Summary

Fluorimetric טכניקות להערכה של ממברנות זרע

Published: November 28, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים מתודולוגיות להעריך spermatozoan הקרומיות, הסלולר תכונה המשויכת מיומנות ההפריה של הזרע. אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה fluorimetric של זרע ממברנות: צביעת בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות cytometry זרימה זרע ייעודיים מתקדמים. דוגמאות של שילוב מתודולוגיות של מוצגים.

Abstract

Spermiograms סטנדרטית המתארת איכות הזרע מתבססים בעיקר על הפרמטרים פיזיולוגיים וחזותית, כמו לפלוט נפח, ריכוז, תנועתיות, תנועתיות מתקדמת, ו זרע-מורפולוגיה הכדאיות. עם זאת, הערכות אלה לא מספיק טוב כדי לנבא את איכות הזרע. בהתחשב בכך תחזוקה של זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה תלוי הקרומיות ופונקציונליות תאיים, הערכה של פרמטרים אלה עשויות לאפשר חיזוי טוב יותר של מיומנות ההפריה של הזרע. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות האפשריים כדי להעריך את איכות הזרע שימוש ספציפי הגששים פלורסנט בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ או לזרום cytometry ניתוחים. ניתוחים העריכו propidium יודיד (PI), הקרומיות acrosomal באמצעות fluorescein מצומדת isothiocyanate של קרום פלזמה תקינות באמצעות 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) אפון השדה agglutinin (FITC-PSA) ו מיטוכונדריאלי הקרומיות באמצעות 5, 5′, 6, 6′-טטרה-כלורו-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1). שילובים של שיטות אלה מוצגים. למשל, השימוש annexin V בשילוב עם PI fluorochromes מאפשר הערכת אפופטוזיס וחישוב שיעור אפופטוטיים להיפגע זרע (אפופטוטיים להיפגע אינדקס). אנו מאמינים כי שיטות אלה, אשר מבוססים על בחינת ממברנות תא זרע, הם מאוד שימושי עבור הערכת איכות הזרע.

Introduction

שלמות והפונקציונליות של ממברנות זרע הם כמה הגורמים המציין זרע הכדאיות ואת פוטנציאל הפריה. קרום פלזמה משמש כמחסום בין תאים תאיים, חוץ-תאית, ובכך שמירה על שיווי משקל osmotic הסלולר1. מתח שגורם נזק שלמות קרום פלזמה עלול לפגום הומאוסטזיס, תצמצם הקיבולת הכדאיות, הפריה ולהגדיל מוות של תאים. למשל, הקפאה קריוגנית מפחיתה את הכדאיות זרע עקב נזק שלה קרום פלזמה, עקב שינויי טמפרטורה ומתח osmotic2. בעבר דיווחנו כי חשיפת זרע בול ריכוזים נמוכים של והקאה מזהמים כגון מסוג אטרזין של חומרי הדברה, diaminochlorotriazine העיקריים המטבוליט שלה או את aflatoxin mycotoxin B1, מפחית את הזרע הכדאיות1,3 . זה נקבע על-ידי תיוג ה-DNA גדילי כפול עם דאפי בשילוב עם PI, אשר נקשר ה-DNA של תאים עם קרום פלזמה פגום.

תגובה acrosome (AR) כרוך פיוז’ן של קרום acrosome החיצוני של קרום פלזמה שמעליה וכתוצאה מכך שחרורו של אנזימים acrosomal4,5. אלה אירועים חיוני עבור חדירה zona-pellucida ומיזוג נוסף של הזרע עם oocyte6. לכן, הערכת הקרומיות acrosomal מהווה פרמטר שימושי כדי להעריך את איכות תאי הזרע ואת פוריות הגבר-7,8,9. מספר טכניקות פלורסנט מתאימים עבור אימות תקינות acrosome, FITC-הרשות הפלסטינית או FITC-PSA8,10. במחקרים קודמים שלנו, באמצעות דפוסי FITC-PSA מכתימים1,3, סיפק הגדרות מדויקות עבור (i) acrosome ללא פגע, (ii) פגום acrosome ממברנה ואנו (iii) הגיב acrosome. בדו ח הנוכחי, לנו להעריך את מצב acrosome באמצעות cytometry זרימה ייעודיים זרע ולהשוות את התוצאות לאלה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.

המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles מעורב ב, בין אחרים דברים, ATP סינתזה, ייצור מינים חמצן תגובתי, סידן איתות אפופטוזיס. תפקוד פיזיולוגי, כולל פוריות זכר ונקבה, הם קשורים פונקציה מיטוכונדריאלי שונה11. זרע המיטוכונדריה מסודרים של midpiece, לשחק תפקיד מכריע תנועתיות הזרע12. זה מקובל גם גבוהה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית (ΔΨm) מזוהה עם נורמלי תנועתיות הפריה גבוהה קיבולת13. לעומת זאת, ΔΨm נמוכה קשורה עם רמה גבוה של מינים חמצן תגובתי שומן מופחתת הפריה שיעור14. בכל זאת, תרכובות סביבתיים שונים, למשל האנדוקרינית משבשים, יכול לגרום מתח סלולארית, להוביל גידול ארעי של ΔΨm, hyperpolarization1,3, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים, בסופו של דבר. אפופטוזיס15. החללית פלורסנט 5, 5′, 6, 6′-טטרה-כלורו-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine יודיד (JC-1) מאפשר בחינת לדוגמה, את ההשפעות של רעלים והקאה על זרע ΔΨm1,3.

Spermiograms סטנדרטי, בהתבסס על פרמטרים פיזיולוגיים, מורפולוגיים, אינם טובים מספיק לחזות ספירת זרע. שיטות מדויקות יותר נדרשים כדי להבטיח את איכות הזרע. כאן, אנו מספקים שתי שיטות האפשריים כדי לקבוע את איכות הזרע בהתבסס על הערכות של זרע ממברנות: צביעת מרובע בו זמנית עם הגששים פלורסנט ספציפיים, מיקרוסקופ פלורסצנטיות, תיאר ב שלנו מחקרים1,3 cytometry זרימה מתקדמות ייעודיים זרע, מנוצל לאחרונה המעבדה שלנו, כבר נמצא בשימוש על-ידי אחרים16,17,18.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ישראל 1994 עבור רווחת בעלי חיים. זרע שור סופקו על ידי חברה ישראלית מסחרית עבור הזרעה והשבחה. שופך של שוורים 11 הוערכו במחקר זה. 1. זרע מדגם הכנה הערה: התהליך מבוסס על המעבדה רוט פרוטוקול1,3. <o…

Representative Results

איור 1 מראה fluorimetric בו זמנית הערכה של זרע ממברנות (פלזמה, acrosomal ו מיטוכונדריאלי) שימוש PI, דאפי, FITC-PSA, JC-1. הערכה של ממברנות הזרע באמצעות צביעת בו זמנית עם ארבעה מכשירי בדיקה פלורסנט מאפשר, לדוגמה, הערכת שיעור זרע בכל קטגוריה – חיים לעומת המלח; גבוה לעומת<…

Discussion

פוטנציאל הפריה זרע תלויה בגורמים מרובים המשקף את איכותם. ריכוז גבוה של spermatozoa, שיעור גבוה של spermatozoa מאוד בהדרגה תאי עשוי להיחשב זרע באיכות גבוהה. למרות זאת, כזה הערכה לא לקחת בחשבון פרמטרים אחרים התאית ופונקציונליים. השימוש microcapillary ‘ספסל-top’ זרימת cytometer ניתן להתאים בקלות להערכה של מבנים זרע ש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות “שיאון” חברה ישראלית עבור הזרעה והשבחה (חפץ-חיים, ישראל) על עזרתם שיתוף פעולה, ואת גברת Li Na (IMV טכנולוגיות, l ‘ aigle, צרפת) לקבלת סיוע עם כלי התקנה, הדרכה.

Materials

NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20X stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Play Video

Cite This Article
Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

View Video