Summary

Fluorimetric teknikker for vurdering av Sperm membraner

Published: November 28, 2018
doi:

Summary

Her presenterer vi metoder for å evaluere spermatozoan membran integritet, en cellular funksjon knyttet sperm befruktning kompetanse. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetric vurdering av sæd membraner: samtidige flekker med bestemte fluorescerende sonder, fluorescens mikroskopi og avanserte sæd-dedikert flowcytometri. Eksempler på kombinerte metodikkene er også presentert.

Abstract

Standard spermiograms som beskriver kvaliteten er stort sett basert på fysiologiske og visuelle parametere, for eksempel ejaculate volum og konsentrasjon, motilitet og progressiv motilitet, og sæden morfologi og levedyktighet. Men er ingen av disse vurderingene god nok til å forutsi sædkvalitet. Gitt at vedlikehold av sæd levedyktighet og gjødsling potensielle avhenger av membran integritet og intracellulær funksjonalitet, kan evaluering av disse parameterne gjøre en bedre forutsigelse av sæd befruktning kompetanse. Her beskriver vi tre mulige metoder for å vurdere kvaliteten med bestemte fluorescerende sonder kombinert med fluorescens mikroskopi eller flyt cytometri analyser. Analyser vurdert plasma membranen integritet med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium iodide (PI), acrosomal membran integritet ved hjelp av fluorescein isothiocyanate-konjugerte erter sativum agglutinin (FITC-PSA) og Mitokondrielt membran integritet bruker 5, 5′, 6, 6′-tetra-klor-1, 1″, 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Kombinasjoner av disse metodene er også presentert. For eksempel bruk av annexin V kombinert med PI fluorochromes kan vurdere apoptose og beregne andelen apoptotisk sperm (apoptotisk indeks). Vi tror at disse metodene, som er basert på å undersøke spermatozoon membraner, veldig nyttig for vurdering av kvaliteten.

Introduction

Integritet og funksjonaliteten av sæd membraner er noen av faktorene som angir sperm levedyktighet og gjødsling potensielle. Plasma membranen fungerer som en barriere mellom intracellulær og ekstracellulære avdelinger, og dermed opprettholde det cellular osmotisk likevekt1. Noen stress som induserer skade integriteten plasma membranen kan svekke homeostase, redusere levedyktighet og gjødsling kapasitet og øke celledød. For eksempel reduserer kryonisk bevaring sperm levedyktighet skyldes skader på sin plasma membran, temperaturendringer og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapportert at utsette bull sædcellene å lave konsentrasjoner av matbårne miljøgifter som plantevernmidler atrazine, sin hovedmetabolitten diaminochlorotriazine eller mycotoxin aflatoxin B1, reduserer sperm levedyktighet1,3 . Dette ble bestemt av merking double-strandet DNA med DAPI i kombinasjon med PI, som binder seg til DNA av celler med en skadet plasma membran.

Acrosome reaksjon (AR) innebærer blanding av ytre acrosome membranen og overliggende plasma membranen som resulterer i utgivelsen av acrosomal enzymer4,5. Dette er viktige hendelser for zona-pellucida gjennomtrenging og ytterligere sammenslåing av sæd med oocyte6. Evaluering av acrosomal membran integritet utgjør derfor en nyttig parameter for å evaluere sædkvalitet og mannlig fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er egnet for verifisering av acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våre tidligere studier, bruke mønstre av FITC-PSA flekker1,3, vi følger nøyaktig definisjoner for (i) intakt acrosome, (ii) skadet acrosome membran og (iii) reagerte acrosome. Gjeldende rapporten vi evaluere acrosome status ved hjelp av sæd-dedikert flowcytometri og sammenligner resultatene til de som bruker fluorescens mikroskopi.

Mitokondrier er multifunksjonell organelles involvert, blant andre ting, ATP syntese, reaktive oksygen arter produksjon, kalsium signalering og apoptose. Fysiologiske dysfunksjoner, herunder mannlige og kvinnelige ufruktbarhet, knyttes endret mitokondrie funksjonen11. Sperm mitokondrier ordnes i midpiece og spille en avgjørende rolle i sperm motilitet12. Det er godt akseptert at høy mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er tilknyttet normal motilitet og høy befruktning kapasitet13. I kontrast, lav ΔΨm er forbundet med et forhøyet nivå av frie radikaler og redusert befruktning rate14. Likevel, ulike miljømessige forbindelser, for eksempel endokrine disruptors, kan indusere mobilnettet stress og føre til en midlertidig økning i ΔΨm, hyperpolarization1,3, økt produksjon av frie radikaler og til slutt, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5′, 6, 6′-tetra-klor-1, 1″, 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) kan for eksempel undersøke effektene av matbårne giftstoffer på sperm ΔΨm1,3.

Standard spermiograms, basert på fysiologiske og morfologiske parametere, er ikke god nok til å forutsi sædkvalitet. Mer nøyaktig metoder er nødvendig for å sikre kvaliteten. Her gir vi to mulige metoder for å fastslå kvaliteten basert på vurderinger av sæd membraner: samtidige firemannsrom farging med bestemte fluorescerende sonder og fluorescens mikroskopi, beskrevet i våre studier1,3 og avanserte sæd-dedikerte flowcytometri, nylig benyttet i vårt laboratorium, og allerede brukes av andre16,17,18.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført i 1994 israelske retningslinjer for dyrevelferd. Storfe sperm ble levert av kommersielle israelsk selskap for kunstig insemination og avl. Ejakulerer av 11 okser ble vurdert i denne studien. 1. sperm prøve forberedelse Merk: Prosedyren er basert på Roth laboratoriet er protokollen1,3. Få ca 1 – 6 mL av bull sæd i en 15 mL tube ved romtemperatur…

Representative Results

Figur 1 viser samtidige fluorimetric vurdering av sæd membraner (plasma, acrosomal og mitokondrie) bruker PI, DAPI, FITC-PSA og JC-1. Vurdering av sæd membraner bruker samtidige farging med fire fluorescerende sonder tillater, for eksempel vurdere andelen sperm i hver kategori-live vs døde. høy og lav ΔΨm; intakt vs. skadet acrosome-samtidig i hver spermatozoon. <str…

Discussion

Sperm befruktning potensielle avhenger av flere faktorer som reflekterer kvaliteten. En høy konsentrasjon av spermatozoa og en høy andel av svært gradvis motile spermatozoa kan anses som høy kvalitet sæd. Likevel slike en evaluering tar ikke hensyn til andre cellulære og funksjonelle parametere. Bruk av “benk-topp” microcapillary flyt cytometer kan enkelt tilpasses til evaluering av ulike sperm strukturer med fluorescerende sonder, som tidligere vist av andre17 og demonstrert her (teknikk #3…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke “SION” israelsk selskap for kunstig insemination og avl (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjelp og samarbeid og Ms. Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Frankrike) for hjelp med instrumentet oppsett og trening.

Materials

NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20X stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Play Video

Cite This Article
Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

View Video