Summary
Este manuscrito descreve a síntese de um nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA do oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demonstra a entrega confiável do SWCNT e o potente efeito terapêutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para síntese, modificação, conjugação, e injeção de SWCNT-anti-MALAT1 são descritos.
Abstract
O nanotubo de carbono de parede simples (SWCNT) é um novo tipo de nanopartículas, que tem sido usado para entregar vários tipos de drogas em células, como proteínas, oligonucleotides e drogas sintéticas da pequeno-molécula. O SWCNT tem dimensões personalizáveis, uma grande área superficial e com flexibilidade pode vincular com drogas através de diferentes modificações na sua superfície; Portanto, é um sistema ideal para o transporte de drogas em células. Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) são um conjunto de RNA não-codificante mais de 200 nt, que não pode ser convertido em proteína, mas desempenham um papel importante nos processos biológicos e fisiopatológicos. Transcrição de adenocarcinoma do pulmão metástase-associado 1 (MALAT1) é uma lncRNA altamente conservada. Foi demonstrado que níveis mais elevados de MALAT1 estão relacionados com o mau prognóstico de vários tipos de câncer, incluindo mieloma múltiplo (MM). Temos revelou que MALAT1 regula a morte de reparação e célula de DNA em MM; assim, o MALAT1 pode ser considerado como um alvo terapêutico para MM. No entanto, a entrega eficiente do oligo antisentido para inibir/nocaute MALAT1 in vivo ainda é um problema. Neste estudo, podemos modificar o SWCNT com PEG-2000 e conjugado um oligo anti-MALAT1 para isso, testar a entrega deste composto em vitro, injetá-lo por via intravenosa em um modelo de mouse MM disseminado e observar uma significativa inibição da progressão de MM, o que indica Esse SWCNT é um vaivém de entrega ideal para gapmer anti-MALAT1 DNA.
Introduction
O SWCNT é um romance nanomaterial que pode fornecer vários tipos de drogas, tais como pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucleicos, estàvel e eficientemente com ideal tolerabilidade e toxicidade mínima em vitro1 e2de in vivo. Um SWCNT funcionalizado tem grande solubilidade em água e biocompatibilidade, pode ser usado como um serviço de transporte para moléculas menores e pode transportá-los para penetrar a membrana celular3,4,5.
lncRNAs são um aglomerado de RNA (> 200 nt) que são transcritas do genoma de mRNA, mas não pode ser traduzido em proteínas. Aumentando a evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação da expressão de gene6 e estão envolvidas na iniciação e progressão da maioria dos tipos de câncer, incluindo MM7,8,9. MALAT1 é uma transcrição não-codificante nuclear enriquecido 2 (NEAT2) e um altamente conservadas lncRNA10. MALAT1 é inicialmente reconhecido em metastásico pulmão não-pequenas células de câncer (NSCLC)11, mas tem sido overexpressed em inúmeros tumores5,12,13; é um do mais altamente expressa lncRNAs e está correlacionada com um prognóstico pobre em MM8,14. O nível de expressão de MALAT1 é significativamente maior nos pacientes MM extra-medulares curso fatal em relação aos diagnosticados apenas como MM15.
Em um estudo anterior, confirmamos que anti-MALAT1 oligos robustamente originar danos ao DNA e apoptose em MM16 usando oligonucleotides antisentido de DNA de gapmer MALAT1 de segmentação (anti-MALAT1) em células MM. O DNA de gapmer é composto de DNA antisentido e ligado por 2'-OMe-RNAs, que poderiam solicitar MALAT1 de clivagem por RNase H atividade uma vez acoplada17. A eficiência de entrega in vivo de oligos antisentidos ainda limita seu uso clínico.
Para testar a entrega o efeito de SWCNT para anti-MALAT1 gapmer oligos, o anti-MALAT1 gapmer DNA é conjugado a DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. O SWCNT-anti-MALAT1 então é injetado por via intravenosa em um modelo de rato disseminadas MM; observa-se uma inibição marcante depois de quatro tratamentos.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram pré-aprovados pela Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso e cuidado institucional do Animal).
1. síntese de SWCNTs funcionalizados
- Mistura de SWCNTs de 1 mg, 5 mg de DSPE-PEG2000-amina e 5 mL de água esterilizada nuclease-livre, em um frasco de cintilação (20 mL). Sacode bem para dissolver todos os reagentes completamente.
- Proceda à sonicação do frasco em um sonicador de banho de água a um nível de potência de 40 W por 1h à temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, mudam a cada 20 min de água para evitar o superaquecimento). Em seguida, centrifugá-lo a 24.000 x g durante 6 h e recolher o sobrenadante. Esta solução SWCNT funcional pode ser armazenada a 4 ° C durante 2 meses.
- Adicione 1 mL de solução SWCNT da etapa 1.2 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguido de 4 mL de água esterilizada nuclease-livre. Centrifugação por 10min a 4.000 x g em RT para remover extra DSPE-PEG2000-amina. Repetir a adição de 4 mL de água e a centrifugação 5 x. Mais de 0,5 mL de solução SWCNT sobra será deixado no filtro após cada centrifugação.
- Medir a concentração da solução SWCNT sobra no filtro usando um espectrômetro UV/VIS em 808 nm após a lavagem final. A concentração final é normalmente cerca de 50 mg/L (calculado de acordo com o método desenvolvido por Kam et al.18).
Nota: Certifique-se que DSPE-PEG-acrescida SWCNTs são solúveis em água após etapa 1.4 e são estáveis em soluções biológicas diferentes sem agregação visível após algumas semanas.
2. conjugação de Anti-MALAT1 Gapmer DNA ladeado por 2'-O RNAs modificados para SWCNT Funcionalizado
- Adicione 0,5 mg de Sulfo-LC-SPDP em 450 µ l de DSPE-PEG2000-amina acrescida SWCNT. Adicionar 50 µ l de PBS de x 10 e então incubar durante 2 h em RT
- Para remover extra Sulfo-LC-SPDP, adicione a reação da etapa 2.1 para um dispositivo de filtragem centrífuga de MWCO kDa 100, seguida por 4 mL de água livre de nuclease. Centrifugar durante 10 min a 4.000 x g em RT. Repeat a adição de 4 mL de água e a centrifugação x 5.
- Adicionar 200 nM thiol-modificado Cy3-anti-MALAT1 gapmer DNA em 1,5 mL de solução comercial de TDT e incubar durante 90 min no RT. Purify o produto com uma coluna de NAP-5, seguindo o protocolo do fabricante. Eluir o anti-MALAT1-Cy3 com 500 µ l de esterilizado nuclease-free 1 x PBS.
Nota: O SWCNT funcionalizado pode ser armazenado com TDT adicionado, que pode cleave dissulfeto formado durante o armazenamento do anti-MALAT1 de thiolated gapmer DNA. A DTT adicionado pode ser removido por aNAP-5 coluna antes de conjugação com SWCNT. - Recolher a solução de DSPE-PEG2000-amina SWCNT sulfo-LC-SPDP-Tratado deixada no filtro e dilui-lo com 500 µ l de solução de Cy3-anti-MALAT1. Em seguida, incube a 4 ° C por 24 h. O conjugado SWCNT-anti-MALAT1 pode ser armazenadas a 4 ° C por 3 semanas. Seguindo o mesmo procedimento, o SWCNT conjugado com oligo antisentido scramble pode ser sintetizado e utilizado como SWCNT-controle.
3. cauda veia injeção de SWCNT-Anti-MALAT1
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Gere um modelo de rato disseminadas MM.
- Para alcançar os melhores resultados da comparação, aleatoriamente organize 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J ratos (8 semanas de idade), em julgamento ou controle grupos (sete em cada grupo) com a mesma relação macho/fêmea.
- Limpar o banco de operação e esterilize-a com álcool a 70%.
- Use uma lâmpada de aquecimento para aquecer o mouse para ajudar a cauda veia para aparecer. Contenha o mouse corretamente com uma retenção de injeção de cauda.
- Injete células de 5 x 106 mCherry-MM.1S-Luc em 50 µ l de PBS na veia da cauda sem anestesia. Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool para Mark s. 30 o mouse injetado e devolvê-lo para uma gaiola limpa.
-
O tratamento tem início no dia 7 após a injeção de células MM.1S.
- Injete 50 µ l de PBS contendo SWCNT-anti-MALAT1 para a veia da cauda do rato. Uso PBS contendo SWCNT-controle como um controle.
- Pressione o local da injeção com um algodão embebido em álcool por 30 s.
- Observar o sangramento local na cauda e o comportamento geral do rato por 1 min e depois devolvê-lo para uma gaiola limpa. Observe tudo injetados ratos novamente antes de retornar a gaiola ao rack, para certificar-se de que as injeções são toleradas bem.
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Repeti a injeção a cada 7 dias até o término do experimento.
- Encerrar o experimento quando degrada a saúde geral do mouse: quando não comer ou beber, a aparência de patas pálidas, qualquer hemorragia subcutânea, uma falta de ar, diminuição da atividade, uma paralisia dos membros inferiores, e/ou uma massa palpável na abdômen é observado.
4. avaliação da progressão da doença
- Avalie o estado geral dos ratos todos os dias após a injeção de células de mCherry-MM.1S-Luc. Preste atenção particular se os ratos desenvolvem paralisa dos membros inferiores.
-
Avalie o crescimento do tumor usando um sistema de imagens in vivo 1 x por semana, antes da injeção de SWCNT-anti-MALAT1.
- Prepare-se 15 mg/mL D-luciferina fresco com PBS 1x.
- Anestesia os ratos com um vaporizador de isoflurano (3 – 5% para a indução e 1-3% para a manutenção, dependendo do estado dos ratos).
- Injetar 150 mg/kg em cada rato D-luciferina intraperitonealmente, 5 min antes de imagem; Então, imagem os ratos em posição com um espectro de sistema de imagem.
- Recolha imagens sequenciais dos ratos cada 2 min, até atingir a saturação da luminescência. Ajuste o intervalo de tempo de acordo com o absorção de D-luciferina/sinal.
- Use o CO2 para sacrificar os ratos, uma vez atingido o término do experimento.
-
Já que este é um modelo disseminado MM, processe os ratos como segue.
- Pese o mouse antes de dissecação.
- Colete sangue periférico do coração por um hemograma completo (CBC) ensaio realizado por uma máquina de contador de células do sangue. As contagens de células brancas e células vermelhas do sangue, bem como a proporção de linfócitos, é os principais índices.
- Isolar o baço e pesá-lo. Calcular a relação do peso de corpo/baço; Considere > 0,5% como alargamento do baço.
- Recolha os tecidos da medula óssea, baço, linfonodos, rim e o tecido com metástase visível.
- Recolha a espinha se o mouse desenvolvido uma paralisia dos membros inferiores.
- Extrai o ARN e proteínas de amostras de medula óssea.
- Corrigi todos os tecidos remanescentes em formol.
- Para descalcificação, mergulhe as amostras de osso em 0,25 M de solução de EDTA (pH 8.0) durante 5 dias após 24h de fixação.
- Mergulhe todas as amostras em álcool 75% para o armazenamento a longo prazo.
- Compare a intensidade do sinal de luciferase nos mesmos pontos tempo em dois grupos. De ambos os grupos, gravar as datas do sacrifício de cada rato e calcular as curvas de sobrevivência dos dois grupos com o software.
Nota: Todos os procedimentos são resumidos na Figura 1.
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Representative Results
Para demonstrar o efeito de inibição de anti-MALAT1 gapmer DNA em MM, que derrubou a expressão de MALAT1 e usado em células H929 e MM.1S. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram coletadas para a análise da eficiência do knock-down e o status de apoptose em células transfectadas com anti-MALAT1 gapmer ou controle de DNA. qRT-PCR os resultados mostraram que anti-MALAT1 gapmer DNA derrubou a expressão de MALAT1 nas células H929 e MM.1S com eficiência(Figura 2). O status da apoptose foi determinado por citometria de fluxo, que revelou para baixo-regulado MALAT1 induzida apoptose significativamente (Figura 2B).
Estes resultados indicam que os oligos anti-MALAT1 inibir MM efetivamente in-vitro. No entanto, um método de entrega eficiente/shuttle para oligos anti-MALAT1 in vivo precisava ser desenvolvido, que também é o obstáculo de oligos antisentidos em aplicação clínica; daí nosso interesse em SWCNT. SWCNT é um nanomaterial romance para entrega da droga, que pode desenvolver Hidrofilia e dissolubility após modificações apropriadas; Portanto, ele pode entregar cargas em diferentes formas, tais como drogas do oligonucleotide. Para validar a eficiência de entrega de SWCNT in vivo, nós primeiro acrescida a SWCNT com DSPE-PEG2000-aminas, que dotado de especificidade Hidrofilia e vinculação ao SWCNT19. Então, este SWCNT funcional foi tratada com sulfo-LC-SPDP para criar grupos sulfidrila livre, que serão usados para se conectar com o oligo. Para conjugar o oligo anti-MALAT1 e o SWCNT sulfo-LC-SPDP-tratados, as extremidades 5' do oligo anti-MALAT1 foi modificado com grupos tiol (S-S); para visivelmente rastrear a entrega, as 3' extremidades do oligo anti-MALAT1 foi modificado com cianina 3 (Cy3). Após todas as etapas de síntese, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 foi obtido (Figura 1)12. Em seguida, foi adicionado ao meio de cultura de células GFP-H929 e MM.1S-GFP para validar a eficiência de entrega.
Como mostrado na Figura 2C, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 eficientemente foi entregue para o núcleo das células MM e suprimiu significativamente o nível de MALAT1 endógeno nas células tanto H929 e MM.1S (Figura 2D). Para examinar a toxicidade e a segurança de SWCNT em células normais, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 foi adicionado no meio de células BMEC-1 em diferentes concentrações; Lipofectamine foi o controle de tratamento; médio liso foi usado como o controle essencial(Figura 2). Então, a viabilidade celular foi detectada usando um kit de teste de viabilidade celular no dia 1, dia 2 e dia 3. Nenhuma diferença significativa na inibição de viabilidade celular foi encontrada entre SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 e o controle de tratamento em diferentes dosagens e pontos de tempo. Não havia nenhuma diferença em relação ao médio liso (NC), que indica que a toxicidade de SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 é semelhante ao controle de tratamento, que tem uma toxicidade limitada e aceitável para as células normais em alta dosagem.
Em seguida, estabeleceu-se um modelo do rato disseminadas humanos-MM, para avaliar os efeitos do tratamento de SWCNT-anti-MALAT1 in vivo. Em primeiro lugar, cada rato SCID-bege (de 8 semanas de idade) foi injetado com 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry células por via intravenosa (Figura 3). Um total de 14 ratos foram injetados com células MM.1S; entre eles, sete ratos aleatoriamente foram organizados em um grupo de tratamento SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 e outros sete foram no grupo controle. Tanto SWCNT-anti-MALAT1 e oligos SWCNT-controle foram dissolvidos em 0,5 mL de 1X PBS e injetados nas veias de cauda 7 dias após a injeção de células de tumor. O tratamento SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 foi repetido a cada 7 dias até o término do experimento. Para avaliar a carga do tumor, o sinal de luciferina foi observado por um vivo em sistema da imagem latente (IVIS) 30 min após a injeção de luciferina 1 x uma semana antes da injeção de SWCNT-oligo. Nós achamos que os sinais de luciferina dos ratos no grupo de tratamento SWCNT-anti-MALAT1 notavelmente inferior foram comparados com os do grupo de tratamento SWCNT-controle após 21 dias de tratamento (a partir de dia 28). Seu estado de saúde e sobrevivência foi verificado e gravou todos os dias e resumidos em uma curva de Kaplan-Meier. Nesses resultados, concluiu-se que o tratamento SWCNT-anti-MALAT1 através de injeção intravenosa pode entregar os oligos anti-MALAT1 para células tumorais efetivamente. Nós, então, limitado a carga do tumor e estendido a expectativa de vida dos ratos (p = 0,04) conforme o esperado, que é semelhante aos resultados in vitro. Não encontramos qualquer efeitos colaterais significativos do tratamento nos ratos durante o período de experimento, que indicou que a injeção SWCNT-anti-MALAT1 é um tratamento seguro para ratos; Portanto, SWCNT é um seguro e confiável em vivo entrega sistema de anti-MALAT1.
Figura 1 : Diagrama esquemático da síntese, absorção, e vivo em dissociação de um SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer oligo. (A) SWCNT foi acrescida com DSPE-PEG2000-aminas e, posteriormente, conjugado com anti-MALAT1-Cy3 através de ligação dissulfeto mediada por Sulfo-LC-SPDP. (B) SWCNT-conjugado anti-MALAT1 foi injetada em um rato com MM.1S-Luc-mCherry células através da veia da cauda. (C) SWCNT-conjugado anti-MALAT1 penetra a membrana de BICAMADA de fosfolípidos através de inserção ou endocitose. (D) SWCNT-anti-MALAT1 foi empacotado dentro endossomos iniciais após a absorção pelas células; em seguida, o endossomo precoce amadureceu de um endossomo atrasado e fundiu-se com um lisossoma para formar um endolysosome. O endolysosome ajuda a liberar o anti-MALAT1 do SWCNT quebrando a ligação dissulfeto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : SWCNT-anti-MALAT1 foi entregue de forma eficiente com toxicidade mínima e induziu apoptose em células no MM. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo ou oligo SWCNT-controle foram transfectadas por Lipofectamine em células H929 e MM.1S, respectivamente. Quarenta e oito horas mais tarde, nós coletamos células para (A), a análise da expressão de MALAT1 por qRT-PCR e análise de apoptose (B) por citometria de fluxo. (C) H929-GFP e MM.1S-GFP células foram co cultivadas com SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 por 48 horas; a eficiência de entrega foi determinada por microscópio de fluorescência (barras de escala = 100 µm). (D) a ofMALAT1 nível de expressão foi detectado por qRT-PCR, que mostrou que ele foi com êxito derrubado nas células H929 e MM.1S (* * p < 0,01, * * * p < 0,001). (E) SWCNT e o controle de tratamento foram adicionados em um meio de cultura de células BMEC-1 em diferentes dosagens. A proliferação foi medida usando um kit de teste de viabilidade celular. Esta figura foi modificada de Hu et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : SWCNT-anti-MALAT1 suprimido mieloma crescendo em modelo de rato disseminadas MM MM.1S-celular-construído. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry células foram injetadas por via intravenosa para as veias da cauda de ratos irradiados de SCID-bege (sete em cada grupo); 50 μL de um SWCNT-anti-MALAT1 ou solução SWCNT-controle foram injetados a cada 7 dias através da veia da cauda do 7º dia após a injeção de células MM.1S. IVIS foi usado para monitorar o crescimento do tumor. Fardo de tumor e paralisia de membro posterior (B) foram usados como pontos de extremidade, e os dados de sobrevivência foram analisados através de uma análise de Kaplan-Meier. Esta figura foi modificada em Hu et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A evidência mostrou que lncRNAs participar na regulação de numerosos processos fisiológicos e fisiopatológicos em cânceres, incluindo MM7,8,9; Eles têm o potencial para ser direcionado para o tratamento de câncer, que pode ser realizado por oligonucleotides antisentido20,21,22. O E.U. Food and Drug Administration (FDA) aprovou várias drogas antisentido do oligonucleotide, incluindo fomivirsen para citomegalovírus retinose23, mipomersen para hipercolesterolemia familiar homozigótica24, nusinersen para atrofia muscular espinhal25e eteplirsen para a distrofia muscular de Duchenne26. Neste estudo, nós modificado o anti-MALAT1 gapmer DNA com 2'-OMe-RNA e conjugado com SWCNT funcional. O SWCNT transporta e entrega os oligos anti-MALAT1 como um serviço de transporte, que não só melhorou a afinidade do oligo-alvo devido à sua flexibilidade e carregamento múltiplo mas também estabilizou os oligos e ajudou a evitar a degradação de nuclease durante o parto27 .
Uma modificação apropriada na superfície do SWCNTs pode evitar obter dispersibilidade confiável em ambientes aquosos, fisiologicamente relevantes e promover sua biodistribuição28,29. Costumávamos DSPE-PEG2000-amina para modificar o SWCNT, que foi demonstrada para enxertar na SWCNT e melhorar a solubilidade na água do mesmo, e além disso, mostrou excelente estabilidade sem aglomeração em mídia biológica30. Sulfo-LC-SPDP foi usado como um agente reticulante no experimento, que ajudou funcionalizado SWCNT para vincular o anti-MALAT1 gapmer DNA através de ligação dissulfeto e depois entregá-los em pilhas. Uma vez que o SWCNT penetrou nas células MM, eles foram retomados por endossomos iniciais (pH ~ 6.0), que então amadureceram a tarde endossomos (pH ~ 5.0), acompanhados por um valor de pH reduzido31. A vantagem do PEG link é que a ligação é estável em pH > 6, mas até 75-95% da droga ligada PEG foi lançado em 2 horas, uma vez que o pH se tornou menos de 5,532,33,34. Endossomos carregando SWCNT-anti-MALAT1 fundiu-se com lisossomos (pH ~ 4,5) para formar um endolysosome e, em seguida, o dissulfeto títulos foram catalisados pela redutase lisossomal tiol, que idealmente foi ativada em um pH baixo35. Este, posteriormente, liberado grátis anti-MALAT1 gapmer DNA. De acordo com os resultados de experimentos in vitro e in vivo, o SWCNT entregues SWCNT-anti-MALAT1 eficazmente e ajudou a agir da mesma forma, em função de anti-MALAT1 in vitro.
O funcionalizados SWCNTs passar BICAMADA de fosfolípidos através de dois padrões: inserção36,37 e endocitose38,39. Esses procedimentos ajudam a SWCNT entregar cargas em células sem interromper a estabilização das membranas celulares, portanto, reduzido a toxicidade do SWCNT. Nós injetamos 50 µ l de SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) em cada rato (~ 20 g); assim, a concentração de fármaco final foi de 0,1 mg/kg, que é muito menor do que a dose que usamos em experimentos de toxicidade (2 mg/L e 4 mg/L). Como anterior mostrou resultados, SWCNT tem um efeito semelhante, como o controle de tratamento (por exemplo, Lipofectamine) no crescimento celular e viabilidade no combinado dosagens. O controle do tratamento é um reagente comum para transfeccao de célula e é acreditado para ter uma toxicidade limitada e aceitável para as células; assim, acreditamos que SWCNT tem apenas uma mínima toxicidade para as células normais.
Como um serviço de transporte para os oligonucleotides antisentidos, metabolismo é outra consideração importante para a segurança de SWCNT. Foi demonstrado que funcionalizados SWCNT é principalmente excretada pelos rins, sem toxicidade tubular e glomerular40. Não havia sintomas de disfunção-relacionados, tais como oligúria, anúria, edema, alterações de aparência do rim, rim etc., nos ratos que aceitaram a injeção SWCNT. Assim, SWCNTs tem sem efeitos de toxicidade devido à acumulação anormal em um rato com uma função renal normal.
Somos o primeiro a conjugar oligonucleotides antisegmentação sentidos lncRNA com SWCNT funcionalizado e usá-lo para tratamento de MM. SWCNT é um tipo de romance nanomaterial, que tem quiralidade consistente, diâmetro opcional e a distribuição de comprimento. Após o tratamento functionalization, SWCNTs desenvolver a solubilidade em água e biocompatibilidade e tornar-se um vaivém biológico ideal para entregar carga numerosos através da membrana celular, desse modo aumentando a distribuição de drogas e aumentando o efeito do tratamento. Além disso, SWCNT pode estabilizar as moléculas do oligonucleotide antisenso de nuclease digestão1. Como mostram os resultados, o funcionalizados SWCNT-anti-MALAT1 entregue MALAT1 nas células MM eficientemente e inibiu o crescimento MM dramaticamente em linhas de células in vitro e em um modelo de mouse disseminadas em vivo. Até agora, nós não observaram qualquer toxicidade devido ao tratamento SWCNT nesses experimentos. Este estudo demonstra que SWCNT é um veículo de entrega segura e eficaz para drogas antisentido do oligonucleotide e tem potencial para ser utilizado como um portador de moléculas terapêuticas em pacientes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer o Lerner Research Institute proteômica, genômica e núcleos de imagens para sua assistência e apoio. Financiamento: Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH/ICN grant R00 CA172292 (J.J.Z.) e fundos de start-up (para J.J.Z.) e clínica e translacional ciência colaborativa (CTSC) do caso Western Reserve University núcleo utilização piloto Grant (para J.J.Z.). Este trabalho utilizou o microscópio confocal Leica SP8 que foi comprado com financiamento da concessão de institutos nacionais de saúde SIG 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
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