Summary
Este manuscrito describe la síntesis de un nanotubo de carbono de pared simple (SWCNT)-conjugado MALAT1 gapmer antisentido DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), que demuestra la entrega confiable de la SWCNT y el potente efecto terapéutico de anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Métodos utilizados para la síntesis, modificación, verbal, y la inyección de SWCNT-anti-MALAT1 se describen.
Abstract
Los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) es un nuevo tipo de nanopartícula, que se ha utilizado para ofrecer a varios tipos de drogas en las células, como las proteínas, oligonucleótidos y drogas sintéticas de molécula pequeña. El SWCNT tiene dimensiones personalizables, una gran área superficial y flexible puede enlazar con las drogas a través de diferentes modificaciones en su superficie; por lo tanto, es un sistema ideal para el transporte de drogas en las células. Larga noncoding RNAs (lncRNAs) son un grupo de RNA codifica más de 200 nt, que no puede ser traducido a proteína, pero juega un papel importante en procesos biológicos y fisiopatológicos. Adenocarcinoma pulmón metástasis asociadas 1 (MALAT1) es un lncRNA altamente conservado. Se demostró que niveles más altos de MALAT1 están relacionados con el pronóstico de varios tipos de cáncer, como mieloma múltiple (MM). Hemos revelado que MALAT1 regula ADN reparación y muerte celular en MM; así, MALAT1 puede considerarse como una diana terapéutica para m. Sin embargo, la entrega eficiente de oligo antisentido para inhibir/caída MALAT1 en vivo sigue siendo un problema. En este estudio, nos modificar SWCNT con PEG-2000 conjugar un oligo de anti-MALAT1 a él, prueba de la entrega de este compuesto en vitro, inyectar por vía intravenosa en un modelo de ratón MM diseminado y observar una inhibición significativa de la progresión de MM, que indica SWCNT es una entrega ideal para anti-MALAT1 gapmer ADN.
Introduction
El SWCNT es un nuevo nanomaterial que puede ofrecer a varios tipos de drogas, como las proteínas, moléculas pequeñas y los ácidos nucleicos, estable y eficiente con tolerabilidad ideal y mínima toxicidad en la1 de la vitro y en vivo2. Un SWCNT funcionalizado tiene gran solubilidad en agua y biocompatibilidad, puede utilizarse como un servicio de transporte para moléculas más pequeñas y llevarlas para penetrar la membrana de la célula3,4,5.
lncRNAs son un grupo de RNA (> 200 nt) que se transcriben a mRNA de genoma, pero no puede ser traducido a proteínas. Cada vez más pruebas ha demostrado que lncRNAs participar en la regulación de la expresión de genes6 y participan en la iniciación y progresión de la mayoría de los tipos de cáncer, incluyendo MM7,8,9. MALAT1 es una transcripción codifica nuclear enriquecido 2 (NEAT2) y un altamente conservado lncRNA10. MALAT1 es reconocido inicialmente en metastásico de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) el cáncer11, pero ha sido sobre expresa en numerosos tumores5,12,13; es uno de los lncRNAs más altamente expresada y se correlaciona con un pronóstico pobre en MM8,14. El nivel de expresión de MALAT1 es significativamente mayor en pacientes con MM extramedular curso fatal en comparación con aquellos diagnosticados sólo como MM15.
En un estudio previo, hemos confirmado que oligos de anti-MALAT1 robusta conducen a daños en el ADN y la apoptosis en MM16 mediante el uso de oligonucleótidos de antisentido del ADN de gapmer a MALAT1 (anti-MALAT1) en células de MM. La DNA gapmer es compuesta de ADN antisentido y unida por 2'-OMe-RNAs, que podrían sugerirán el escote de la MALAT1 por la Rnasa H actividad una vez atado17. La eficiencia de la entrega en vivo de oligos antisentido todavía limita su uso clínico.
Para probar la entrega efecto de SWCNT para oligos de gapmer anti-MALAT1, el gapmer anti-MALAT1 ADN se conjuga a DSPE-PEG2000-amina funcionalizados SWCNT. SWCNT-anti-MALAT1 luego se inyecta por vía intravenosa en un modelo de ratón diseminada MM; se observa una inhibición notable después de cuatro tratamientos.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados previamente por la Cleveland Clinic IACUC (Comité de uso y cuidado de Animal institucional).
1. síntesis de NTCSPs funcionalizados
- Mezclar 5 mL de agua libre de nucleasa estéril en un vial de centelleo de vidrio (20 mL), 1 mg de NTCSPs y 5 mg de DSPE-PEG2000-amina. Sacúdalo bien para disolver todos los reactivos totalmente.
- Someter a ultrasonidos el frasco en un sonicador de baño de agua a un nivel de potencia de 40 W durante 1 hora a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiar el agua cada 20 minutos para evitar el sobrecalentamiento). Luego, centrifugar a 24.000 x g durante 6 h y recoger la solución sobrenadante. Esta solución SWCNT funcional puede almacenarse a 4 ° C durante 2 meses.
- Añadir 1 mL de solución SWCNT de paso 1.2 a un dispositivo de filtro centrífugo de MWCO de 100 kDa, seguido de 4 mL de agua estéril libre de nucleasas. Centrifugar 10 min a 4.000 x g a temperatura ambiente para quitar extra DSPE-PEG2000-amina. Repetir la adición de 4 mL de agua y la centrifugación 5 x. Más de 0,5 mL de disolución SWCNT sobrante se quedarán en el filtro después de cada centrifugación.
- Medir la concentración de la solución SWCNT sobrante en el filtro utilizando un espectrómetro de UV/VIS en 808 nm después del último lavado. La concentración final es típicamente cerca de 50 mg/L (calculados según el método desarrollado por Kam et al.18).
Nota: Asegúrese de que NTCSPs funcionalizados DSPE-PEG son solubles en agua tras el paso 1.4 y son estables en diferentes soluciones biológicas sin agregación visible después de algunas semanas.
2. Conjugación de Anti-MALAT1 Gapmer ADN flanqueado por 2'-O ARN modificado a SWCNT funcionalizado
- Añadir 0,5 mg de Sulfo-LC-SPDP en 450 μl de DSPE-PEG2000-amine functionalized SWCNT. Añadir 50 μl de PBS de x 10 y luego incubar por 2 h a TA.
- Para quitar extra Sulfo-LC-SPDP, añadir la reacción del paso 2.1 a un dispositivo de filtro centrífugo de MWCO de 100 kDa, seguida de 4 mL de agua libre de nucleasa. Centrifugar durante 10 min a 4.000 x g en RT. repetir la adición de 4 mL de agua y la centrifugación 5 x.
- Añadir 200 nM modificación de tiol anti-MALAT1-Cy3 gapmer ADN en 1,5 mL de solución comercial de TDT e incubar durante 90 min en RT. purificar el producto con una siesta-5 columna, siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir el anti-MALAT1-Cy3 con 500 μl de esterilizado libre de nucleasa 1 x PBS.
Nota: SWCNT funcionalizado puede almacenarse con TDT adicional, que podría unirse disulfuro formado durante el almacenamiento de la gapmer anti-MALAT1 de thiolated DNA. La TDT añadida puede eliminarse por aNAP-5 columna antes de la conjugación con SWCNT. - Recoger la solución DSPE-PEG2000-amina SWCNT sulfo-LC-SPDP-tratados en el filtro y diluirlo en 500 μl de solución de anti-MALAT1-Cy3. Entonces, lo incube a 4 ° C por 24 h. El conjugado SWCNT-anti-MALAT1 puede almacenarse a 4 ° C durante 3 semanas. Siguiendo el mismo procedimiento, el SWCNT conjugado con oligo antisentido scramble puede ser sintetizado y utilizado como control de SWCNT.
3. cola inyección en la vena de SWCNT-Anti-MALAT1
-
Generar un modelo de ratón diseminada MM.
- Para lograr los mejores resultados de la comparación, al azar organizar 14 NOD. CB17-Prkdcscid/J ratones (8 semanas) en grupos de control o ensayo (siete en cada grupo) con la misma proporción de hombres y mujeres.
- Limpiar el Banco de funcionamiento y esterilizar con alcohol al 70%.
- Use una lámpara de calefacción para calentar el ratón para ayudar a la cola de la vena para aparecer. Refrenar el ratón correctamente con un limitador de la inyección de cola.
- Inyectar las células 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry en 50 μl de PBS a través de la vena de la cola sin anestesia. Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en alcohol de 30 marca s. el ratón inyectado y volver a una jaula limpia.
-
Iniciar el tratamiento el día 7 después de la inyección de células MM.1S.
- Inyectar 50 μl de PBS con SWCNT-anti-MALAT1 en la vena de la cola del ratón. Uso PBS con un control de SWCNT como control.
- Presione el sitio de la inyección con un algodón embebido en alcohol durante 30 s.
- Observar el sangrado local en la cola y el comportamiento general del ratón durante 1 min y volver a una jaula limpia. Observar los ratones todo inyectados otra vez antes de regresar a la jaula a la parrilla, para asegurarse de que las inyecciones son bien toleradas.
-
Repetir la inyección cada 7 días hasta la finalización del experimento.
- Terminar el experimento cuando se degrada la salud general del ratón: Cuándo no comer o beber, la aparición de patas pálidas, sangrado subcutáneo, una dificultad para respirar, disminución de la actividad, una parálisis de las extremidades inferiores o una masa tangible en el se observa el abdomen.
4. evaluación de la progresión de la enfermedad
- Evaluar el estado general de los ratones cada día después de la inyección de células MM.1S-Luc-mCherry. Preste especial atención si los ratones desarrollan paraliza de extremidades inferiores.
-
Evaluar el crecimiento del tumor usando un sistema en vivo de imagen 1 x semana, antes de la inyección de SWCNT-anti-MALAT1.
- Preparar el fresco 15 mg/mL D-Luciferin con PBS 1 x.
- Anestesiar los ratones con un vaporizador de isoflurano (3 – 5% para la inducción y 1 – 3% para el mantenimiento, dependiendo del estado de los ratones).
- Inyectar a 150 mg/kg D Luciferin en cada ratón por vía intraperitoneal, a 5 minutos antes de la proyección de imagen; entonces, imagen de los ratones en una posición propensa con un espectro de sistema de imagen.
- Recoger imágenes secuenciales de los ratones cada 2 minutos, hasta que se alcanza la saturación de la luminescencia. Ajustar el intervalo de tiempo según la absorción de D-Luciferin/señal.
- Utilizar CO2 para sacrificar a los ratones una vez que se llega a la terminación del experimento.
-
Ya que este es un modelo diseminado MM, proceso de los ratones como sigue.
- Pesar el ratón antes de la disección.
- Recolección de sangre periférica desde el corazón para un ensayo de conteo sanguíneo completo (CSC) realizado por una máquina contadora de células de la sangre. Las cuentas de glóbulos blancos y glóbulos rojos, así como la proporción de linfocitos, que es los índices principales.
- Aislar el bazo y pésalo. Calcular el cociente del peso corporal del bazo; examinar > 0.5% como agrandamiento del bazo.
- Recoge los tejidos de la médula ósea, bazo, ganglios linfáticos, riñón y el tejido con metástasis visible.
- Recoger la columna si el ratón desarrolló una parálisis de las extremidades inferiores.
- Extracto de RNA y proteína de las muestras de médula ósea.
- Fijar todos los restantes tejidos en formalina.
- Para descalcificación, sumergir las muestras de hueso en solución de 0,25 M de EDTA (pH 8.0) durante 5 días después de 24 horas de fijación.
- Sumergir las muestras en alcohol al 75% para el almacenamiento a largo plazo.
- Comparar la intensidad de la señal de luciferasa en los mismos puntos de tiempo en dos grupos. De ambos grupos, registrar las fechas de sacrificio de cada ratón y calcular las curvas de supervivencia de los dos grupos con el software.
Nota: Todos los procedimientos se resumen en la figura 1.
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Representative Results
Para demostrar el efecto de inhibición de la gapmer anti-MALAT1 ADN en MM, había derribado de la expresión de MALAT1 y había usada en células H929 y MM.1S. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células fueron recogidas para el análisis de la eficiencia de la precipitación y el estado de apoptosis en las células transfected con control DNA o anti-MALAT1 gapmer. resultados de qRT-PCR demostrados que anti-MALAT1 gapmer ADN derribado la expresión MALAT1 en H929 y MM.1S las células eficientemente (figura 2A). Fue determinar el estado de apoptosis por citometría de flujo, que regula la MALAT1 inducida por apoptosis significativamente (figura 2B).
Estos resultados indican que los oligos de anti-MALAT1 inhiben MM con eficacia in vitro. Sin embargo, un método de entrega eficiente/shuttle para oligos de anti-MALAT1 en vivo necesita para desarrollarse, que es también el obstáculo de oligos antisentido en aplicación clínica; de ahí nuestro interés en SWCNT. SWCNT es un nuevo nanomaterial para administración de fármacos, que puede desarrollar hidrofilicidad y Disolubilidad después de modificaciones apropiadas; por lo tanto, pueden entregar cargos en diversas formas, tales como drogas del oligonucleótido. Para validar la eficiencia de la entrega de SWCNT en vivo, primero nos funcionalizados SWCNT con DSPE PEG2000 de aminas, que dota de especificidad hidrofilicidad y vinculante al SWCNT19. Entonces, este SWCNT funcional fue tratada con sulfo-LC-SPDP crear grupos sulfhidrilo libre, que se utilizará para conectar con el oligo. Para conjugar el oligo anti-MALAT1 y el SWCNT sulfo-LC-SPDP-tratados, los extremos 5' de la oligo anti-MALAT1 ha sido modificado con grupos tiol (S-S); para la pista visiblemente de la entrega, los extremos 3' de la oligo anti-MALAT1 fue modificado con Cianina 3 (Cy3). Después de todos los pasos de la síntesis, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 fue obtenida (figura 1)12. Luego, se añadió al medio de cultivo de células GFP H929 y MM.1S-GFP para validar la eficacia de la entrega.
Como se muestra en la figura 2C, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 eficientemente fue entregado en el núcleo de las células MM y suprimió significativamente el nivel de MALAT1 endógeno en H929 y MM.1S las células (figura 2D). Para examinar la toxicidad y seguridad de SWCNT en células normales, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 fue agregado en el medio de BMEC-1 células a diferentes concentraciones; Lipofectamine fue el control del tratamiento; se utilizó medio de llano como el indispensable control (figura 2E). Entonces, viabilidad celular fue detectada mediante un kit de ensayo de viabilidad celular en día 1, día 2 y día 3. No hubo diferencias significativas en la inhibición de la viabilidad celular se encontraron entre SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 y el control de tratamiento en diferentes dosis y momentos. No hubo ninguna diferencia en comparación con medio simple (NC), que indica que la toxicidad de SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 es similar al tratamiento control, que tiene una toxicidad aceptable y limitada a las células normales en dosis altas.
A continuación, un modelo de ratón diseminada humanos-MM se estableció para evaluar los efectos del tratamiento de SWCNT-anti-MALAT1 en vivo. En primer lugar, cada ratón SCID-beige (de 8 semanas de edad) fue inyectado con las células 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry intravenoso (figura 3). Un total de 14 ratones fueron inyectados con células MM.1S; entre ellos, siete ratones fueron arregladas al azar en un grupo de tratamiento de SWCNT-anti-MALAT1-Cy3, y otros siete fueron en el grupo control. SWCNT-anti-MALAT1 y control de SWCNT oligos fueron disueltos en 0,5 mL de 1 x PBS e inyectado por las venas de cola 7 días después de la inyección de células de tumor. El tratamiento de SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 se repitió cada 7 días hasta la finalización del experimento. Para evaluar la carga del tumor, la señal de luciferin fue observada por un sistema generador de imágenes en vivo (IVIS) 30 min después de la inyección de luciferin 1 x una semana antes de la inyección de SWCNT oligo. Encontramos que las señales de luciferin de los ratones en el grupo de tratamiento de SWCNT-anti-MALAT1 notablemente inferior fueron comparadas con los del grupo de tratamiento control de SWCNT después de 21 días de tratamiento (día 28). Su estado de salud y la supervivencia fue revisado y registrado cada día y resumido en una curva de Kaplan-Meier. De estos resultados, concluimos que el tratamiento SWCNT-anti-MALAT1 vía la inyección intravenosa puede ofrecer los oligos de anti-MALAT1 a las células del tumor con eficacia. Nosotros, entonces, limitada la carga tumoral y extendida duración de la vida de los ratones (p = 0.04) como era de esperar, que es similar a los resultados in vitro. No se encontró efectos secundarios significativos del tratamiento en los ratones durante el experimento entero, que indicó que la inyección de SWCNT-anti-MALAT1 es un tratamiento seguro para los ratones; por lo tanto, SWCNT es un sistema de entrega en vivo seguro y confiable para anti-MALAT1.
Figura 1 : Esquema de la síntesis, absorción, y disociación in vivo de un oligo de SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer. (A) SWCNT funcionalizado con DSPE PEG2000 de aminas y, posteriormente, conjugado con anti-MALAT1-Cy3 vía acoplamiento del disulfuro mediada por Sulfo-LC-SPDP. (B) SWCNT conjugado anti-MALAT1 se inyectó a un ratón con células MM.1S-Luc-mCherry vía la vena de la cola. (C) SWCNT conjugado anti-MALAT1 penetra la membrana de bicapa de fosfolípidos a través de la inserción o endocitosis. (D) SWCNT-anti-MALAT1 fue empaquetado dentro de endosomas tempranos después de la absorción por las células; Luego, el endosome temprano madurado a un último endosome y se fusiona con un lisosoma para formar un endolysosome. El endolysosome ayuda a liberar anti-MALAT1 de la SWCNT rompiendo el enlace disulfuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : SWCNT-anti-MALAT1 fue entregado eficientemente con mínima toxicidad e indujo apoptosis en líneas celulares MM. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo o control SWCNT oligo fueron transfectadas por Lipofectamine en células H929 y MM.1S, respectivamente. Cuarenta y ocho horas más tarde, recogimos las células para (A) el análisis de la expresión MALAT1 por qRT-PCR y (B) análisis de apoptosis por citometría de flujo. (C) H929-GFP y MM.1S-GFP de células fueron cultivadas conjuntamente con SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 durante 48 horas; la eficiencia de entrega se determinó mediante microscopio de fluorescencia (las barras de escala = 100 μm). (D) el ofMALAT1 nivel de expresión fue detectado por qRT-PCR, que demostró que con éxito fue golpeado abajo en células H929 y MM.1S (** p < 0.01, *** p < 0.001). SWCNT (E) y el control de tratamiento fueron agregados en un medio de cultivo de células BMEC-1 a dosis diferentes. La proliferación se midió usando un kit de ensayo de viabilidad celular. Esta figura ha sido modificada desde Hu et al16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : SWCNT-anti-MALAT1 suprimido mieloma en modelo de ratón diseminada MM construcción de celda MM.1S. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry células fueron inyectadas por vía intravenosa a las venas de la cola de los ratones de SCID-beige irradiados (siete en cada grupo); 50 μL de una solución de SWCNT-control o SWCNT-anti-MALAT1 se inyectaron cada 7 días vía la vena de la cola desde el día 7 después de la inyección de células MM.1S. IVIS fue utilizada para supervisar el crecimiento del tumor. (B) extremidades parálisis y tumor de carga fueron utilizados como criterios de valoración, y los datos de supervivencia se analizaron mediante un análisis de Kaplan-Meier. Esta figura ha sido modificada de Hu et al16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La evidencia ha mostrado que lncRNAs participar en la regulación de numerosos procedimientos fisiológicos y patofisiológicos de cánceres, incluyendo el m7,8,9; tienen el potencial de ser objeto de tratamiento del cáncer, que puede ser realizado por oligonucleótidos antisentido20,21,22. La U.S. Food y Drug Administration (FDA) ha aprobado varias drogas de oligonucleótidos antisentido, incluyendo fomivirsen para citomegalovirus retinitis23, mipomersen en hipercolesterolemia familiar homocigótica24, nusinersen para atrofia muscular espinal25y eteplirsen para distrofia muscular de Duchenne26. En este estudio, había modificado gapmer anti-MALAT1 ADN con 2'-OMe-RNA y había conjugado con SWCNT funcional. El SWCNT lleva y entrega oligos de anti-MALAT1 como una lanzadera, que no sólo mejora la afinidad de la oligo-blanco debido a su flexibilidad y carga múltiples pero también estabiliza los oligos y ayudó a evitar la degradación nucleasas durante el parto27 .
Una modificación adecuada en la superficie de NTCSPs puede ayudar conseguir dispersabilidad confiable en ambientes acuosos, fisiológicamente relevantes y promover su biodistribución28,29. Hemos utilizado DSPE-PEG2000-amina modificar SWCNT, que se ha demostrado que el injerto de SWCNT y mejorar la solubilidad acuosa de la misma, y además, mostró excelente estabilidad sin aglomeración en medios biológicos30. Sulfo-LC-SPDP fue utilizado como un crosslinker en el experimento, que ayudó a SWCNT funcionalizado para atar el gapmer anti-MALAT1 ADN a través del enlace de disulfuro y posteriormente entregarlos en las células. Una vez que el SWCNT penetraron en las células MM, se toman hasta por endosomas tempranos (pH ~ 6.0), que entonces maduraron a finales endosomas (pH ~ 5.0) acompañado de un valor pH bajo de31. La ventaja de la conexión de la clavija es que la vinculación es estable a pH > 6, pero hasta el 75-95% de la droga PEG-ligado fue lanzado dentro de 2 horas una vez que el pH se convirtió menos de 5.532,33,34. Endosomas llevar SWCNT-anti-MALAT1 se fusionaron con lisosomas (pH ~ 4.5) para formar un endolysosome y, a continuación, el disulfuro de bonos fueron catalizados por reductasa tiol lysosomal, que activó óptimamente a un pH bajo35. Esto, posteriormente, liberados libre anti-MALAT1 gapmer ADN. Según los resultados del experimento in vitro e in vivo, el SWCNT había entregado SWCNT-anti-MALAT1 efectivamente y la ayudó a actuar del mismo modo en función de anti-MALAT1 in vitro.
El paso de NTCSPs funcionalizado por bilayer del fosfolípido por dos patrones: inserción36,37 y endocitosis38,39. Estos procedimientos ayudan a lo SWCNT entregar cargos en células sin interrumpir la estabilización de las membranas celulares, por lo tanto reduce la toxicidad de la SWCNT. Inyecta 50 μl de SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) en cada ratón (~ 20 g); así, la concentración de la droga final fue 0,1 mg/kg, que es mucho menor que la dosis que utilizamos en los experimentos de toxicidad (2 mg/L y 4 mg/L). Como anteriores resultados muestran, SWCNT tiene un efecto similar como el control de tratamiento (por ejemplo, Lipofectamine) sobre el crecimiento celular y viabilidad en emparejados dosis. El control de tratamiento es un reactivo común para la transfección de la célula y se cree que tiene una toxicidad aceptable y limitada a las células; así, creemos que SWCNT sólo tiene una mínima toxicidad para las células normales.
Como una lanzadera para oligonucleótidos antisentido, el metabolismo es otra consideración importante para la seguridad de SWCNT. Se ha demostrado que SWCNT funcionalizado es principalmente excretado por los riñones, sin toxicidad glomerular y tubular40. No se encontró riñón síntomas relacionados con la disfunción, como oliguria, anuria, edema, cambios de aspecto del riñón, etc., en ratones que la inyección de SWCNT. Por lo tanto, NTCSPs no tienen toxicidad efectos debido a la acumulación anormal en un ratón con una función renal normal.
Son los primeros en conjugar oligonucleótidos anti-sentido a lncRNA con SWCNT funcionalizado y utilizarlo para el tratamiento del MM. SWCNT es un tipo de nanomaterial novela, que tiene quiralidad constante, diámetro opcional y la distribución de la longitud. Después del tratamiento de funcionalización, NTCSPs desarrollan solubilidad en agua y biocompatibilidad y convertirse en un servicio de transporte biológico ideal para entregar la carga numerosas a través de la membrana celular, así aumentando la distribución de medicamentos y mejorar el efecto del tratamiento. Además, SWCNT puede estabilizar moléculas del oligonucleótido anti-sentido de nucleasa digestión1. Los resultados muestran, SWCNT-anti-MALAT1 funcionalizados entrega MALAT1 en las células MM eficientemente como inhibió crecimiento MM dramáticamente en líneas celulares in vitro y en un modelo de ratón diseminada en vivo. Hasta el momento, no observamos ninguna toxicidad debido al tratamiento de SWCNT en estos experimentos. Este estudio demuestra que SWCNT es un vehículo de entrega segura y eficaz de drogas oligonucleótidos antisentido y tiene el potencial para ser utilizado como un portador para moléculas terapéuticas en pacientes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el Instituto de Investigación Lerner proteómicos, genómicos y núcleos de proyección de imagen para su ayuda y apoyo. Financiación: Este trabajo fue apoyado financieramente por la subvención del NIH/NCI R00 CA172292 (a J.J.Z.) y fondos de puesta en marcha (a J.J.Z.) y la clínica y traslacional ciencia colaborativa (CTSC) de caso Western Reserve University base utilización piloto (a J.J.Z.). Este trabajo utilizó el microscopio confocal Leica SP8 que fue comprado con fondos de los institutos nacionales de salud SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
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