च MALAT1 स्तर विभिन्न कैंसर के गरीब रोग का निदान करने के लिए संबंधित हैं, सहित कई मायलोमा (मिमी). हमें पता चला है कि MALAT1 डीएनए की मरंमत और मिमी में कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करता है; इस प्रकार, MALAT1 मिमी के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में माना जा सकता है । हालांकि, antisense oligo के कुशल प्रसव को रोकना/पछाड़ना MALAT1 vivo में अभी भी एक समस्या है । इस अध्ययन में, हम खूंटी-२००० के साथ SWCNT को संशोधित करने और इसे करने के लिए एक विरोधी MALAT1 oligo संयुग्मी, इन विट्रो में इस परिसर के वितरण का परीक्षण, यह नसों में एक प्रसार मिमी माउस मॉडल में सुई, और मिमी प्रगति का एक महत्वपूर्ण अवरोध का पालन, जो इंगित करता है कि SWCNT विरोधी MALAT1 gapmer डीएनए के लिए एक आदर्श प्रसव शटल है ।

Introduction

SWCNT एक उपंयास nanomaterial है कि दवाओं के विभिंन प्रकार के, जैसे प्रोटीन, छोटे अणुओं, और न्यूक्लिक एसिड के रूप में वितरित कर सकते हैं, छुरा और कुशलतापूर्वक आदर्श सहनशीलता और ंयूनतम विषाक्तता के साथ इन विट्रो में1 और vivo2में । एक कार्यात्मक SWCNT महान है असंगति और पानी घुलनशीलता, छोटे अणुओं के लिए एक शटल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और उंहें ले जा सकते है करने के लिए सेल झिल्ली3,4,5घुसना ।

lncRNAs आरएनए के एक क्लस्टर (> 200 nt) कि जीनोम से mRNA के लिए लिखित रहे हैं, लेकिन प्रोटीन के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता है । सबूत बढ़ाने से पता चला है कि lncRNAs जीन अभिव्यक्ति6 के विनियमन में भाग लेते है और दीक्षा और कैंसर के अधिकांश प्रकार की प्रगति में शामिल हैं, मिमी7,8,9सहित । MALAT1 एक परमाणु-गैर कोडिंग प्रतिलिपि 2 (NEAT2) समृद्ध और एक उच्च संरक्षित lncRNA10है । MALAT1 शुरू में मेटास्टेटिक गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC)11में मांयता प्राप्त है, लेकिन कई ट्यूमर में व्यक्त किया गया है5,12,13; यह सबसे उच्च व्यक्त lncRNAs में से एक है और मिमी8,14में एक गरीब रोग का निदान के साथ संबंधित है । MALAT1 की अभिव्यक्ति स्तर पर गंभीर पाठ्यक्रम extramedullary mm रोगियों केवल मिमी15के रूप में निदान की तुलना में काफी अधिक है ।

पिछले एक अध्ययन में, हमने पुष्टि की है कि एंटी-MALAT1 ओलिगोस्पर्मिया मजबूती से डीएनए क्षति के लिए सीसा और mm16 में apoptosis gapmer डीएनए antisense oligonucleotides लक्ष्यीकरण MALAT1 (विरोधी MALAT1) का उपयोग करके मिमी कोशिकाओं में । gapmer डीएनए antisense डीएनए से बना है और 2 ' से जुड़े-OMe-RNAs, जो MALAT1 ज गतिविधि द्वारा त्वरित RNase दरार सकता है एक बार17बाध्य । में vivo वितरण दक्षता antisense ओलिगोस्पर्मिया अभी भी अपने नैदानिक उपयोग सीमा ।

एंटी-MALAT1 gapmer ओलिगोस्पर्मिया के लिए SWCNT के डिलिवरी प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एंटी MALAT1 gapmer डीएनए को संयुग्मित-DSPE-अमीनी कार्यात्मकता PEG2000 है. SWCNT-विरोधी MALAT1 तो नसों में एक मिमी फैलाया माउस मॉडल में इंजेक्ट किया जाता है; एक हड़ताली निषेध चार उपचार के बाद मनाया जाता है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों पशु शामिल पूर्व क्लीवलैंड क्लिनिक IACUC (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. कार्यात्मक SWCNTs का संश्लेषण

  1. मिश्रण 1 मिलीग्राम SWCNTs, 5 DSPE के मिलीग्राम-PEG2000-अमीन, और एक गिलास जुटाना शीशी (20 एमएल) में निष्फल nuclease-मुफ्त पानी की 5 मिलीलीटर । यह अच्छी तरह से हिला सभी रिएजेंट पूरी तरह से भंग करने के लिए ।
  2. Sonicate एक जल स्नान sonicator में एक बिजली के स्तर पर 1 के लिए ४० W के कमरे के तापमान पर (आरटी, 20 मिनट x 3, पानी बदलने के लिए हर 20 मिनट overheating से बचने के लिए) । फिर, यह 6 घंटे के लिए २४,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant समाधान इकट्ठा । इस कार्यात्मक SWCNT समाधान 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. एक १०० केडीए MWCO केंद्रापसारक फिल्टर डिवाइस के लिए कदम १.२ से SWCNT समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें, निष्फल nuclease-मुक्त पानी की 4 मिलीलीटर के बाद । ४,००० x g पर 10 मिनट के लिए आरटी में अतिरिक्त DSPE-PEG2000-अमीन हटाने के लिए केंद्रापसारक । पानी की 4 मिलीलीटर और केंद्रापसारक 5x के अलावा दोहराएं । बचे हुए SWCNT समाधान के ०.५ मिलीलीटर से अधिक प्रत्येक केंद्रापसारक के बाद फिल्टर में छोड़ दिया जाएगा ।
  4. अंतिम धोने के बाद ८०८ एनएम पर एक यूवी/विज़ स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर फिल्टर में बचे हुए SWCNT समाधान की एकाग्रता को मापने । अंतिम एकाग्रता आमतौर पर के बारे में है ५० mg/L (Kam एट अल.18द्वारा विकसित की विधि के अनुसार गणना).
    नोट: सुनिश्चित करें कि DSPE-खूंटी कार्यात्मक SWCNTs कदम १.४ के बाद पानी में घुलनशील हैं और कुछ ही हफ्तों के बाद दिखाई एकत्रीकरण के बिना विभिन्न जैविक समाधान में स्थिर हैं ।

2. विकार of Anti-MALAT1 Gapmer डीएनए 2 ' द्वारा पार्श्व-O संशोधित RNAs को कार्यात्मकया SWCNT

  1. जोड़ें ०.५ Sulfo-LC-SPDP के ४५० µ एल में DSPE-PEG2000-अमीन कार्यात्मक SWCNT के मिलीग्राम । 10x पंजाबियों के ५० µ एल जोड़ें और फिर आरटी पर 2 एच के लिए मशीन ।
  2. अतिरिक्त Sulfo-LC-SPDP को निकालने के लिए, चरण २.१ से एक १०० केडीए MWCO केंद्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस के लिए प्रतिक्रिया जोड़ें, nuclease के 4 मिलीलीटर-मुक्त पानी के बाद । 10 मिनट के लिए आर टी पर ४,००० x g पर के लिए केंद्रापसारक पानी की 4 मिलीलीटर और केंद्रापसारक 5x के अलावा दोहराएं ।
  3. जोड़ें २०० एनएम thiol-संशोधित विरोधी MALAT1-Cy3 gapmer डीएनए में १.५ मिलीलीटर वाणिज्यिक डीटीटी समाधान और मशीन के लिए ९० मिनट में RT. एक झपकी-5 कॉलम के साथ उत्पाद शुद्ध, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन । Elute एंटी-MALAT1-Cy3 के साथ निष्फल nuclease-मुक्त 1x पंजाबियों के ५०० µ l ।
    नोट: कार्यात्मक SWCNT जोड़ा डीटीटी, जो thiolated विरोधी MALAT1 gapmer डीएनए के भंडारण के दौरान गठित डाइसल्फ़ाइड बांड सट सकता है के साथ संग्रहीत किया जा सकता है । जोड़ा डीटीटी SWCNT के साथ विकार से पहले अणप-5 कॉलम द्वारा हटाया जा सकता है ।
  4. sulfo-LC-SPDP-इलाज DSPE-PEG2000-अमीन SWCNT समाधान फ़िल्टर में छोड़ दिया है और यह विरोधी µ-MALAT1 समाधान के ५०० Cy3 एल के साथ पतला ले लीजिए । फिर, यह 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । संयुग्मित SWCNT-anti-MALAT1 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । एक ही प्रक्रिया के बाद, हाथापाई antisense oligo के साथ संयुग्मित SWCNT संश्लेषित किया जा सकता है और SWCNT नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया ।

3. SWCNT-Anti-MALAT1 की पूंछ नस इंजेक्शन

  1. एक मिमी फैलाया माउस मॉडल उत्पन्न करते हैं.
    1. तुलना के सर्वश्रेष्ठ परिणाम प्राप्त करने के लिए, बेतरतीब ढंग से 14 मंजूरी की व्यवस्था । CB17-Prkdcscid/जे चूहों (8 सप्ताह पुराने) परीक्षण या नियंत्रण समूहों में (प्रत्येक समूह में सात) एक ही पुरुष के साथ/
    2. आपरेशन बेंच साफ और यह ७०% शराब के साथ निष्फल ।
    3. एक हीटिंग लैंप का उपयोग करने के लिए मदद करने के लिए पूंछ नस प्रकट करने के लिए माउस गर्म । एक पूंछ इंजेक्शन निरोधक के साथ ठीक से माउस को नियंत्रित ।
    4. संज्ञाहरण के बिना पूंछ नस के माध्यम से पंजाब के ५० µ एल में 5 x 106 मिमी. 1s-ल्यूक-mCherry कोशिकाओं सुई । 30 एस के लिए एक शराब झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट दबाएँ. इंजेक्शन माउस को चिह्नित करें और इसे एक साफ पिंजरे में वापस ।
  2. मिमी. 1s सेल इंजेक्शन के बाद 7 दिन पर उपचार शुरू ।
    1. SWCNT-विरोधी MALAT1 युक्त पंजाब के ५० µ एल सुई माउस की पूंछ नस में । SWCNT युक्त का प्रयोग करें-नियंत्रण एक नियंत्रण के रूप में ।
    2. 30 एस के लिए एक शराब झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट दबाएँ ।
    3. पूंछ पर स्थानीय रक्तस्राव और 1 मिनट के लिए माउस के सामांय व्यवहार का निरीक्षण करें, और फिर इसे एक साफ पिंजरे में वापस । सभी इंजेक्शन चूहों रैक करने के लिए पिंजरे लौटने से पहले फिर से निरीक्षण, यह सुनिश्चित करने के लिए कि injection अच्छी तरह से सहन कर रहे हैं ।
  3. प्रयोग की समाप्ति तक हर 7 दिन में इंजेक्शन दोहराएं ।
    1. प्रयोग समाप्त जब माउस के सामांय स्वास्थ्य नीचा: जब खाने या पीने के नहीं, पीला पंजे, किसी भी चमड़े के नीचे खून बह रहा है, सांस की तकलीफ, कम गतिविधि, कम अंगों के पक्षाघात की उपस्थिति, और/या में एक स्पर्शीय जन पेट मनाया जाता है ।

4. रोग की प्रगति का मूल्यांकन

  1. एम. 1s-ल्यूक-mCherry सेल इंजेक्शन के बाद हर दिन चूहों की सामान्य स्थिति का आकलन करें । अगर चूहों निचले अंगों के पंगु बना विकास विशेष ध्यान देना ।
  2. SWCNT-एंटी-MALAT1 इंजेक्शन से पहले एक सप्ताह vivo इमेजिंग सिस्टम 1x में एक का उपयोग कर ट्यूमर विकास का मूल्यांकन करें ।
    1. तैयार ताजा 15 मिलीग्राम/एमएल डी-Luciferin 1x पंजाब के साथ ।
    2. Anesthetize चूहों के साथ एक isoflurane vaporizer (3-5% प्रेरण के लिए और 1 – 3% रखरखाव के लिए, चूहों की स्थिति पर निर्भर करता है).
    3. प्रत्येक माउस intraperitoneally, इमेजिंग से पहले 5 मिनट में १५० मिलीग्राम/kg D-Luciferin इंजेक्षन; फिर, एक स्पेक्ट्रम इमेजिंग प्रणाली के साथ एक प्रवण स्थिति में चूहों छवि ।
    4. luminescence संतृप्ति तक पहुँच गया है जब तक, हर 2 मिनट चूहों की अनुक्रमिक छवियों को इकट्ठा. डी-Luciferin के अनुसार अंतराल समय समायोजित करें/
  3. प्रयोग की समाप्ति के एक बार चूहों को बलिदान करने के लिए सह2 का उपयोग करें ।
  4. चूंकि यह एक मिमी का प्रसार मॉडल है, इस प्रकार के रूप में चूहों की प्रक्रिया.
    1. विच्छेदन से पहले माउस तौलना ।
    2. एक पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) परख एक रक्त कोशिका काउंटर मशीन द्वारा प्रदर्शन के लिए दिल से परिधीय रक्त ले लीजिए । सफेद रक्त कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं की गिनती, साथ ही लिम्फोसाइटों के अनुपात, प्राथमिक अनुक्रमित रहे हैं ।
    3. तिल्ली को अलग करें और उसे तौलना. तिल्ली/शरीर के वजन के अनुपात की गणना; तिल्ली बढ़ने के रूप में 0.5% > पर विचार करें ।
    4. अस्थि मज्जा, तिल्ली, लिम्फ नोड, गुर्दे के ऊतकों को इकट्ठा, और दिखाई मेटास्टेसिस के साथ ऊतक ।
    5. रीढ़ की हड्डी लीजिए अगर चूहे ने निचले अंगों का पक्षाघात विकसित किया ।
    6. अस्थि मज्जा के नमूनों से आरएनए और प्रोटीन निकालें ।
    7. formalin में शेष सभी ऊतकों को ठीक करें ।
    8. decalcification के लिए, ०.२५ मीटर EDTA सॉल्यूशन (pH ८.०) में अस्थि नमूनों को 5 दिनों के लिए विसर्जित कर निर्धारण के 24 ज के बाद ।
    9. लंबी अवधि के भंडारण के लिए ७५% शराब में सभी नमूनों विसर्जित कर दिया ।
  5. दो समूहों में एक ही समय बिंदुओं पर luciferase के सिग्नल की शक्ति की तुलना करें । दोनों समूहों से, प्रत्येक माउस के बलिदान तिथियां रिकॉर्ड और सॉफ्टवेयर के साथ दो समूहों के अस्तित्व curves की गणना ।
    नोट: सभी प्रक्रियाओं चित्रा 1में संक्षेप हैं ।

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Representative Results

मिमी में विरोधी MALAT1 gapmer डीएनए के निषेध प्रभाव प्रदर्शित करने के लिए, हम नीचे MALAT1 की अभिव्यक्ति खटखटाया और यह H929 और MM. 1s कोशिकाओं में इस्तेमाल किया । ४८ घंटे बाद, कोशिकाएं नॉक-डाउन दक्षता के विश्लेषण और एंटी-MALAT1 gapmer या नियंत्रण डीएनए के साथ transfected कक्षों में apoptosis स्थिति के लिए एकत्र की गईं. qRT-पीसीआर के नतीजों से पता चला कि एंटी MALAT1 gapmer डीएनए ने H929 में MALAT1 एक्सप्रेशन को नीचे गिरा दिया और एमएम. 1s कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक (चित्रा 2ए) । apoptosis की स्थिति प्रवाह cytometry, जो नीचे से पता चला-विनियमित MALAT1 प्रेरित apoptosis काफी (चित्रा 2बी) द्वारा निर्धारित किया गया था ।

इन परिणामों से संकेत मिलता है कि anti-MALAT1 ओलिगोस्पर्मिया बाधित MM में प्रभावी रूप से इन विट्रो । हालांकि, एक कुशल वितरण विधि/vivo में एंटी-MALAT1 ओलिगोस्पर्मिया के लिए विकसित किया जा करने की आवश्यकता है, जो भी नैदानिक अनुप्रयोग में antisense ओलिगोस्पर्मिया की बाधा है; इसलिए SWCNT में हमारी रुचि है । SWCNT दवा वितरण के लिए एक उपन्यास nanomaterial है, जो उचित संशोधनों के बाद hydrophilicity और dissolubility विकसित कर सकता है; इसलिए, यह oligonucleotide दवाओं जैसे विभिन्न रूपों में कार्गो वितरित कर सकते हैं । vivo में SWCNT की डिलिवरी दक्षता को मांय करने के लिए, हम पहले DSPE के साथ SWCNT कार्यात्मक-PEG2000-अमीन, जो संपंन hydrophilicity और SWCNT19के लिए विशिष्टता बाध्यकारी । फिर, इस कार्यात्मक SWCNT sulfo-LC-SPDP के साथ मुक्त sulfhydryl समूहों, जो oligo के साथ कनेक्ट करने के लिए उपयोग किया जाएगा बनाने के लिए इलाज किया गया था । एंटी-MALAT1 oligo और sulfo-LC-SPDP-स्वास्थ्यकर्मी SWCNT को संयुग्मी करने के लिए, एंटी-MALAT1 oligo के 5 ' सिरों को thiol समूहों (s-s) के साथ संशोधित किया गया है; दिख वितरण ट्रैक करने के लिए, विरोधी MALAT1 oligo के 3 ' समाप्त होता है cyanine 3 (Cy3) के साथ संशोधित किया गया था । सभी संश्लेषण चरणों के बाद, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 प्राप्त किया गया था (चित्रा 1)12. उसके बाद, यह H929-GFP और MM. 1s-GFP कोशिकाओं के कल्चरल मीडियम को डिलिवरी एफिशिएंसी को मान्य करने के लिए जोड़ा गया ।

के रूप में चित्रा 2सीमें दिखाया गया है, SWCNT-विरोधी MALAT1-Cy3 कुशलता मिमी कोशिकाओं के नाभिक में दिया गया था और काफी MALAT1 और mm. 1s कोशिकाओं में अंतर्जात H929 स्तर को दबा (चित्रा 2डी). सामान्य कोशिकाओं में SWCNT की विषाक्तता और सुरक्षा की जांच करने के लिए, SWCNT-रोधी-MALAT1-Cy3 को विभिन्न सांद्रता में BMEC-1 कोशिकाओं के माध्यम में जोड़ा गया था; Lipofectamine उपचार नियंत्रण था; सादा मध्यम आवश्यक नियंत्रण (चित्रा 2ई) के रूप में इस्तेमाल किया गया था । फिर, सेल व्यवहार्यता 1 दिन, दिन 2, और 3 दिन पर एक सेल व्यवहार्यता परख किट का उपयोग कर पाया गया । कोशिका व्यवहार्यता अवरोध में कोई महत्वपूर्ण अंतर SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 और विभिंन खुराकों और समय बिंदुओं पर उपचार नियंत्रण के बीच पाया गया । वहां सादे माध्यम (नेकां) या तो है, जो इंगित करता है कि SWCNT की विषाक्तता-विरोधी MALAT1-Cy3 उपचार नियंत्रण है, जो उच्च खुराक पर सामांय कोशिकाओं को एक सीमित और स्वीकार्य विषाक्तता के समान है की तुलना में कोई अंतर नहीं था ।

अगले, एक मानव मिमी का प्रसार माउस मॉडल vivo में SWCNT-anti-MALAT1 के उपचार प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया था । सबसे पहले, प्रत्येक SCID-बेज रंग माउस (8 सप्ताह पुराना) 5 x 106 मिमी. 1s-ल्यूक-mCherry कोशिकाओं के साथ नसों में इंजेक्ट किया गया था (चित्रा 3). मिमी. 1s कोशिकाओं के साथ कुल 14 चूहों का इंजेक्शन लगाया गया; उनके अलावा, सात चूहों एक SWCNT-विरोधी MALAT1-Cy3 उपचार समूह में बेतरतीब ढंग से व्यवस्था की गई थी, और एक और सात नियंत्रण समूह में थे. दोनों SWCNT-विरोधी MALAT1 और SWCNT नियंत्रण ओलिगोस्पर्मिया 1x पंजाबियों के ०.५ मिलीलीटर में भंग और पूंछ नसों के माध्यम से इंजेक्शन 7 दिनों के ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद किया गया । SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 उपचार प्रयोग की समाप्ति तक हर 7 दिन दोहराया गया था । ट्यूमर के बोझ का मूल्यांकन करने के लिए, luciferin संकेत एक में vivo इमेजिंग सिस्टम (IVIS) 30 मिनट के बाद luciferin इंजेक्शन 1x एक सप्ताह पहले SWCNT-oligo इंजेक्शन के द्वारा मनाया गया था । हमने पाया है कि SWCNT में चूहों के luciferin संकेतों-विरोधी MALAT1 उपचार समूह SWCNT के उन लोगों के साथ तुलना में उल्लेखनीय कम थे उपचार के 21 दिनों के बाद नियंत्रण उपचार समूह (28 दिन से). उनके स्वास्थ्य और अस्तित्व की स्थिति की जांच की और हर दिन दर्ज की गई और एक कापलान-Meier वक्र में संक्षेप । इन परिणामों से, हम निष्कर्ष निकाला है कि SWCNT-विरोधी MALAT1 उपचार नसों इंजेक्शन के माध्यम से विरोधी MALAT1 ओलिगोस्पर्मिया ट्यूमर कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से वितरित कर सकते हैं । हम, तो, ट्यूमर बोझ सीमित और चूहों की उंर (पी = ०.०४) के रूप में की उंमीद है, जो इन विट्रो परिणामों में समान है विस्तारित । हम पूरे प्रयोग अवधि के दौरान चूहों में उपचार के किसी भी महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव नहीं मिला, जो संकेत दिया कि SWCNT-anti-MALAT1 इंजेक्शन चूहों के लिए एक सुरक्षित उपचार है; इसलिए एंटी-MALAT1 के लिए vivo डिलिवरी सिस्टम में SWCNT एक सेफ और भरोसेमंद है ।

Figure 1
चित्रा 1 : संश्लेषण की योजनाबद्ध आरेख, अवशोषण, और vivo पृथक्करण में एक SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer oligo. (क) SWCNT DSPE के साथ कार्यात्मक था-PEG2000-अमीन और, बाद में, MALAT1-LC-Cy3 द्वारा मध्यस्थता डाइसल्फ़ाइड लिंकेज के माध्यम से विरोधी Sulfo-SPDP के साथ संयुग्मित. (ख) SWCNT-संयुग्मित रोधी MALAT1 को टेल नस के जरिए MM. 1s-ल्यूक-mCherry कोशिकाओं के साथ माउस में इंजेक्ट किया गया था । (ग) SWCNT-संयुग्मित विरोधी MALAT1 लन या bilayer के माध्यम से फॉस्फोलिपिड endocytosis झिल्ली घुसी । (घ) SWCNT-विरोधी MALAT1 कोशिकाओं द्वारा अवशोषण के बाद जल्दी endosomes के भीतर पैक किया गया था; फिर, जल्दी endosome एक देर endosome के लिए परिपक्व और एक lysosome के साथ विलय के लिए एक endolysosome के रूप में । endolysosome डाइसल्फ़ाइड बांड को तोड़कर SWCNT से एंटी-MALAT1 रिलीज करने में मदद करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : SWCNT-विरोधी MALAT1 ंयूनतम विषाक्तता और मिमी सेल लाइनों में प्रेरित apoptosis के साथ कुशलतापूर्वक दिया गया था । SWCNT-रोधी MALAT1 gapmer oligo या SWCNT-नियंत्रण oligo क्रमशः transfected और MM. 1s कक्षों में Lipofectamine करके H929 किया गया. ४८ घंटे बाद, हम (क) के लिए कोशिकाओं को एकत्र qRT द्वारा MALAT1 अभिव्यक्ति का विश्लेषण-पीसीआर और (ख) apoptosis विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा । (ग) H929-GFP और MM. 1s-GFP कोशिकाओं को ४८ घंटे के लिए SWCNT-रोधी-MALAT1-Cy3 के साथ सह-कल्चरित किया गया; प्रसव दक्षता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (स्केल बार्स = १०० µm) द्वारा निर्धारित किया गया था । (घ) qRT-पीसीआर द्वारा व्यंजक स्तर ofMALAT1 का पता लगाया गया था, जिससे पता चला कि यह H929 और MM. 1s कक्षों (* * p < ०.०१, * * * p < ०.००१) में सफलतापूर्वक दस्तक दे चुका है. (ङ) SWCNT और उपचार नियंत्रण को विभिन्ना खुराकों पर BMEC-१ कोशिकाओं के कल्चरल माध्यम में जोड़ा गया. प्रसार एक सेल व्यवहार्यता परख किट का उपयोग कर मापा गया था । यह आंकड़ा हू एट अल.16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : SWCNT-anti-MALAT1 दबा मायलोमा में बढ़ रही mm. 1s-सेल का निर्माण किया मिमी का प्रसार माउस मॉडल. (A) 5 x 106 मिमी. 1s-ल्यूक-mCherry कोशिकाओं नसों के विकिरणित SCID-बेज चूहों (प्रत्येक समूह में सात) की पूंछ नसों के लिए इंजेक्शन थे; ५० μL एक SWCNT-एंटी-MALAT1 या SWCNT-नियंत्रण समाधान के 7 दिन से पूंछ नस के माध्यम से हर ७ दिनों में इंजेक्शन थे मिमी. 1s सेल इंजेक्शन के बाद । IVIS का इस्तेमाल ट्यूमर ग्रोथ पर नजर रखने के लिए किया गया । (ख) हिंद अंग पक्षाघात और ट्यूमर बोझ अंतिमबिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और अस्तित्व डेटा एक कापलान-Meier विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया । यह आंकड़ा हू एट अल.16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सबूत से पता चला है कि lncRNAs कैंसर में कई शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं के विनियमन में भाग लेने, मिमी सहित7,8,9; वे कैंसर के इलाज के लिए लक्षित होने की क्षमता है, जो antisense oligonucleotides20,21,22द्वारा महसूस किया जा सकता है । अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) ने कई antisense oligonucleotide दवाओं को मंजूरी दी है, जिनमें fomivirsen के लिए cytomegalovirus रेटनाइटिस23, mipomersen के लिए homozygous पारिवारिक विटिलिगो के लिए24, nusinersen रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष२५, आणि eteplirsen Duchenne दमदार dystrophy२६. इस अध्ययन में हमने एंटी-MALAT1 gapmer डीएनए को 2 '-OMe-आरएनए के साथ संशोधित किया और इसे फंक्शनल SWCNT के साथ संयुग्मित । SWCNT किया जाता है और उद्धार विरोधी MALAT1 ओलिगोस्पर्मिया एक शटल है, जो न केवल oligo के संबध में सुधार के कारण अपने लचीलेपन और कई लदान के लिए लक्ष्य है लेकिन यह भी ओलिगोस्पर्मिया स्थिर और मदद की डिलीवरी के दौरान nuclease गिरावट को रोकने के27 .

SWCNTs की सतह पर एक उपयुक्त संशोधन यह शारीरिक रूप से प्रासंगिक, जलीय वातावरण में विश्वसनीय dispersibility प्राप्त करने और उनके वितरण28,29को बढ़ावा देने में मदद कर सकते हैं । हम DSPE-PEG2000-अमीन का इस्तेमाल किया SWCNT, जो SWCNT पर भ्रष्टाचार के लिए प्रदर्शन किया गया है और इसके बारे में जलीय घुलनशीलता में सुधार को संशोधित करने, और इसके अलावा, यह जैविक मीडिया में ढेर बिना उत्कृष्ट स्थिरता दिखाया30। Sulfo-LC-SPDP प्रयोग में एक crosslinker के रूप में प्रयोग किया जाता था, जो कार्यात्मक SWCNT MALAT1 लिंकेज के माध्यम से विरोधी gapmer डाइसल्फ़ाइड डीएनए बांध करने में मदद की, और उसके बाद उंहें कोशिकाओं में उद्धार । एक बार मिमी कोशिकाओं में प्रवेश SWCNT, वे जल्दी endosomes द्वारा उठाए गए (पीएच ~ ६.०), जो तो देर endosomes (पीएच ~ ५.०) एक कम पीएच31मूल्य के साथ परिपक्व । खूंटी लिंक का लाभ यह है कि बंधन पीएच > 6 पर स्थिर है, लेकिन अप करने के लिए 75-92% खूंटी से जुड़े दवा 2 घंटे के भीतर जारी की गई एक बार पीएच ५.५३२,३३,३४से कम हो गया । Endosomes ले SWCNT-विरोधी MALAT1 lysosomes के साथ विलय (पीएच ~ ४.५) के लिए एक endolysosome फार्म, और फिर डाइसल्फ़ाइड बांड catalyzed lysosomal thiol है, जो बेहतर एक कम पीएच३५पर सक्रिय था द्वारा रिडक्टेस थे । यह, बाद में, मुफ्त विरोधी MALAT1 gapmer डीएनए जारी किया । प्रयोग परिणामों के अनुसार इन विट्रो में और vivo में, SWCNT दिया SWCNT-विरोधी MALAT1 प्रभावी ढंग से और मदद की यह समारोह में इसी तरह कार्य विरोधी के लिए MALAT1 इन विट्रो ।

प्रकार्यात्मक SWCNTs दो पैटर्न के माध्यम से फॉस्फोलिपिड bilayer के माध्यम से गुजारें: प्रविष्टि३६,३७ और endocytosis३८,३९। इन प्रक्रियाओं SWCNT कोशिका झिल्ली के स्थिरीकरण में दखल के बिना कोशिकाओं में माल उद्धार, इसलिए SWCNT की विषाक्तता कम मदद करते हैं । हम SWCNT के ५० µ एल इंजेक्शन-विरोधी-MALAT1 (~ ४० mg/l) प्रत्येक माउस में (~ 20 g); इस प्रकार, अंतिम दवा एकाग्रता था ०.१ मिलीग्राम/kg, जो बहुत कम है खुराक हम विषाक्तता प्रयोगों में इस्तेमाल किया (2 mg/l और 4 mg/l). पिछले परिणामों के रूप में दिखाया, SWCNT उपचार नियंत्रण के रूप में एक समान प्रभाव है (जैसे, Lipofectamine) सेल विकास और व्यवहार्यता पर मिलान खुराक पर. उपचार नियंत्रण सेल अभिकर्मक के लिए एक आम एजेंट है और कोशिकाओं को एक सीमित और स्वीकार्य विषाक्तता के लिए माना जाता है; इस प्रकार, हम मानते है SWCNT केवल सामांय कोशिकाओं के लिए एक ंयूनतम विषाक्तता है ।

antisense oligonucleotides के लिए एक शटल के रूप में, चयापचय SWCNT की सुरक्षा के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार है । यह प्रदर्शित किया गया है कि कार्यात्मक SWCNT मुख्य रूप से गुर्दे के माध्यम से उत्सर्जित है, glomerular और ट्यूबलर विषाक्तता४०के बिना. हम गुर्दे की शिथिलता से संबंधित लक्षण नहीं मिला, जैसे पेशाब, anuria, शोफ, गुर्दे की उपस्थिति में परिवर्तन, आदि चूहों में है कि SWCNT इंजेक्शन स्वीकार किए जाते हैं. इस प्रकार, SWCNTs कोई विषाक्तता एक सामान्य गुर्दे समारोह के साथ एक माउस में किसी भी असामान्य संचय के कारण प्रभाव है.

हम कार्यात्मक SWCNT के साथ lncRNA लक्ष्यीकरण oligonucleotides विरोधी भावना संयुग्मी करने के लिए पहली बार कर रहे है और यह MM उपचार के लिए उपयोग करें । SWCNT उपंयास nanomaterial, जो सुसंगत chirality, वैकल्पिक व्यास है, और लंबाई वितरण का एक प्रकार है । functionalization उपचार के बाद, SWCNTs पानी घुलनशीलता और जैव अनुकूलता विकसित करने और कोशिका झिल्ली के माध्यम से कई माल देने के लिए एक आदर्श जैविक शटल बन जाते हैं, जिससे दवा वितरण में वृद्धि और उपचार प्रभाव को बढ़ाने. इसके अलावा, SWCNT विरोधी भावना nuclease पाचन से oligonucleotide अणुओं को स्थिर कर सकते हैं1. परिणाम दिखाने के रूप में, कार्यात्मक SWCNT-विरोधी MALAT1 मिमी कोशिकाओं में MALAT1 दिया कुशलता से और हिचकते mm विकास में नाटकीय रूप से सेल लाइनों में इन विट्रो में और vivo में एक प्रसारित माउस मॉडल में । अब तक हमने इन प्रयोगों में SWCNT उपचार के कारण किसी विषाक्तता पर गौर नहीं किया. यह अध्ययन दर्शाता है कि SWCNT antisense oligonucleotide दवाओं के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी प्रसव वाहन है और रोगियों में चिकित्सीय अणुओं के लिए एक वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों Lerner अनुसंधान संस्थान proteomic, जीनोमिक, और उनकी सहायता और समर्थन के लिए इमेजिंग कोर धंयवाद । फंडिंग: यह काम वित्तीय रूप से NIH/NCI ग्रांट R00 CA172292 (टू J.J.Z.) और स्टार्ट-अप फंड (J.J.Z. को) और केस वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी कोर उपयोग पायलट ग्रांट (CTSC) के नैदानिक और शोधों विज्ञान सहयोगी (J.J.Z.) द्वारा समर्थित था । यह काम Leica SP8 फोकल माइक्रोस्कोप कि स्वास्थ्य हस्ताक्षर अनुदान 1S10OD019972-01 के राष्ट्रीय संस्थानों से धन के साथ खरीदा गया था का उपयोग किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SWCNTs Millipore-Sigma 704113
DSPE-PEG2000-Amine Avanti Polar Lipids 880128
bath sonicator VWR 97043-992
4 mL centrifugal filter Millipore-Sigma Z740208-8EA
UV/VIS spectrometer Thermo Fisher Scientific accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm
Sulfo-LC-SPDP ProteoChem c1118
DTT solution Millipore-Sigma 43815
NAP-5 column GE Healthcare 17-0853-01
in vivo imaging system PerkinElmer
NOD.CB17-Prkdcscid/J mice Charles River lab 250
Flow cytometer Becton Dickinso
Lipofectamine Invitrogen 11668019 Lipofectamine2000
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 10437-028
RMPI-1640 medium Invitrogen 11875-093
MALAT1-QF: synthesized by IDT Company 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’
MALAT1-QR: synthesized by IDT Company 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’
GAPDH-QF: synthesized by IDT Company 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’
GAPDH-QR: synthesized by IDT Company 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’
Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix Thermo Fisher Scientific A25780
RevertAid first-stand cDNA synthesis kit Thermo Fisher Scientific K1621
anti-MALAT1 synthesized by IDT Company 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T
*G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’
Cell Viability Assay Kit Promega Corporation G7570 CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit
accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
centrifugal filter Millipore-Sigma UFC910008
SPSS software IBM version 24.0
D-Luciferin Millipore-Sigma L9504

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १४२ एकल दीवार कार्बन नैनोट्यूब SWCNT एकाधिक मायलोमा MALAT1 लांग गैर कोडिंग आरएनए lncRNA
सिंगल वॉल कार्बन नैनोट्यूब (SWCNT) द्वारा Vivo में मल्टीपल मायलोमा सेल ग्रोथ का दमन-डिलीवर MALAT1 Antisense ओलिगोस्पर्मिया
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Lin, J., Hu, Y., Zhao, J. J. Repression of Multiple Myeloma Cell Growth In Vivo by Single-wall Carbon Nanotube (SWCNT)-delivered MALAT1 Antisense Oligos. J. Vis. Exp. (142), e58598, doi:10.3791/58598 (2018).

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