Summary
Эта рукопись описывает синтез одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ)-конъюгированных MALAT1 антисмысловых gapmer ДНК олигонуклеотида (ОУНТ анти MALAT1), который демонстрирует надежную доставку ОУНТ и мощный терапевтический эффект анти MALAT1 в vitro и in vivo. Методы, используемые для синтеза, модификация, спряжение, и описаны инъекции ОУНТ анти MALAT1.
Abstract
Одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) является новый тип наночастиц, который был использован для доставки нескольких видов наркотиков в клетки, такие как белки, олигонуклеотиды и синтетических наркотиков мелкомолекулярных. ОУНТ имеет настраиваемые размеры, большой поверхностный площади и можно гибко привязать с наркотиками через различные модификации на его поверхности; Таким образом это идеальная система для транспортировки наркотиков в клетки. Длиной некодирующих РНК (lncRNAs) являются кластер некодирующей РНК больше чем 200 nt, который нельзя преобразовать в белок, но играют важную роль в биологических и патофизиологических процессов. Стенограмма аденокарциномы легкого с метастазами связанные 1 (MALAT1) является весьма сохраняется lncRNA. Было продемонстрировано, что более высокие уровни MALAT1 связаны с плохим прогнозом различные виды рака, в том числе множественной миеломы (мм). Мы показали, что MALAT1 регулирует ДНК клеток и ремонт смерти в мм; Таким образом MALAT1 может рассматриваться как терапевтические мишенью для мм. Однако эффективной доставки антисмысловых oligo подавляют/нокдаун MALAT1 в естественных условиях по-прежнему является проблемой. В этом исследовании мы изменить ОУНТ с ПЭГ-2000 и спряжения oligo анти MALAT1 к нему, проверить доставку этого соединения в пробирке, вставляют его внутривенно распространение модель мыши мм и наблюдать значительное торможение прогрессирования мм, который указывает что ОУНТ является идеальным доставки Трансфер для анти MALAT1 gapmer ДНК.
Introduction
ОУНТ является роман Наноматериал, которые могут доставить различные виды наркотиков, таких как белки, малые молекулы и нуклеиновые кислоты, стабильно и эффективно с идеальной переносимость и минимальная токсичность в пробирке1 и в естественных условиях2. Функционализированных ОУНТ имеет большой биосовместимость и растворимость в воде, может использоваться как трансфер для небольших молекул и может нести их проникнуть в клеточной мембраны3,4,5.
lncRNAs-группа РНК (> 200 nt), трансляции из генома к мРНК, но не могут быть переведены с белками. Увеличения доказательств показал, что lncRNAs участвуют в регуляции генов выражение6 и участвуют в инициации и прогрессирования большинства видов рака, включая мм7,8,9. MALAT1 это-обогащенный некодирующей Стенограмма 2 (NEAT2) и весьма сохранены lncRNA10. MALAT1 первоначально отражаются в метастатических не небольшие клеток легких рака легкого (НМРЛ)11, но был оверэкспрессировали в многочисленных опухолей5,12,13; Это один из наиболее сильно выраженным lncRNAs и коррелирует с плохим прогнозом в мм8,14. Уровень экспрессии MALAT1 значительно выше в роковой курс интрамедуллярный мм пациентов по сравнению с теми только диагнозом15мм.
В предыдущем исследовании, мы подтвердили, что анти MALAT1 oligos энергично привести к повреждение ДНК и апоптоз в16 мм с помощью gapmer антисмысловых олигонуклеотидов ДНК ориентации MALAT1 (анти MALAT1) в клетках мм. Gapmer ДНК состоит из антисмысловых ДНК и соединены 2'-OMe-РНК, которые могли бы побудить MALAT1 расщепление H РНКазы раз связана деятельность17. В естественных условиях доставки эффективность антисмысловых oligos по-прежнему ограничивает его клинического использования.
Чтобы проверить доставку эффект ОУНТ для анти MALAT1 gapmer oligos, gapmer анти MALAT1, что ДНК конъюгированных с DSPE-PEG2000-Амин функционализированных ОУНТ. ОУНТ анти MALAT1 затем вводят внутривенно в модель распространения мыши мм; поразительное ингибирование наблюдается после четырех сеансов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с участием животных были предварительно одобренных IACUC клиники Кливленда (институциональный уход животных и использование Комитета).
1. Синтез функционализированных SWCNTs
- Смешайте 1 мг SWCNTs, 5 мг DSPE-PEG2000-Амин и 5 мл стерилизованные нуклеиназы свободной воды в пузырек сцинтилляционные стекла (20 мл). Встряхните его хорошо, чтобы полностью растворить все реагенты.
- Sonicate флакон в ванной sonicator воды на уровень мощности 40 Вт на 1 ч при комнатной температуре (RT, 20 мин x 3, изменить воды каждые 20 минут во избежание перегрева). Затем центрифуги на 24000 g x 6 ч и собирать супернатанта решения. Этот функциональный ОУНТ раствор может храниться при температуре 4 ° C на 2 месяца.
- Добавьте 1 мл раствора ОУНТ с шагом 1,2 до 100 кДа MWCO центробежного фильтра устройства, следуют 4 мл стерилизованные нуклеиназы свободной воды. Центрифуги для 10 мин на 4000 x g на RT для удаления дополнительных DSPE-PEG2000-Амин. Повторить добавление 4 мл воды и центрифугирования 5 x. Более чем 0,5 мл раствора оставшихся ОУНТ останется в фильтр после каждого центрифугирования.
- Измерить концентрацию ОУНТ решения оставшихся в фильтре с помощью УФ-Вид спектрометр 808 нм после окончательной стирки. Конечная концентрация обычно около 50 мг/Л (рассчитывается согласно метод, разработанный Кам et al.18).
Примечание: Обеспечьте, чтобы DSPE-PEG-функционализированных SWCNTs водорастворимый после шага 1.4 и стабильны в различных биологических решений без видимых агрегации через несколько недель.
2. спряжение анти MALAT1 Gapmer ДНК, обрамленная 2'-O изменение РНК к функционализированных ОУНТ
- Добавьте 0,5 мг сульфогруппу-LC-SPDP в 450 мкл DSPE-PEG2000-Амин функционализированных ОУНТ. Добавьте 50 мкл 10 x PBS и затем Проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
- Чтобы удалить дополнительные сульфогруппу-LC-SPDP, добавьте реакции от шаг 2.1 100 кДа MWCO центробежного фильтра устройства, следуют 4 мл воды, свободной от нуклеиназы. Центрифуга для 10 мин на 4000 x g на RT. повторить добавление 4 мл воды и центрифугирования 5 x.
- Добавить 200 Нм тиоловых модифицированные анти MALAT1-Cy3 gapmer ДНК в 1,5 мл раствора коммерческих DTT и проинкубируйте 90 мин на RT. очистить продукт со столбцом НПД-5, после производителя протокол. Элюировать анти MALAT1-Cy3 с 500 мкл стерилизованные нуклеиназы бесплатно 1 x PBS.
Примечание: Функционализированных ОУНТ может храниться с добавил DTT, который может расколоть дисульфидными облигаций сформирован во время хранения thiolated анти MALAT1 gapmer ДНК. Добавлено DTT могут быть удалены по столбцу Анапчи-5 перед конъюгации с ОУНТ. - Собирать сульфогруппу LC-SPDP-лечение DSPE-PEG2000-Амин ОУНТ решение оставлено в фильтре и разбавить его с 500 мкл раствора анти MALAT1-Cy3. Затем проинкубируйте ее на 4 ° C в течение 24 ч. Конъюгированные ОУНТ анти MALAT1 может храниться при температуре 4 ° C в течение 3 недель. Следуя той же процедуре конъюгированных ОУНТ с антисмысловых oligo схватка может синтезируется и используется как ОУНТ управления.
3. хвост инъекции Вену ОУНТ анти MALAT1
-
Создать модель распространения мыши мм.
- Для достижения наилучших результатов сравнения, случайным образом организовать 14 КИВНУЛ. CB17-Prkdcscid/J мышей (8 недель) на суда или управления группы (семь в каждой группе) с же соотношение мужчин и женщин.
- Очистить операции скамейке и стерилизовать его с 70% спирта.
- Используйте лампы Отопление теплый мыши, чтобы помочь хвост вен появляться. Должным образом сдерживать мышь с фиксатор инъекции хвост.
- Придать 5 x 10-6 MM.1S-Люк mCherry клеток в 50 мкл PBS через Вену хвост без анестезии. Нажмите узел впрыска с спиртом за 30 с. Марк вводят мыши и вернуть его в клетку чистой.
-
Начало лечения на 7 день после инъекции клеток MM.1S.
- Придать 50 мкл PBS, содержащих ОУНТ анти MALAT1 в Вену хвост мыши. Используйте PBS, содержащие ОУНТ-элемент управления как элемент управления.
- Нажмите узел впрыска с спиртом для 30 s.
- Соблюдать местные кровотечение на хвост и общее поведение мыши за 1 мин, а затем вернуться к чистой клетке. Соблюдайте все вводят мышей снова перед возвращением в клетку к стойке, чтобы убедиться, что инъекции переносится хорошо.
-
Повторяйте инъекции каждые 7 дней до окончания эксперимента.
- Прекратить эксперимент, когда ухудшает общее состояние здоровья мыши: когда не еды или питья, внешний вид бледно лапы, подкожные кровотечения, одышка, снижение активности, параличом нижних конечностей, и/или осязаемый массы в наблюдается живота.
4. Оценка прогрессирования заболевания
- Оценить общее состояние мышей каждый день после инъекции клеток MM.1S-Люк mCherry. Уделять особое внимание, если у мышей парализует нижних конечностей.
-
Оцените с помощью в естественных условиях тепловизионные системы 1 раз в неделю, перед инъекцией ОУНТ анти MALAT1 рост опухоли.
- Подготовьте свежие 15 мг/мл D-люциферин с ПБС.
- Анестезировать мышей с изофлюрановая испарителем (3 – 5% для индукции и 1 – 3% за обслуживание, в зависимости от статуса мышей).
- Придать 150 мг/кг D-люциферин в каждой мыши, внутрибрюшинно, 5 мин до изображений; затем изображение мышей в положении лежа с спектром изображений системы.
- Соберите последовательные изображения мышей каждые 2 мин, пока не будет достигнут насыщения люминесценции. Настройка интервала времени по D-люциферин поглощения/сигнал.
- Использование CO2 в жертву мышей при достижении окончания эксперимента.
-
Поскольку это модель распространения мм, процесс мышей следующим образом.
- Вес мыши перед рассечение.
- Соберите периферической крови из сердца для assay полный анализ крови (CBC), выполняемые машиной счетчик клеток крови. Количество белых кровяных клеток и красных кровяных клеток, а также отношение лимфоцитов, являются основным индексы.
- Изолировать селезенки и взвесить его. Рассчитать отношение массы селезенки/тела; Рассмотрим > 0,5% как расширения селезенки.
- Соберите ткани из костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, почки и ткани с видимых метастазов.
- Соберите позвоночника, если мышь разработал паралича нижних конечностей.
- Извлечь РНК и белка из проб костного мозга.
- Исправьте все остальные ткани в формалине.
- Для декальцинации погрузите образцов костей в 0,25 М ЭДТА раствор (pH 8.0) на 5 дней после 24 ч фиксации.
- Погрузите все образцы в 75% спирта для длительного хранения.
- Сравнение сигнала Люцифераза на же время очков в двух группах. Из обеих групп запишите жертву даты каждой мыши и расчета кривых выживания двух групп с программным обеспечением.
Примечание: Все процедуры приводится на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать эффект ингибирования анти MALAT1 gapmer ДНК в мм, мы постучал вниз выражение MALAT1 и использовал его в H929 и MM.1S клеток. Сорок восемь часов спустя, клетки были собраны для анализа эффективности нокдауна и статус апоптоз в клетках transfected с анти MALAT1 gapmer или управления ДНК. qRT ПЦР результаты показали, что анти MALAT1 gapmer ДНК, сбил MALAT1 выражение в H929 и MM.1S клетки эффективно (рисA). Статус апоптоз определяется проточной цитометрии, который показал вниз регулируется MALAT1 индуцированного апоптоза значительно (рис. 2B).
Эти результаты показывают, что анти MALAT1 oligos подавляют мм эффективно в пробирке. Однако метод эффективной доставки/Трансфер для анти MALAT1 oligos в естественных условиях необходимо разрабатывать, который также является препятствием антисмысловых oligos клинического применения; Поэтому наш интерес к ОУНТ. ОУНТ является роман наноматериал для доставки лекарств, которые могут развиваться гидрофильность и растворимость после соответствующих изменений; Таким образом он может доставить грузов в различных формах, таких как олигонуклеотида наркотики. Чтобы проверить эффективность доставки ОУНТ в естественных условиях, мы сначала функционализированных ОУНТ DSPE-PEG2000-аминов, которые наделены гидрофильность и привязки специфика ОУНТ19. Затем этот функциональный ОУНТ лечили сульфогруппу LC-SPDP для создания свободной сульфгидрильных групп, которые будут использоваться для соединения с oligo. Для спряжения oligo анти MALAT1 и сульфогруппу LC-SPDP-лечение ОУНТ, 5' концы oligo анти MALAT1 был изменен с тиоловых групп (S-S); чтобы явно отслеживать доставку, 3' концы oligo анти MALAT1 был изменен с цианиновые 3 (Cy3). После всех шагов синтеза ОУНТ анти MALAT1-Cy3 был получен (рис. 1)12. Затем он был добавлен в средство культуры клеток H929-GFP и MM.1S-GFP для проверки эффективности доставки.
Как показано на рис. 2C, ОУНТ анти MALAT1-Cy3 эффективно был доставлен в ядре клеток мм и значительно подавил уровень эндогенного MALAT1 в H929 и MM.1S клеток (рис.D). Для изучения токсичности и безопасность ОУНТ в нормальных клетках, ОУНТ анти MALAT1-Cy3 был добавлен в средне-и BMEC-1 клеток в разных концентрациях; Lipofectamine был лечения управления; обычный средний был использован как основные управления (Рисунок 2E). Затем жизнеспособность клеток был обнаружен с помощью комплекта пробирного жизнеспособность клеток на день 1, день 2 и 3 день. Никакого существенного различия в торможении жизнеспособность клеток было установлено между ОУНТ анти MALAT1-Cy3 и контроля лечения в различных дозировках и моменты времени. Нет никакой разницы, по сравнению с простой средней (NC), который указывает, что токсичность ОУНТ анти MALAT1-Cy3 похож на лечение управления, который имеет ограниченный и приемлемой токсичности для нормальных клеток при высокой дозировке.
Далее распространение мыши человека мм модель была создана оценить эффекты лечения ОУНТ анти MALAT1 в естественных условиях. Во-первых, каждая мышь ТКИД бежевый (всего 8 недель) вводили внутривенно с 5 x 10-6 MM.1S-Люк mCherry клеток (рис. 3). В общей сложности 14 мышей вводили с MM.1S клетки; среди них семь мышей случайно были аранжированы в группу лечения ОУНТ анти MALAT1-Cy3, а еще семь были в группе управления. ОУНТ анти MALAT1 и oligos ОУНТ управления были растворяют в 0,5 мл ПБС и вводят через хвост Вены через 7 дней после инъекции клеток опухоли. ОУНТ анти MALAT1-Cy3 лечение повторяется каждые 7 дней до окончания эксперимента. Для оценки бремени опухоли, сигнал люциферин наблюдалось в естественных условиях съемочной системы (ИВИС) 30 мин после инъекции люциферин 1 раз в неделю перед инъекцией ОУНТ oligo. Мы обнаружили, что сигналы люциферин мышей в группе лечения ОУНТ анти MALAT1 были заметно ниже по сравнению с ОУНТ контроль лечения группы после 21 дней лечения (от дня 28). Их состояния здоровья и выживания был проверен и регистрируются каждый день и обобщены в кривой Каплана-Мейера. Из этих результатов мы пришли к выводу, что ОУНТ анти MALAT1 лечения через внутривенные инъекции могут доставить oligos анти MALAT1 опухолевых клеток эффективно. Мы, затем, ограниченное бремя опухоли и продлил продолжительность жизни мышей (p = 0,04) как и ожидалось, который похож на результаты in vitro. Мы не нашли каких-либо значительных побочных эффектов лечения в мышей в период всего эксперимента, который указал, что инъекции ОУНТ анти MALAT1 является безопасное лечение для мышей; Таким образом ОУНТ является безопасной и надежной системы в естественных условиях доставки для анти MALAT1.
Рисунок 1 : Схема синтеза, поглощения, и в естественных условиях диссоциации ОУНТ анти MALAT1-Cy3 oligo gapmer. (A) ОУНТ функционализированных DSPE-PEG2000-аминов и, впоследствии, конъюгированных с анти MALAT1-Cy3 через дисульфидных связей, при посредничестве сульфогруппу-LC-SPDP. (B) конъюгированных ОУНТ анти MALAT1 было впрыснуто в мышь с MM.1S-Люк mCherry клетки через Вену хвост. (C) конъюгированных ОУНТ анти MALAT1 проникает фосфолипидного бислоя мембраны путем вставки или эндоцитоз. (D) ОУНТ анти MALAT1 был упакован в начале endosomes после поглощения клетками; затем раннего endosome созрел до конца endosome и объединена с Лизосома сформировать endolysosome. Endolysosome помогает освободить анти MALAT1 от ОУНТ разбивая дисульфидными облигаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : ОУНТ анти MALAT1 был доставлен эффективно с минимальной токсичностью и индуцированного апоптоза в клеточных линиях мм. Oligo ОУНТ анти MALAT1 gapmer или oligo ОУНТ управления были transfected в Lipofectamine в H929 и MM.1S клетки, соответственно. Сорок восемь часов спустя, мы собрали клетки для (A) анализ экспрессии MALAT1 qRT-PCR и (B) Анализ апоптоза подачей cytometry. (C) H929-GFP и MM.1S-GFP клетки были совместно культивируемых с ОУНТ анти MALAT1-Cy3 за 48 часов; эффективность доставки определяется флуоресцентным микроскопом (шкала баров = 100 мкм). (D) выражения уровня ofMALAT1 был обнаружен qRT-PCR, который показал, что он был успешно сбил в клетках H929 и MM.1S (** p < 0.01, *** p < 0,001). (E) ОУНТ и контроля лечения были добавлены в питательной среды BMEC-1 клеток в разных дозировках. Распространения была измерена с помощью комплекта пробирного жизнеспособность клеток. Этот рисунок был изменен с Ху et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : ОУНТ анти MALAT1 подавлены миеломы, растущих в MM.1S-клеток построены мм распространяется мышиной модели. (A) 5 x 10-6 MM.1S-Люк mCherry клетки были введены внутривенно хвост вен облученного ТКИД бежевый мышей (семь в каждой группе); 50 мкл ОУНТ анти MALAT1 или решение управления ОУНТ вводили каждые 7 дней через Вену хвост от 7-й день после инъекции клеток MM.1S. ИВИС был использован для мониторинга роста опухоли. (B) задних конечностей паралич и опухоли бремя были использованы в качестве конечных точек, и выживания данные были проанализированы анализ Каплана-Мейера. Эта цифра была изменена с Ху et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доказательств показал, что lncRNAs принимают участие в регуляции многочисленных физиологические и патофизиологические процедур в раках, включая мм7,8,9; они имеют потенциал, чтобы быть направлены для лечения рака, которые могут быть реализованы путем антисмысловых олигонуклеотидов20,21,22. США продовольствия и медикаментов (FDA) одобрило несколько антисмысловых олигонуклеотидов наркотиков, включая fomivirsen для цитомегаловирус ретинит23, mipomersen для гомозиготной семейной гиперхолестеринемией24, nusinersen для Спинальная мышечная атрофия25и eteplirsen для мышечной дистрофии Дюшенна26. В этом исследовании мы изменен анти MALAT1 gapmer ДНК с 2'-OMe-РНК и сопряженных с функциональной ОУНТ. ОУНТ осуществляет и обеспечивает анти MALAT1 oligos как трансфер, который не только улучшить близость oligo цели из-за его гибкости и несколько загрузки, но и стабилизировать oligos и помог предотвратить деградацию нуклеиназы во время доставки27 .
Подходящие изменения на поверхности SWCNTs может помочь ей получить надежный Диспергируемость в физиологически актуальной, водной среды и содействовать их накопление28,29. Мы использовали DSPE-PEG2000-Амин для изменения ОУНТ, которая была продемонстрирована прививка на ОУНТ и улучшить водный растворимость его, и Кроме того, он показал отличную стабильность без агломерации в биологических средах30. Сульфогруппу-LC-SPDP был использован как сшивателя в эксперименте, который помог функционализированных ОУНТ привязать анти MALAT1 gapmer ДНК через дисульфидных связей, а затем доставить их в клетки. Как только ОУНТ проникли в клетках мм, они были доставлены на начале endosomes (рН ~ 6.0), который затем созрел до конца endosomes (рН ~ 5.0) сопровождается снижение рН значение31. Преимуществом PEG ссылка является стабильным рН сцепления > 6, но до 75 – 95% препарата связан PEG был выпущен в течение 2 часов после pH стал менее 5,532,,3334. Endosomes, перевозящих ОУНТ анти MALAT1 объединилась с лизосом (рН ~ 4.5) в форме endolysosome, а затем дисульфида, что облигации были катализируемой лизосомальных тиоловых редуктазы, который оптимально был активирован на низкий рН35. Это, впоследствии выпустила бесплатный анти MALAT1 gapmer ДНК. По результатам эксперимента в vitro и in vivo ОУНТ доставлены ОУНТ анти MALAT1 эффективно и помог ей действовать аналогичным образом, в функции для анти MALAT1 в пробирке.
Функционализированных SWCNTs проходят через фосфолипидного бислой через две структуры: вставки36,37 и эндоцитоз38,39. Эти процедуры помогают доставлять грузы в клетки без прерывания стабилизации клеточных мембран, таким образом снижается токсичность ОУНТ ОУНТ. Мы вводили 50 мкл ОУНТ анти MALAT1 (~ 40 мг/Л) в каждой мыши (~ 20 g); Таким образом концентрация окончательный наркотиков был 0,1 мг/кг, который гораздо ниже, чем дозы, которую мы использовали в экспериментах токсичности (2 мг/Л и 4 мг/Л). Как предыдущий, результаты показали, ОУНТ имеет аналогичный эффект лечения управления (например, Lipofectamine) на клеточный рост и жизнеспособность в соответствующих дозах. Контроль лечения является общий реагент для transfection клетки и считается иметь ограниченное и приемлемой токсичности для клеток; Таким образом мы считаем, что ОУНТ имеет только минимальную токсичность для нормальных клеток.
Как автобус Антисмысловые олигонуклеотиды метаболизм является еще одним важным фактором для безопасности ОУНТ. Было продемонстрировано, что функционализированных ОУНТ выводится главным образом через почки, без клубочковых и трубчатых токсичности40. Мы не нашли почечной дисфункции связанных симптомы, например, олигурия, анурия, отек, появление изменения функции почек, и т.д., в мышей, которые приняли инъекций ОУНТ. Таким образом SWCNTs не имеют токсичности эффектов из-за ненормального накопления в мышь с нормальной функции почек.
Мы первыми конъюгат анти чувство олигонуклеотиды ориентации lncRNA с функционализированных ОУНТ и использовать его для лечения мм. SWCNT — это тип Роман Наноматериал, которая имеет последовательное хиральности, Факультативного диаметр и длина распределения. После лечения функционализации SWCNTs развивать растворимости в воде и биосовместимость и стать идеальной биологических Трансфер доставить многочисленные груз через клеточную мембрану, тем самым, увеличение распространения наркотиков и повышения эффективности лечения. Кроме того ОУНТ может стабилизировать анти смысле олигонуклеотида молекул от нуклеиназы пищеварение1. Как показывают результаты, функционализированных ОУНТ анти MALAT1 поставляется MALAT1 в мм клетки эффективно и препятствует мм роста резко в клеточных линиях в пробирке и в распространение мышиной модели в естественных условиях. Пока мы не наблюдали любого токсичностью из-за лечения ОУНТ в этих экспериментах. Это исследование показывает, что ОУНТ является безопасной и эффективной доставки автомобиля для антисмысловых олигонуклеотидов наркотиков и имеет потенциал, чтобы использоваться в качестве носителя для терапевтических молекул в больных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят proteomic Лернер научно-исследовательский институт, геномные и изображений ядра за их помощь и поддержку. Финансирование: Эта работа была финансовой поддержке гранта NIH/NCI R00 CA172292 (для J.J.Z.) и начальных средств (для J.J.Z.) и клинические и поступательного науки совместных (АОЗТ) дело Вестерн Резерв университета Core использования пилот гранта (J.J.Z.). Эта работа использовали Конфокальный микроскоп Leica SP8, который был приобретен с финансирования из национальных институтов здравоохранения SIG Грант 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
