Este manuscrito descreve a síntese de um nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA do oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demonstra a entrega confiável do SWCNT e o potente efeito terapêutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para síntese, modificação, conjugação, e injeção de SWCNT-anti-MALAT1 são descritos.
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Artigo de método
Repressão de crescimento de células do mieloma múltiplo na Vivo por nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-entregue MALAT1 antisentido Oligos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT) é um novo tipo de nanopartículas, que tem sido usado para entregar vários tipos de drogas em células, como proteínas, oligonucleotides e drogas sintéticas da pequeno-molécula. O SWCNT tem dimensões personalizáveis, uma grande área superficial e com flexibilidade pode vincular com drogas através de diferentes modificações na sua superfície; Portanto, é um sistema ideal para o transporte de drogas em células. Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) são um conjunto de RNA não-codificante mais de 200 nt, que não pode ser convertido em proteína, mas desempenham um papel importante nos processos biológicos e fisiopatológicos. Transcrição de adenocarcinoma do pulmão metástase-associado 1 (MALAT1) é uma lncRNA altamente conservada. Foi demonstrado que níveis mais elevados de MALAT1 estão relacionados com o mau prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo mieloma múltiplo (MM). Temos revelou que MALAT1 regula a morte de reparação e célula de DNA em MM; assim, o MALAT1 pode ser considerado como um alvo terapêutico para MM. No entanto, a entrega eficiente do oligo antisentido para inibir/nocaute MALAT1 in vivo ainda é um problema. Neste estudo, podemos modificar o SWCNT com PEG-2000 e conjugado um oligo anti-MALAT1 para isso, testar a entrega deste composto em vitro, injetá-lo por via intravenosa em um modelo de mouse MM disseminado e observar uma significativa inibição da progressão de MM, o que indica Esse SWCNT é um vaivém de entrega ideal para gapmer anti-MALAT1 DNA.
Introdução
O SWCNT é um romance nanomaterial que pode fornecer vários tipos de drogas, tais como pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos, estàvel e eficientemente com ideal tolerabilidade e toxicidade mínima em vitro1 e2de in vivo. Um SWCNT funcionalizado tem grande solubilidade em água e biocompatibilidade, pode ser usado como um serviço de transporte para moléculas menores e pode transportá-los para penetrar a membrana celular3,4,5.
lncRNAs são um aglomerado de RNA (> 200 nt) que são transcritas do ge....
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Protocolo
Todos os experimentos envolvendo animais foram pré-aprovados pela Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso e cuidado institucional do Animal).
1. síntese de SWCNTs funcionalizados
- Mistura de SWCNTs de 1 mg, 5 mg de DSPE-PEG2000-amina e 5 mL de água esterilizada nuclease-livre, em um frasco de cintilação (20 mL). Sacode bem para dissolver todos os reagentes completamente.
- Proceda à sonicação do frasco em um sonicador de banho de água a um nível de potência de 40 W por 1h à temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, mudam a cada 20 min de água para evitar o superaquecimento). Em seguida, centrifugá-lo a 24.000 x g durante....
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Resultados
Para demonstrar o efeito de inibição de anti-MALAT1 gapmer DNA em MM, que derrubou a expressão de MALAT1 e usado em células H929 e MM.1S. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram coletadas para a análise da eficiência do knock-down e o status de apoptose em células transfectadas com anti-MALAT1 gapmer ou controle de DNA. qRT-PCR os resultados mostraram que anti-MALAT1 gapmer DNA derrubou a expressão de MALAT1 nas células H929 e MM.1S com eficiência(F.......
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Discussão
A evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação de numerosos processos fisiológicos e fisiopatológicos em cânceres, incluindo MM7,8,9; Eles têm o potencial para ser direcionado para o tratamento de câncer, que pode ser realizado por oligonucleotides antisentido20,21,22. O E.U. Food and Drug Administration (FDA) aprovou várias dr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer o Lerner Research Institute proteômica, genômica e núcleos de imagens para sua assistência e apoio. Financiamento: Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH/ICN grant R00 CA172292 (J.J.Z.) e fundos de start-up (para J.J.Z.) e clínica e translacional ciência colaborativa (CTSC) do caso Western Reserve University núcleo utilização piloto Grant (para J.J.Z.). Este trabalho utilizou o microscópio confocal Leica SP8 que foi comprado com financiamento da concessão de institutos nacionais de saúde SIG 1S10OD019972-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| sonicator de banho | VWR | 97043-992 | |
| Filtro centrífugo de 4 mL | Espectrômetro Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| /VIS | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | coeficiente de extinção de 0,0465 L/mg/cm a 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| solução de TDT | Millipore-Sigma | 43815 | |
| coluna NAP-5 | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| sistema de imagem in vivo | PerkinElmer | ||
| NOD. Camundongos CB17-Prkdcscid/J | Charles River lab | 250 | |
| Citômetro de fluxo | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamina | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Soro fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 meio | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | sintetizado por IDT Companhia | 5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3' | |
| MALAT1-QR: | sintetizado pela IDT Company | 5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3' | |
| GAPDH-QF: | sintetizado pela IDT Company | 5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3' | |
| GAPDH-QR: | sintetizado pela IDT Company | 5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3' | |
| PCR quantitativo usando SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid kit de síntese de cDNA de primeiro suporte | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | sintetizado pela IDT Company | 5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3' | |
| Kit de Ensaio de Viabilidade Celular | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Kit de Ensaio de Viabilidade Celular |
| accuSkan GO UV/Vis Microplaca Espectrofotômetro | Thermo Fisher Scientific Filtro | ||
| centrífugo | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| software SPSS | IBM | versão 24.0 | |
| D-Luciferina | Millipore-Sigma | L9504 |
Referências
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al.
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Reimpressões e permissões
