Summary
Bu el yazması bir tek-duvar karbon nanotüp (SWCNT) sentezi açıklar-SWCNT güvenilir teslim ve güçlü tedavi edici etkisini gösteren MALAT1 antianlamlı gapmer DNA oligonükleotid (SWCNT-anti-MALAT1), Birleşik Anti-MALAT1 tüp bebek ve içinde vivo. Yöntemleri kullanılan sentez, değiştirme, fiil ve SWCNT-anti-MALAT1 enjeksiyon açıklanmıştır.
Abstract
Tek-duvar karbon nanotüp (SWCNT) olan hücrelere, proteinler, oligonucleotides ve sentetik küçük molekül uyuşturucu gibi birden fazla çeşit uyuşturucu dağıtmak için kullanılan nanopartikül, yeni bir türüdür. SWCNT özelleştirilebilir boyutları, yüzeysel geniş bir alanı vardır ve esnek yüzeyinde farklı değişiklikler yoluyla uyuşturucu ile bağlayabilirsiniz; Bu nedenle, uyuşturucu hücreye taşımak için ideal bir sistemdir. Uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs) bir küme kodlamayan RNA 200 daha uzun olan nt, protein çevrilemeyen ancak biyolojik ve patofizyolojik işlemlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Metastaz ilişkili akciğer adenokarsinom transkript 1 (MALAT1) son derece korunmuş bir lncRNA olduğunu. Yüksek MALAT1 düzeyleri multipl miyelom (MM) de dahil olmak üzere çeşitli kanserlerin kötü prognoz ile ilgili gösterilmiştir. Biz-si olmak kâşif MALAT1 DNA tamiri ve hücre ölüm mm düzenler; Böylece, MALAT1 MM için terapötik hedef olarak kabul edilebilir. Ancak, antianlamlı oligo verimli bir şekilde teslim inhibe/nakavt vivo içinde MALAT1 için hala bir sorundur. Bu çalışmada biz PEG-2000 ile SWCNT değiştirmek ve bunu bir anti-MALAT1 oligo eşlenik, bu bileşik tüp bebek teslim test etmek, Dissemine bir MM fare modeli olarak intravenöz enjekte etmek ve MM progresyon gösteren önemli bir inhibisyon gözlemlemek o SWCNT bir ideal teslimat servisi için anti-MALAT1 gapmer DNA'sı var.
Introduction
SWCNT çeşitli ilaçlar, nükleik asitler, proteinler ve küçük moleküller gibi ideal tolerabilite ve in vitro1 ve içinde vivo2en az toksisite stably ve verimli bir şekilde sunabilir bir roman nanomaterial var. Functionalized SWCNT büyük biyouyumluluk ve su çözünürlük vardır, bir mekik daha küçük moleküller için kullanılabilir ve hücre zarının3,4,5nüfuz onları taşıyabilir.
lncRNAs olan bir küme RNA'ın (> 200 nt) bu mRNA için genom transkripsiyonu ama protein çevrilemez. Kanıt artan lncRNAs gen ifade6 Yönetmelikte katılmak ve inisiyasyon ve en tip-in MM7,8,9dahil olmak üzere kanser progresyon katılmaktadırlar göstermiştir. MALAT1 olan bir nükleer zenginleştirilmiş kodlamayan transkript 2 (NEAT2) ve son derece korunmuş lncRNA10. MALAT1 başlangıçta metastatik olmayan küçük hücreli akciğer kanseri (NSCLC)11' kabul edilmektedir, ancak çok sayıda tümör5,12,13' te overexpressed; en çok ifade lncRNAs biridir ve kötü prognoz MM8,14ile ilişkilidir. MALAT1 ifade düzeyini yalnızca MM15tanısı göre ölümcül ders ekstramedullar MM hastalarda anlamlı olarak daha yüksek.
Bir önceki çalışmada, biz anti-MALAT1 oligos sağlam DNA hasarı ve MM16 apoptosis gapmer DNA antianlamlı oligonucleotides MALAT1 hedefleme kullanarak yol doğruladı (anti-MALAT1) MM hücrelerdeki. Gapmer DNA antianlamlı DNA'sı oluşur ve 2'-OMe-hangi MALAT1 bölünme RNase H bir kez bağlı etkinlik17tarafından sor RNA'ların, bağlanmıştır. Antianlamlı oligos içinde vivo teslim verimliliğini hala klinik kullanımını sınırlar.
Teslim test etmek için SWCNT etkisi için anti-MALAT1 gapmer oligos, DNA DSPE-PEG2000-Amin için Birleşik anti-MALAT1 gapmer SWCNT functionalized. SWCNT-anti-MALAT1 sonra intravenöz bir MM Dissemine fare modeli enjekte edilir; çarpıcı bir inhibisyon dört tedaviler sonra görülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deney hayvanları içeren (kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi) Cleveland Kliniği IACUC tarafından önceden onaylanmış.
1. Functionalized SWCNTs sentezi
- Mix 1 mg SWCNTs, DSPE-PEG2000-Amin 5 mg ve 5 mL steril nükleaz ücretsiz su cam mercek flakon (20 mL). Salla de tüm reaktifler tamamen erimesi için.
- Bir su banyosu sonicator 40 W oda sıcaklığında 1 h için bir güç düzeyinde şişede solüsyon içeren temizleyicide (RT, 20 dk x 3, değiştirmek her 20 dk su aşırı ısınmayı önlemek için). Daha sonra 24.000 x g 6 h için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant çözüm toplamak. Bu işlevsel bir SWCNT çözüm 4 ° C'de 2 ay depolanabilir.
- 1 4 mL steril su nükleaz ücretsiz tarafından takip mL 100 kDa MWCO santrifüj filtre aygıta, adım 1.2 SWCNT çözeltisi ekleyin. RT ilave DSPE-PEG2000-Amin kaldırmak için de 4000 x g , 10 dk santrifüj. 4 mL su ve 5 Santrifüjü ilavesi tekrar x. Fazla 0,5 mL artık SWCNT çözeltisi filtrede her Santrifüjü sonra sol olacaktır.
- Artık bir UV/VIS Spektrometre 808 kullanarak filtre SWCNT çözüm konsantrasyonu ölçmek nm son yıkama sonra. Son konsantrasyonu genellikle yaklaşık 50 mg/L (Kam ve ark.18tarafından geliştirilen yöntemine göre hesaplanır) olduğunu.
Not: DSPE PEG functionalized SWCNTs 1.4 adımdan sonra suda çözünen ve farklı biyolojik çözümler birkaç hafta sonra görünür toplama olmadan kararlı olun.
2. 2'-O değiştirilmiş RNA'ların Functionalized SWCNT için Anti-MALAT1 Gapmer DNA'ın konjugasyon çevrili
- Sulfo-LC-SPDP 0.5 mg DSPE-PEG2000-Amin 450 µL içine SWCNT functionalized ekleyin. 10 x PBS 50 µL ekleyin ve sonra RT. 2 h için kuluçkaya
- İlave Sulfo-LC-SPDP kaldırmak için 4 mL su nükleaz ücretsiz tarafından takip tepki adım 2.1 bir aygıta 100 kDa MWCO santrifüj filtre ekleyin. 10 dakikadır RT. tekrar 4 mL ilavesi de 4000 x g , su ve Santrifüjü santrifüj kapasitesi 5 x.
- 200 nM thiol değiştiren anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA'sı içine 1,5 mL ticari DTT çözeltisi ekleyin ve 90 dk az RT. arındırmak için üreticinin protokol sonrası bir NAP-5 sütun ürünüyle kuluçkaya. Anti-MALAT1-Cy3 ile sterilize nükleaz ücretsiz 1 500 µL elute PBS x.
Not: Functionalized SWCNT thiolated anti-MALAT1 gapmer DNA depolama sırasında oluşan disülfür bağları ayırmak ekledi DTT ile saklanır. Eklenen DTT konjugasyon SWCNT ile önce aNAP-5 sütun tarafından kaldırılabilir. - Filtrede yaptı sulfo-LC-SPDP-tedavi DSPE-PEG2000-Amin SWCNT çözüm toplamak ve anti-MALAT1-Cy3 çözüm 500 µL ile sulandırmak. O zaman, 24 h için 4 ° C'de kuluçkaya. Konjuge SWCNT-anti-MALAT1 4 ° C'de 3 hafta boyunca saklanır. Aynı yordamı izleyerek, konjuge SWCNT kapış antianlamlı oligo ile sentezlenmiş ve SWCNT-denetimi olarak kullanılır.
3. kuyruk ven enjeksiyon SWCNT-Anti-MALAT1
-
Bir MM Dissemine fare modeli oluşturmak.
- Karşılaştırma en iyi sonuçları elde etmek için rasgele 14 NOD düzenleyin. CB17-Prkdcscid/J fareler (8 haftalık) deneme veya denetim grupları (her grup yedi) aynı erkek/kadın oranı ile içine.
- İşlem tezgah temiz ve % 70 alkol ile sterilize.
- Isıtma lambası sıcak görünmesini damar kuyruk yardım için fareyi kullanın. Fare düzgün bir kuyruk enjeksiyon restrainer ile dizginlemek.
- 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry hücreleri PBS 50 µL anestezi olmadan kuyruk ven yoluyla enjekte. Enjeksiyon yeri bir alkol bez ile 30 s. Mark enjekte fare tuşuna basın ve temiz bir kafese geri.
-
Gün 7'den sonra MM.1S hücre enjeksiyon tedaviye başlayın.
- SWCNT-anti-MALAT1 fare kuyruğu damar içine içeren PBS 50 µL enjekte. SWCNT-denetimi denetimi olarak içeren PBS kullanın.
- Enjeksiyon yeri bir alkol bez ile 30 için basın s.
- Kuyruk ve 1 dk. için fare genel davranışını yerel kanama gözlemlemek ve temiz bir kafese dönün. Tüm enjekte fareler tekrar dolaba enjeksiyonları iyi tolere emin olmak için kafes dönmeden önce gözlemlemek.
-
Enjeksiyon her 7 gün deneme sona ermesi kadar yineleyin.
- Ne zaman fare genel sağlık alçaltır deneme bitirmek: otelde değil yeme veya içme, soluk pençeleri görünümünü, herhangi bir cilt altı kanama, bir nefes darlığı, etkinlik, alt ekstremite ve/veya dokunmatik kitlesel bir felç azaldı Karın görülmektedir.
4. hastalık ilerleme değerlendirilmesi
- Her gün MM.1S-Luc-mCherry hücre enjeksiyon sonra fareler genel durumunu değerlendirmek. Fareler geliştirirseniz ödeme özel ilgi alt bacaklarda felç ediyor.
-
Bir içinde vivo görüntüleme sistemi 1 x bir hafta önce SWCNT-anti-MALAT1 enjeksiyon kullanarak tümör büyüme değerlendirin.
- Taze 15 mg/mL D-biyoluminesans 1 x PBS ile hazırlayın.
- Bir isoflurane Buharlaştırıcı (indüksiyon için % 3-5 ve fareler durumuna bağlı olarak bakım için % 1-3) ile fareler anestezi.
- İntraperitoneally 150 mg/kg D-biyoluminesans her fare enjekte, 5 dk önce görüntüleme; o zaman, yüzükoyun fareler bir spektrum görüntüleme sistemi ile görüntü.
- Işıma doygunluk ulaşılıncaya kadar her 2 dk, farelerin sıralı görüntüleri toplamak. D-biyoluminesans alımı/sinyal göre aralığı süresini ayarlayın.
- CO2 deney sona erdirilmesi ulaşıldığında fareler kurban için kullanın.
-
Bu bir MM Dissemine modeli olduğu için fareyi aşağıdaki gibi işlem.
- Fareyi diseksiyon önce tartın.
- Periferik kan kalp kan hücresi sayaç makine tarafından gerçekleştirilen bir tam kan sayımı (CBC) tahlil için toplamak. Beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri sayar, hem de oranı lenfositler, birincil dizin vardır.
- Dalak yalıtmak ve tartmak. Dalak/vücut ağırlığı oranını hesaplama; düşünün > Dalak büyümesi olarak % 0.5.
- Kemik iliği, dalak, lenf nodu, böbrek doku ve doku görünür metastaz ile toplamak.
- Fareyi bir felç alt ekstremite geliştirilen omurga toplamak.
- RNA ve protein kemik iliği örneklerinden ayıklayın.
- Tüm kalan dokular formalin içinde düzeltmek.
- Kalsiyumun için 0.25 M EDTA çözüm (pH 8.0) kemik örnekleri 5 gün sonra 24 h fiksasyon için bırakın.
- Uzun süreli depolama için %75 alkol tüm örneklerini bırakın.
- Luciferase iki gruplar halinde aynı zaman noktalarda sinyal gücünü karşılaştırmak. Her iki grup, her fare kurban tarihleri kaydetmek ve iki grup yazılımı ile hayatta kalma eğrileri hesaplamak.
Not: Tüm yordamları Şekil 1' de özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-MALAT1 gapmer DNA mm inhibisyon etkisini göstermek için biz MALAT1 ifade çaldı ve H929 ve MM.1S hücrelerinde kullanılan. 48 saat sonra hücre knock-down Verimlilik Analizi için toplanmıştır ve anti-MALAT1 gapmer veya denetim DNA ile hücrelerde apoptoz durumu transfected. qRT-PCR sonuçları (Şekil 2A) Anti-MALAT1 gapmer DNA H929 ve MM.1S hücreleri MALAT1 ifadede verimli bir şekilde yere serdi olduğunu gösterdi. Apoptozis durumunu aşağı düzenlenir MALAT1 indüklenen apoptosis önemli ölçüde ortaya akış sitometresi tarafından tespit edildi (resim 2B).
Anti-MALAT1 oligos MM etkili tüp bebek inhibe bu sonuçları gösterir. Ancak, bir verimli bir şekilde teslim yöntemi/Servisi anti-MALAT1 oligos içinde vivo için geliştirilecek için da klinik uygulamada antianlamlı oligos engel ile gerekli; Bu nedenle bizim ilgi SWCNT. SWCNT hydrophilicity ve dissolubility sonra uygun değişiklikler gelişebilir ilaç dağıtım için yeni bir nanomaterial olduğunu; Bu nedenle, bu oligonükleotid uyuşturucu gibi farklı biçimlerde gönderileri teslim edebilirsiniz. SWCNT içinde vivo teslim etkinliğini doğrulamak için ilk SWCNT ile DSPE-PEG2000-SWCNT19hydrophilicity ve bağlama özgüllük donatılmış olan aminler, functionalized. O zaman, bu fonksiyonel SWCNT oligo ile bağlanmak için kullanılan ücretsiz sulfhydryl grupları oluşturmak için sulfo-LC-SPDP ile tedavi edildi. Anti-MALAT1 oligo ve sulfo-LC-SPDP-tedavi SWCNT eşlenik için anti-MALAT1 oligo 5' ucuna modifiye edilmiştir thiol gruplarıyla (S-S); gözle görülür teslim izlemek için 3' ucunun anti-MALAT1 oligo siyanür 3 (Cy3) ile değiştirildiği. Tüm sentez adımları sonra SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 (Şekil 1)12elde edilen. Sonra teslim etkinliğini doğrulamak için H929-GFP ve MM.1S-GFP hücre kültür ortamına eklendi.
Şekil 2Cgösterildiği gibi SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 MM hücre çekirdeği verimli bir şekilde teslim edildi ve önemli ölçüde H929 ve MM.1S hücreleri (Şekil 2D) endojen MALAT1 kademede bastırılır. Toksisite ve SWCNT normal hücrelere güvenliğini incelemek için SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 BMEC-1 hücreleri farklı konsantrasyonlarda orta eklendi; Lipofectamine tedavi kontrolü olduğunu; düz orta temel denetimi (Şekil 2E) olarak kullanılmıştır. Sonra hücre canlılığı 1 gün, 2 gün ve gün 3 hücre canlılığı tahlil seti kullanarak tespit edildi. Hücre canlılığı inhibisyon olarak anlamlı bir fark SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 ile tedavi denetimi farklı dozlarda ve zaman puan arasında bulundu. Vardı ya, düz Orta (NC) göre fark SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 toksisite yüksek dozda, normal hücrelere bir sınırlı ve kabul edilebilir toksisite olan tedavi Denetimi'ne benzer olduğunu gösterir.
Sonra bir insan-MM Dissemine fare modeli SWCNT-anti-MALAT1 içinde vivo tedavi etkilerini değerlendirmek için kurulmuştur. İlk olarak, her SCID-bej fare (Toplam 8 haftalık) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry hücreleri ile intravenöz enjekte edildi (Şekil 3). Toplam 14 farelerin MM.1S hücreleri ile enjekte; Bunlar arasında yedi fareler rastgele bir SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 tedavi grubuna düzenlenmiştir ve kontrol grubunda 7 vardı. SWCNT-anti-MALAT1 ve SWCNT-denetim oligos 0.5 mL 1 x PBS çözünmüş ve kuyruk damarlarında 7 gün sonra tümör hücre enjeksiyon enjekte. SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 tedavi her 7 gün öncesine kadar deneme sona erdirilmesi tekrarlandı. Tümör yükünü değerlendirmek için biyoluminesans sinyal bir içinde vivo görüntüleme sistemi (IVIS) 30 dakika sonra biyoluminesans enjeksiyon 1 x bir hafta önce SWCNT-oligo enjeksiyon tarafından gözlenmiştir. SWCNT-anti-MALAT1 tedavi grubu farelerde biyoluminesans sinyalleri dikkat çekici kıyasla daha düşük bu SWCNT kontrol tedavi grubu ile tedaviden (28 gün) 21 gün sonra olduğunu bulduk. Sağlık ve hayatta kalma durumlarını kontrol edildi ve her gün kaydedilir ve Kaplan-Meier Eğrideki özetlenmiştir. Bu sonuçlar, intravenöz enjeksiyon yolu ile SWCNT-anti-MALAT1 tedavi anti-MALAT1 oligos tümör hücreleri için etkili bir şekilde teslim sonucuna vardı. Biz, o zaman, tümör yükü sınırlı ve fareler'ın katlanacak genişletilmiş (p = 0.04) beklendiği gibi hangi tüp bebek sonuçlarına benzer. Herhangi bir önemli yan etkiler tedavinin fareler SWCNT-anti-MALAT1 enjeksiyon fareler için güvenli bir tedavi olduğunu belirtti tüm deneme süresi boyunca bulamadık; Bu nedenle, SWCNT anti-MALAT1 için güvenli ve güvenilir içinde vivo teslim sistemi.
Resim 1 : Sentez, emme, Şematik diyagramı ve bir SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer oligo içinde vivo ayrılma. (A)SWCNT DSPE-PEG2000-aminler ile functionalized olup, daha sonra anti-MALAT1-Cy3 Sulfo-LC-SPDP tarafından aracılı disülfür bağ üzerinden ile Birleşik. (B) SWCNT Birleşik anti-MALAT1 bir fare kuyruğu damar yolu ile MM.1S-Luc-mCherry hücreleri ile içine enjekte ettiler. (C) SWCNT Birleşik anti-MALAT1 fosfolipid bilayer membran ekleme veya endositoz ile nüfuz eder. (D) SWCNT-anti-MALAT1 içinde erken endosomes sonra emme hücreleri tarafından verilen; daha sonra erken endosome geç endosome için olgunlaştı ve bir endolysosome oluşturmak için lysosome ile birleştirilir. Endolysosome anti-MALAT1 SWCNT üzerinden disülfit bağı kırarak serbest bırakmak yardımcı olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : SWCNT-anti-MALAT1 ile en az toksisite verimli bir şekilde teslim edildi ve Apoptozis MM hücre hatlarında indüklenen. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo veya SWCNT kumandalı oligo Lipofectamine tarafından sırasıyla H929 ve MM.1S hücre transfected. 48 saat sonra biz hücreleri (A) MALAT1 ifade analizi qRT-PCR (B) apoptosis Analizi tarafından akış sitometresi tarafından toplanan ve. (C) H929-GFP ve MM.1S-GFP hücreleri için 48 saat SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 ile birlikte kültürlü vardı; teslimat verimliliği floresan mikroskop tarafından tespit edilmiştir (ölçek çubukları = 100 µm). (D) ifade düzey ofMALAT1 qRT-PCR, o başarılı bir şekilde H929 ve MM.1S hücrelerinde yere düştü olduğunu gösterdi tarafından algılanan (** p < 0,01, *** p < 0.001). (E) SWCNT ve tedavi kontrol bir kültür ortamı farklı dozlarda BMEC-1 hücrelerinin içine eklenmiştir. Belgili tanımlık hızla çoğalmak bir hücre canlılığı tahlil kiti kullanılarak ölçüldü. Bu rakam Hu vd.16' dan değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : SWCNT-anti-MALAT1 MM MM.1S hücre inşa Dissemine fare modelinde büyüyen miyelom bastırılır. (A)5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry hücreleri intravenöz radyasyonlu SCID-bej fareler (her grup yedi); kuyruk damarlar enjekte SWCNT-anti-MALAT1 veya SWCNT-kontrol çözümü 50 μL her 7 günde MM.1S hücre enjeksiyon sonra 7 günden kuyruk ven yoluyla enjekte. IVIS tümör büyümesini izlemek için kullanıldı. (B) Hind kol felç ve tümör yükünü bitiş noktaları kullanılan ve hayatta kalma veri bir Kaplan-Meier analiz tarafından analiz edildi. Bu rakam Hu değiştirildi vd.16. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanıt lncRNAs kanserler, MM7,8,9dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik ve patofizyolojik yordamlarda yönetmelikte yer almak göstermiştir; Onlar antianlamlı oligonucleotides20,21,22tarafından gerçekleştirilebilir kanser tedavisi için hedef olma potansiyeline sahip. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) fomivirsen sitomegalovirüs retinitis23, mipomersen için homozigoz ailesel hiperkolesterolemi24, nusinersen için de dahil olmak üzere birkaç antianlamlı oligonükleotid uyuşturucu onayladı Spinal kas atrofisi25ve eteplirsen Duchenne kas distrofisi26. Bu çalışmada 2'-OMe-RNA ile anti-MALAT1 gapmer DNA değiştirilebilir ve fonksiyonel SWCNT ile Birleşik. SWCNT taşır ve anti-MALAT1 oligos sadece oligo-hedef olarak esneklik ve birden çok yükleme nedeniyle benzeşme geliştirilmiş ama aynı zamanda oligos stabilize ve nükleaz yıkımı sırasında teslim27 önlemek yardımcı bir servisi olarak teslim eder .
SWCNTs yüzeyi uygun bir değişiklik o güvenilir reinforcing fizyolojik alakalı, sulu ortamlarda almak ve onların biodistribution28,29teşvik yardımcı olabilir. Biz DSPE-PEG2000-Amin SWCNT üzerinde grefti ve bu sulu çözünürlük artırmak için gösterilmiştir, SWCNT değiştirmek için kullanılır ve ayrıca, biyolojik medya30' u Aglomerasyon olmadan mükemmel kararlılık gösterdi. Sulfo-LC-SPDP bir crosslinker disülfür bağlantı yoluyla anti-MALAT1 gapmer DNA bağlamak ve bundan sonra hücrelere teslim functionalized SWCNT yardımcı deneyinde olarak kullanılmıştır. Bir kez SWCNT MM hücrelerde nüfuz, sonra geç endosomes (pH ~ 5.0) tarafından bir düşük pH değeri31eşlik için olgunlaştı erken endosomes (pH ~ 6.0), çekmiş. PEG bağlantı bağ pH stabil avantajdır > 6, ama PEG bağlı uyuşturucu % 75-95'ph az 5.532,33,34olunca 2 saat içinde piyasaya çıktı. Endosomes SWCNT-anti-MALAT1 taşıyan bir endolysosome kurmaya organellerin (pH ~ 4.5) ve sonra disülfür bağları tarafından en iyi şekilde düşük pH35etkinleştirildi lizozomal thiol redüktaz katalize birleştirilir. Bu, daha sonra ücretsiz anti-MALAT1 gapmer DNA serbest. Deney sonuçlarına tüp bebek ve içinde vivo göre SWCNT SWCNT-anti-MALAT1 etkili bir şekilde teslim ve anti-MALAT1 tüp bebek işlevine benzer şekilde hareket oldu.
Fosfolipid bilayer functionalized SWCNTs geçisi iki desen üzerinden: ekleme36,37 ve endositoz38,39. Bu yordamlar bu nedenle azaltılmış hücre zarlarında, istikrar rahatsız olmadan SWCNT toksisite hücrelere gönderileri teslim SWCNT yardımcı olur. SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) 50 µL her Mouse (~ 20 g); enjekte Böylece, son ilaç konsantrasyonu 0.1 mg/kg, çok biz toksisite deneyleri (2 mg/L ve 4 mg/L) kullanılan doz daha düşük olduğu idi. Önceki sonuçları incelendi, SWCNT benzer bir etki tedavi denetimi (örneğin, Lipofectamine) olarak hücre büyümesi ve canlılığı, dozlarda eşleştirdi. Tedavi denetimi hücre transfection için ortak bir reaktif ve sınırlı ve kabul edilebilir bir toksisite hücrelere sahip olduğuna inanılmaktadır; Böylece, SWCNT sadece normal hücrelerin en az bir toksisite inanıyoruz.
Antianlamlı oligonucleotides için bir servisi metabolizma SWCNT, güvenliği için başka bir önemli unsurlardan biridir. Functionalized SWCNT çoğunlukla böbrek, glomerular ve borulu toksisite40olmadan aracılığıyla atılır kanıtlanmıştır. Biz did değil bulmak böbrek fonksiyon bozukluğu ile ilgili belirtiler, oliguria, anuria, ödem, böbrek, Görünüm değişiklikleri gibi vs, SWCNT enjeksiyon kabul farelerde. Böylece, SWCNTs hiçbir toksisite etkisi herhangi bir anormal birikimi nedeniyle normal böbrek fonksiyonu ile bir fare var.
Biz anti-anlamda oligonucleotides lncRNA functionalized SWCNT ile hedefleme eşlenik için ilk sırada ve MM tedavisi için kullanabilirsiniz. SWCNT tutarlı sembolik, isteğe bağlı çapı ve uzunluğu dağıtım vardır roman nanomaterial türüdür. Functionalization tedavi sonra SWCNTs su çözünürlük ve biyouyumluluk geliştirmek ve hücre membran aracılığıyla çok sayıda kargo böylece ilaç dağıtım artan ve tedavi etkisi artırılması için ideal bir biyolojik servisi olmak. Buna ek olarak, SWCNT Anti-anlamda oligonükleotid molekülleri nükleaz sindirim1stabilize. Sonuçlar gösterdiği gibi functionalized SWCNT-anti-MALAT1 MALAT1 MM hücrelere verimli bir şekilde teslim ve MM büyüme önemli ölçüde hücre hatları tüp bebek ve dissemine fare modeli içinde vivo inhibe. Şimdiye kadar herhangi bir toksisite nedeniyle bu deneyler tedavisinde SWCNT gözlemleme. Bu çalışmada SWCNT antianlamlı oligonükleotid uyuşturucu için güvenli ve etkili teslim araç ve hastalarda terapötik Moleküller için bir taşıyıcı olarak kullanılacak potansiyeli gösteriyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Lerner Araştırma Enstitüsü proteomik, genomik ve görüntüleme göbek onların yardım için teşekkür ederiz ve destek. Fonlama: Bu eser mali NIH/ncı hibe R00 CA172292 (J.J.Z.) ve başlangıç fonlar (için J.J.Z.) ve klinik ve çevirim bilim işbirlikçi (CTSC) Case Western Reserve Üniversitesi temel kullanımı Pilot hibe (için J.J.Z.) tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri SIG grant 1S10OD019972-01 ile fon ile satın alınmış Leica SP8 confocal mikroskop kullanılmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
