Summary
Questo manoscritto descrive la sintesi di un nanotubo di carbonio a parete singola (SWCNT)-coniugato MALAT1 gapmer antisenso del DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), che dimostra la consegna affidabile del SWCNT e il potente effetto terapeutico di anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Metodi utilizzati per la sintesi, la modifica, la coniugazione e iniezione di SWCNT-anti-MALAT1 sono descritti.
Abstract
I nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono un nuovo tipo di nanoparticelle, che sono stato utilizzato per fornire più tipi di farmaci nelle cellule, come proteine, oligonucleotidi e droghe sintetiche della piccolo-molecola. Il SWCNT ha dimensioni personalizzabili, un'ampia area superficiale e non può vincolare in modo flessibile con farmaci attraverso diverse modifiche sulla sua superficie; Pertanto, è un sistema ideale per il trasporto di farmaci nelle cellule. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è un cluster di RNA non codificante più di 200 nt, che non può essere tradotto in proteina, ma svolgono un ruolo importante nei processi biologici e fisiopatologici. Trascrizione di adenocarcinoma polmonare metastasi-collegata 1 (MALAT1) è un lncRNA altamente conservata. È stato dimostrato che i livelli elevati di MALAT1 sono relazionati con la prognosi difficile di vari cancri, compreso il mieloma multiplo (MM). Abbiamo rivelato che MALAT1 regola la morte delle cellule e la riparazione del DNA in MM; così, MALAT1 può essere considerato come un obiettivo terapeutico per MM. Tuttavia, la consegna efficiente dell'oligo antisenso per inibire/atterramento MALAT1 in vivo è ancora un problema. In questo studio, abbiamo modificare il SWCNT con PEG-2000 e coniugato un oligo di anti-MALAT1 ad esso, testare la consegna di questo composto in vitro, iniettare per via endovenosa un modello di topo MM diffuso e osservare un'inibizione significativa di progressione di MM, che indica tale SWCNT è una navetta di consegna ideale per gapmer anti-MALAT1 del DNA.
Introduction
Il SWCNT è un nanomateriale romanzo in grado di fornire vari tipi di droghe, come acidi nucleici, proteine e piccole molecole stabile ed efficiente con ideale tollerabilità e minima tossicità in vitro1 e vivo in2. Un SWCNT funzionalizzati ha solubilità ottima biocompatibilità e acqua, può essere utilizzato come un servizio di navetta per molecole più piccole e può portarli per penetrare la membrana cellulare3,4,5.
lncRNAs sono un cluster di RNA (> 200 nt) che sono trascritti dal genoma al mRNA ma non può essere tradotto in proteine. La prova aumentante ha dimostrato che lncRNAs partecipano alla regolazione dell' espressione di gene6 e sono coinvolti nell'iniziazione e progressione della maggior parte dei tipi di cancro, tra cui MM7,8,9. MALAT1 è una trascrizione nucleare arricchito non codificante, 2 (NEAT2) e un lncRNA altamente conservato10. MALAT1 è inizialmente riconosciuto in metastatico del polmone non a piccole cellule (NSCLC) cancro11, ma ha stato sovraespresso in numerosi tumori5,12,13; è uno della più altamente espressi lncRNAs ed è correlata con una prognosi difficile in MM8,14. Il livello di espressione di MALAT1 è significativamente più alto in pazienti con MM extramedullary corso mortale rispetto a quelli diagnosticati solo come MM15.
In uno studio precedente, abbiamo confermato che anti-MALAT1 oligos robustamente portare a danni al DNA e l'apoptosi in MM16 utilizzando oligonucleotidi antisenso di DNA gapmer MALAT1 di targeting (anti-MALAT1) in cellule di MM. Il DNA di gapmer è composto di DNA antisenso e collegato da 2'-OMe-RNA, che ha potuto richiamare MALAT1 fenditura da RNasi H attività una volta legato17. L'efficienza di consegna in vivo di oligo antisenso ancora limita il suo uso clinico.
Per verificare la consegna effetto di SWCNT per anti-MALAT1 gapmer i oligos, l'anti-MALAT1 gapmer DNA è coniugato a DSPE-PEG2000-ammina funzionalizzati SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 allora è iniettato per via endovenosa in un modello di topo diffusa MM; un'inibizione notevole è osservata dopo quattro trattamenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali erano pre-approvati da la Cleveland Clinic IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care).
1. sintesi di SWCNTs funzionalizzati
- Mescolare 1 mg di SWCNTs, 5mg di DSPE-PEG2000-ammina e 5 mL di acqua sterilizzata nucleasi-free in una fialetta di scintillazione (20 mL). Agitare bene per dissolvere completamente tutti i reagenti.
- Sottoporre ad ultrasuoni il flaconcino in un sonicatore vasca di acqua ad un livello di potenza di 40 W per 1 h a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiare l'acqua ogni 20 min per evitare il surriscaldamento). E centrifugare a 24.000 x g per 6 h, quindi raccogliere il supernatante. Questa soluzione SWCNT funzionale può essere memorizzata a 4 ° C per 2 mesi.
- Aggiungere 1 mL di soluzione SWCNT dal passaggio 1.2 a un dispositivo di filtro centrifugo di MWCO kDa 100, seguita da 4 mL di acqua sterilizzata nucleasi-free. Centrifugare per 10 min 4.000 x g a RT per rimuovere extra DSPE-PEG2000-ammina. Ripetere l'aggiunta di 4 mL di acqua e la centrifugazione 5 x. Più di 0,5 mL di soluzione SWCNT residuo sarà lasciato nel filtro dopo ogni centrifugazione.
- Misurare la concentrazione della soluzione SWCNT avanzata nel filtro utilizzando uno spettrometro UV/VIS a 808 nm dopo il lavaggio finale. La concentrazione finale è in genere circa 50 mg/L (calcolati secondo il metodo sviluppato da Kam et al.18).
Nota: Assicurarsi che SWCNTs DSPE-PEG-funzionalizzati sono solubili in acqua dopo passo 1.4 e sono stabili in diverse soluzioni biologiche senza aggregazione visibile dopo poche settimane.
2. coniugazione del Anti-MALAT1 Gapmer DNA affiancata da 2'-O RNAs modificate per SWCNT funzionalizzati
- Aggiungere 0,5 mg di Sulfo-LC-SPDP in 450 µ l di DSPE-PEG2000-ammina funzionalizzati SWCNT. Aggiungere 50 µ l di PBS 1x 10 e poi incubare per 2 h a TA.
- Per rimuovere extra Sulfo-LC-SPDP, aggiungere la reazione dal punto 2.1 a un dispositivo di filtro centrifugo di MWCO kDa 100, seguita da 4 mL di acqua priva di nucleasi. Centrifugare per 10 min a 4.000 x g a RT. Repeat l'aggiunta di 4 mL di acqua e la centrifugazione 5x.
- Aggiungere 200 nM del tiolo-modificato anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA in 1,5 mL di soluzione commerciale di DTT e incubare per 90 min a RT. purificare il prodotto con una colonna di NAP-5, dopo il protocollo del produttore. Eluire l'anti-MALAT1-Cy3 con 500 µ l di sterilizzato nucleasi-free 1 x PBS.
Nota: Il SWCNT funzionalizzate possono essere memorizzati con DTT aggiunto, che potrebbe fendere i legami bisolfurico formati durante l'immagazzinaggio dei chitosani anti-MALAT1 gapmer del DNA. Il DTT aggiunto può essere rimosso da aNAP-5 colonna prima coniugazione con SWCNT. - Raccogliere la soluzione DSPE-PEG2000-ammina SWCNT sulfo-LC-SPDP-trattati lasciato nel filtro e diluirla con 500 µ l di soluzione anti-MALAT1-Cy3. Quindi, viene quindi incubato a 4 ° C per 24 h. Il coniugato SWCNT-anti-MALAT1 possono essere memorizzati a 4 ° C per 3 settimane. Seguendo la stessa procedura, il SWCNT coniugati con oligo antisenso scramble può essere sintetizzato e utilizzato come SWCNT-controllo.
3. coda vena iniezione di SWCNT-Anti-MALAT1
-
Generare un modello di topo diffusa di MM.
- Per ottenere i migliori risultati di confronto, in modo casuale organizzare 14 cenno del capo. Topi di CB17-Prkdcscid/J (8 settimane) in versione di prova o controllo gruppi (sette in ogni gruppo) con lo stesso rapporto maschio/femmina.
- Pulire la panchina di operazione e sterilizzarlo con alcool al 70%.
- Utilizzare una lampada di riscaldamento per riscaldare il mouse per aiutare la coda della vena per apparire. Reprimere il mouse correttamente con un dispositivo di ritenuta iniezione di coda.
- Iniettare 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry cellule in 50 µ l di PBS tramite la vena della coda senza anestesia. Premere il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool per 30 s. Mark il mouse iniettato e tornare a una gabbia pulita.
-
Iniziare il trattamento il giorno 7 dopo l'iniezione di cellule MM.1S.
- Iniettare 50 µ l di PBS contenente SWCNT-anti-MALAT1 nella vena della coda del mouse. Utilizzare PBS contenente SWCNT-controllo come un controllo.
- Premere il sito di iniezione con un batuffolo imbevuto di alcool per 30 s.
- Osservare l'emorragia locale sulla coda e il comportamento generale del mouse per 1 min e poi ritornare una gabbia pulita. Osservare tutto iniettati topi nuovamente prima di restituire la gabbia al rack, per assicurarsi che le iniezioni sono tollerate bene.
-
Ripetere l'iniezione ogni 7 giorni fino al termine dell'esperimento.
- Terminare l'esperimento quando si degrada la salute generale del mouse: quando non mangiare o bere, la comparsa delle zampe di pallide, qualsiasi sanguinamento sottocutaneo, una mancanza di respiro, diminuita attività, una paralisi degli arti inferiori, e/o di una massa palpabile nella addome è osservato.
4. valutazione della progressione della malattia
- Valutare lo stato generale dei topi ogni giorno dopo l'iniezione di cellule MM.1S-Luc-mCherry. Prestare particolare attenzione se i topi sviluppano paralizza degli arti inferiori.
-
Valutare la crescita del tumore usando un sistema di imaging in vivo 1 volta a settimana, prima dell'iniezione di SWCNT-anti-MALAT1.
- Preparare fresco 15 mg/mL D-luciferina con PBS 1X.
- Anestetizzare i topi con un vaporizzatore di isoflurane (3 – 5% per induzione e 1-3% per la manutenzione, a seconda dello stato dei topi).
- Iniettare 150mg/kg D-luciferina in ogni mouse intraperitonealmente, 5 min prima di formazione immagine; quindi, l'immagine i topi in posizione prona con uno spettro sistema di imaging.
- Raccogliere immagini sequenziali dei topi ogni 2 min, fino a quando non viene raggiunta la saturazione di luminescenza. Regolare l'intervallo di tempo in base al D-luciferina assorbimento/segnale.
- Utilizzare CO2 a sacrificare i topi una volta raggiunto il termine dell'esperimento.
-
Poiché si tratta di un modello diffuso MM, elaborare i topi come segue.
- Pesare il mouse prima della dissezione.
- Raccogliere il sangue periferico dal cuore per un dosaggio di esame emocromocitometrico completo (CBC) effettuato da una macchina di contatore di cellule del sangue. I conteggi dei globuli bianchi e globuli rossi, così come il rapporto dei linfociti, è indici primari.
- Isolare la milza e pesarlo. Calcolare il rapporto del peso della milza/corpo; Considera > 0.5% come ingrossamento della milza.
- Raccogliere i tessuti del midollo osseo, milza, linfonodi, rene e il tessuto con la metastasi visibile.
- Se il mouse ha sviluppato una paralisi degli arti inferiori, raccogliere la colonna vertebrale.
- Estrarre RNA e proteina da campioni di midollo osseo.
- Difficoltà tutti i rimanenti tessuti in formalina.
- Per la decalcificazione, immergere i campioni dell'osso in soluzione di EDTA 0,25 M (pH 8.0) per 5 giorni dopo 24 h di fissazione.
- Immergere tutti i campioni nell'alcool di 75% per l'archiviazione a lungo termine.
- Confrontare la potenza del segnale della luciferasi allo stesso tempo punti in due gruppi. Da entrambi i gruppi, è necessario registrare le date di sacrificio di ogni mouse e calcolare le curve di sopravvivenza dei due gruppi con il software.
Nota: Tutte le procedure sono riassunti nella Figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per dimostrare l'effetto di inibizione di anti-MALAT1 gapmer DNA in MM, abbiamo buttato giù l'espressione di MALAT1 e usato in cellule H929 e MM.1S. Quarantotto ore più tardi, le cellule sono stati raccolti per l'analisi dell'efficienza di abbattimento e lo stato di apoptosi in cellule trasfettate con anti-MALAT1 gapmer o controllo del DNA. risultati di qRT-PCR ha mostrati che anti-MALAT1 gapmer DNA abbattuto l'espressione di MALAT1 in cellule H929 e MM.1S in modo efficiente (Figura 2A). Lo stato dell'apoptosi è stato determinato mediante citometria a flusso, che ha rivelato gli apoptosi indotti MALAT1 giù-ha regolato significativamente (Figura 2B).
Questi risultati indicano che i oligos anti-MALAT1 inibiscono MM in modo efficace in vitro. Tuttavia, una metodo di consegna efficiente/navetta per i oligos anti-MALAT1 in vivo doveva essere sviluppato, che è anche l'ostacolo di oligo antisenso nell'applicazione clinica; da qui il nostro interesse SWCNT. SWCNT è un nanomateriale novello per il drug delivery, che può svilupparsi idrofilia e dissolubility dopo opportune modifiche; di conseguenza, può trasportare carichi in forme diverse, quali le droghe del oligonucleotide. Per convalidare l'efficienza di consegna di SWCNT in vivo, abbiamo prima funzionalizzati SWCNT con DSPE-PEG2000-ammine, che dotato di specificità idrofilia e l'associazione al SWCNT19. Quindi, questo SWCNT funzionale è stata trattata con sulfo-LC-SPDP creare gruppi solfidrilico libero, che verranno utilizzati per connettersi con l'oligo. Per coniugare l'oligo di anti-MALAT1 e il SWCNT sulfo-LC-SPDP-trattati, le estremità 5' di oligo l'anti-MALAT1 è stato modificato con gruppi tiolici (S-S); per visibilmente monitorare la consegna, le 3' estremità dell'oligo di anti-MALAT1 è stato modificato con cianina 3 (Cy3). Dopo tutti i passaggi di sintesi, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 è stato ottenuto (Figura 1)12. Quindi, è stato aggiunto al terreno di coltura di cellule H929-GFP e MM.1S-GFP per convalidare l'efficienza di consegna.
Come illustrato nella Figura 2C, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 è stato consegnato in modo efficiente nel nucleo delle cellule MM e ha soppresso significativamente il livello endogeno di MALAT1 in cellule sia H929 e MM.1S (Figura 2D). Per esaminare la tossicità e la sicurezza di SWCNT in cellule normali, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 è stato aggiunto nel mezzo delle cellule di BMEC-1 a diverse concentrazioni; Lipofectamine era il controllo del trattamento; mezzo di pianura è stato usato come controllo essenziale (Figura 2E). Quindi, attuabilità delle cellule è stato rilevato utilizzando un kit di test di vitalità delle cellule il giorno 1, giorno 2 e giorno 3. Nessuna differenza significativa nell'inibizione di attuabilità delle cellule è stata trovata fra SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 e il controllo di trattamento a diversi dosaggi e intervalli di tempo. Non c'era nessuna differenza rispetto al normale medio (NC), che indica che la tossicità di SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 è simile al controllo di trattamento, che ha una tossicità accettabile e limitata alle cellule normali ad alto dosaggio.
Successivamente, un modello umano-MM diffusa del topo è stato istituito per valutare gli effetti del trattamento di SWCNT-anti-MALAT1 in vivo. In primo luogo, ogni mouse di SCID-beige (di 8 settimane di vita) è stato iniettato con 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry cellule per via endovenosa (Figura 3). Un totale di 14 topi sono stati iniettati con cellule MM.1S; fra loro, sette topi erano disposte in modo casuale in un gruppo di trattamento SWCNT-anti-MALAT1-Cy3, e altri sette sono stati nel gruppo di controllo. Sia SWCNT-anti-MALAT1 e i oligos SWCNT-controllo erano sciolto in 0,5 mL di 1X PBS e iniettati attraverso le vene di coda 7 giorni dopo l'iniezione delle cellule del tumore. Il trattamento di SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 è stato ripetuto ogni 7 giorni fino al termine dell'esperimento. Per valutare il carico del tumore, il segnale di luciferina è stato osservato da un sistema imaging in vivo (IVIS) 30 min dopo l'iniezione di luciferina 1 x una settimana prima dell'iniezione di SWCNT-oligo. Abbiamo trovato che i segnali di luciferina dei topi nel gruppo del trattamento SWCNT-anti-MALAT1 erano notevolmente inferiori rispetto a quelli del gruppo di trattamento SWCNT-controllo dopo 21 giorni di trattamento (da giorno 28). Loro stato di salute e la sopravvivenza è stato controllato e registrato ogni giorno e riassunte in una curva di Kaplan-Meier. Da questi risultati, abbiamo concluso che il trattamento SWCNT-anti-MALAT1 via endovenosa può fornire i oligos anti-MALAT1 alle cellule del tumore in modo efficace. Abbiamo, quindi, limitato l'onere di tumore ed esteso le durate della vita dei topi (p = 0,04) come previsto, che è simile ai risultati in vitro. Non abbiamo trovato effetti collaterali significativi del trattamento nei topi durante il periodo intero esperimento, che ha indicato che l'iniezione di SWCNT-anti-MALAT1 è un trattamento sicuro per topi; di conseguenza, SWCNT è un sistema sicuro e affidabile consegna in vivo per anti-MALAT1.
Figura 1 : Diagramma schematico della sintesi, assorbimento, e dissociazione in vivo di un oligo gapmer SWCNT-anti-MALAT1-Cy3. (A) SWCNT era funzionalizzati con DSPE-PEG2000-ammine e, successivamente, coniugato con anti-MALAT1-Cy3 tramite legame disolfuro mediata da Sulfo-LC-SPDP. (B) SWCNT-coniugato anti-MALAT1 è stato iniettato in un topo con cellule MM.1S-Luc-mCherry via vena caudale. (C) SWCNT-coniugato anti-MALAT1 penetra la membrana di bilayer del fosfolipide attraverso inserimento o endocitosi. (D) SWCNT-anti-MALAT1 è stato inseriti all'interno di early endosomes dopo assorbimento dalle cellule; quindi, l'endosoma precoce maturato per un endosoma tardivo e si fuse con un lisosoma per formare un endolysosome. Il endolysosome aiuta versione anti-MALAT1 dalla SWCNT di rompere il legame disolfuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : SWCNT-anti-MALAT1 è stato consegnato in modo efficiente con minima tossicità e induce apoptosi in linee cellulari di MM. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo o oligo SWCNT-controllo transfected di Lipofectamine nelle cellule H929 e MM.1S, rispettivamente. Quarantotto ore più tardi, abbiamo raccolto le cellule per (A), l'analisi dell'espressione di MALAT1 mediante qRT-PCR e analisi di apoptosi (B) tramite flusso cytometry. (C) H929-GFP e MM.1S-GFP cellule erano co-coltivate con SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 per 48 ore; l'efficienza di consegna è stata determinata mediante microscopio a fluorescenza (le barre di scala = 100 µm). (D) la ofMALAT1 del livello di espressione è stata rilevata mediante qRT-PCR, che ha mostrato che con successo è stato abbattuto in cellule H929 e MM.1S (* * p < 0.01, * * * p < 0,001). SWCNT (E) e il controllo di trattamento sono stati aggiunti in un terreno di coltura delle cellule di BMEC-1 a dosaggi diversi. La proliferazione è stata misurata utilizzando un kit di test di vitalità delle cellule. Questa figura è stata modificata da Hu et al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : SWCNT-anti-MALAT1 soppresso mieloma crescente nel modello di topo diffusa di MM.1S-cella-costruito MM. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry cellule sono state iniettate per via endovenosa nelle vene di coda di topi SCID-beige irradiati (sette in ogni gruppo); 50 µ l di una soluzione di SWCNT-controllo o SWCNT-anti-MALAT1 sono stati iniettati ogni 7 giorni via vena caudale dal 7 ° giorno dopo l'iniezione di cellule MM.1S. IVIS era utilizzato per monitorare la crescita del tumore. Onere di tumore e paralisi dell'arto posteriore (B) sono stati usati come punti finali, e i dati di sopravvivenza sono stati analizzati da un'analisi di Kaplan-Meier. Questa figura è stata modificata da Hu et al.16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La prova ha indicato che lncRNAs prendere parte nella regolazione di numerose procedure fisiologiche e patofisiologiche nei cancri, compreso MM7,8,9; Essi hanno il potenziale per essere mirati per il trattamento del cancro, che può essere realizzato da oligonucleotidi antisenso20,21,22. L'US Food and Drug Administration (FDA) ha approvato parecchie droghe di oligonucleotide antisenso, compreso fomivirsen per Citomegalovirus retinite23, mipomersen per ipercolesterolemia familiare omozigote24, nusinersen per atrofia muscolare spinale25ed eteplirsen per la distrofia muscolare di Duchenne26. In questo studio, abbiamo modificato il gapmer anti-MALAT1 del DNA con 2'-OMe-RNA e ha coniugato con SWCNT funzionale. Il SWCNT trasporta e trasporta i oligos anti-MALAT1 come un servizio di navetta, che non solo migliorato l'affinità della oligo-destinazione grazie alla sua flessibilità e caricamenti multipli ma anche stabilizzato i oligos e ha aiutato a prevenire il degrado della nucleasi durante la consegna27 .
Una modifica adatta sulla superficie di SWCNTs può farne ottenere disperdibilità affidabile in ambienti acquosi, fisiologicamente pertinenti e promuovere la loro biodistribuzione28,29. Abbiamo usato DSPE-PEG2000-ammina per modificare SWCNT, che è stata dimostrata per innesto su SWCNT e migliorare la solubilità in acqua di esso, e inoltre, ha mostrato un'eccellente stabilità senza agglomerazione in biological media30. Sulfo-LC-SPDP è stato utilizzato come un reticolante nell'esperimento, che ha aiutato SWCNT funzionalizzati per associare il gapmer anti-MALAT1 del DNA attraverso legame disolfuro e da allora in poi consegnarli nelle cellule. Una volta che il SWCNT penetrato nelle cellule MM, essi sono presi da early endosomes (pH ~ 6.0), che quindi maturato al tardi endosomi (pH ~ 5.0) accompagnati da un pH ridotto valore31. Il vantaggio del collegamento PEG è che il legame è stabile a pH > 6, ma fino a 75-95% del farmaco PEG-collegato è stato rilasciato entro 2 ore una volta che il pH è diventato meno di 5,532,33,34. Gli endosomi portando SWCNT-anti-MALAT1 si fuse con i lisosomi (pH ~ 4,5) per formare un endolysosome e poi al bisolfuro obbligazioni erano catalizzate dalla riduttasi del tiolo lysosomal, che è stata attivata in modo ottimale a basso pH35. Questo, successivamente, rilasciato gratuitamente anti-MALAT1 gapmer DNA. Secondo i risultati dell'esperimento in vitro e in vivo, il SWCNT consegnato SWCNT-anti-MALAT1 in modo efficace e ha aiutato agire allo stesso modo nella funzione di anti-MALAT1 in vitro.
Il pass di SWCNTs funzionalizzato attraverso bilayer del fosfolipide attraverso due modelli: inserimento36,37 ed endocytosis38,39. Queste procedure aiutano il SWCNT trasportare carichi nelle celle senza interrompere la stabilizzazione delle membrane cellulari, quindi ha ridotto la tossicità del SWCNT. Abbiamo iniettato 50 µ l di SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) in ogni mouse (~ 20 g); quindi, la concentrazione di farmaco finale era 0,1 mg/kg, che è molto più basso rispetto al dosaggio che abbiamo utilizzato in esperimenti di tossicità (2 mg/L e 4 mg/L). Come i precedenti risultati hanno dimostrato, SWCNT ha un effetto simile come il controllo di trattamento (ad es., Lipofectamine) sulla crescita delle cellule e redditività al abbinati i dosaggi. Il controllo di trattamento è un reagente comune per la transfezione delle cellule e si crede di avere una tossicità accettabile e limitata alle cellule; così, crediamo che SWCNT ha solo una minima tossicità per le cellule normali.
Come un servizio di navetta per oligonucleotidi antisenso, il metabolismo è un'altra considerazione importante per la sicurezza di SWCNT. È stato dimostrato che funzionalizzati SWCNT è escreto principalmente attraverso i reni, senza tossicità glomerulare e tubolare40. Non abbiamo trovato renali correlate a disfunzione sintomi, quali l'oliguria, anuria, edema, cambiamenti di aspetto del rene, ecc., in topi che accettano l'iniezione SWCNT. Così, SWCNTs avere effetti di tossicità a causa di qualsiasi accumulazione anormale in un mouse con una funzione normale del rene.
Siamo il primo a coniugare oligonucleotidi anti-senso lncRNA con SWCNT funzionalizzati di targeting e utilizzarlo per il trattamento di MM. SWCNT è un tipo di romanzo nanomateriale, che ha la chiralità coerente, diametro opzionale e la distribuzione di lunghezza. Dopo il trattamento di funzionalizzazione, SWCNTs sviluppare solubilità in acqua e biocompatibilità e diventare una navetta biologica ideale per fornire numerose carico attraverso la membrana cellulare, quindi aumentando la distribuzione del farmaco e potenziare l'effetto del trattamento. Inoltre, SWCNT può stabilizzare molecole di oligonucleotidi anti-senso da nucleasi digestione1. Come mostrano i risultati, funzionalizzati SWCNT-anti-MALAT1 consegnato MALAT1 in cellule di MM in modo efficiente e ha inibito la crescita di MM drammaticamente in linee cellulari in vitro e in un modello di topo diffusa in vivo. Finora, non abbiamo osservato alcuna tossicità dovuto il trattamento SWCNT in questi esperimenti. Questo studio dimostra che SWCNT è un veicolo di consegna sicura ed efficace per le droghe di oligonucleotide antisenso e ha il potenziale per essere utilizzato come vettore per molecole terapeutiche nei pazienti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Lerner Research Institute proteomica, genomica e imaging core per la loro assistenza e supporto. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da NIH/NCI grant R00 CA172292 (per J.J.Z.) e fondi di Start-up (a J.J.Z.) e la clinica e traslazionale Science Collaborative (CTSC) della Case Western Reserve University Core utilizzazione pilota Grant (a J.J.Z.). Questo lavoro utilizzata il microscopio confocale Leica SP8 che è stato acquistato con un finanziamento da istituti nazionali di salute SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
