Fluorimetric teknikker for vurdering av Sperm membraner
Summary
Her presenterer vi metoder for å evaluere spermatozoan membran integritet, en cellular funksjon knyttet sperm befruktning kompetanse. Vi beskriver tre teknikker for fluorimetric vurdering av sæd membraner: samtidige flekker med bestemte fluorescerende sonder, fluorescens mikroskopi og avanserte sæd-dedikert flowcytometri. Eksempler på kombinerte metodikkene er også presentert.
Abstract
Standard spermiograms som beskriver kvaliteten er stort sett basert på fysiologiske og visuelle parametere, for eksempel ejaculate volum og konsentrasjon, motilitet og progressiv motilitet, og sæden morfologi og levedyktighet. Men er ingen av disse vurderingene god nok til å forutsi sædkvalitet. Gitt at vedlikehold av sæd levedyktighet og gjødsling potensielle avhenger av membran integritet og intracellulær funksjonalitet, kan evaluering av disse parameterne gjøre en bedre forutsigelse av sæd befruktning kompetanse. Her beskriver vi tre mulige metoder for å vurdere kvaliteten med bestemte fluorescerende sonder kombinert med fluorescens mikroskopi eller flyt cytometri analyser. Analyser vurdert plasma membranen integritet med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og propidium iodide (PI), acrosomal membran integritet ved hjelp av fluorescein isothiocyanate-konjugerte erter sativum agglutinin (FITC-PSA) og Mitokondrielt membran integritet bruker 5, 5′, 6, 6′-tetra-klor-1, 1″, 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Kombinasjoner av disse metodene er også presentert. For eksempel bruk av annexin V kombinert med PI fluorochromes kan vurdere apoptose og beregne andelen apoptotisk sperm (apoptotisk indeks). Vi tror at disse metodene, som er basert på å undersøke spermatozoon membraner, veldig nyttig for vurdering av kvaliteten.
Introduction
Integritet og funksjonaliteten av sæd membraner er noen av faktorene som angir sperm levedyktighet og gjødsling potensielle. Plasma membranen fungerer som en barriere mellom intracellulær og ekstracellulære avdelinger, og dermed opprettholde det cellular osmotisk likevekt1. Noen stress som induserer skade integriteten plasma membranen kan svekke homeostase, redusere levedyktighet og gjødsling kapasitet og øke celledød. For eksempel reduserer kryonisk bevaring sperm levedyktighet skyldes skader på sin plasma membran, temperaturendringer og osmotisk stress2. Vi har tidligere rapportert at utsette bull sædcellene å lave konsentrasjoner av matbårne miljøgifter som plantevernmidler atrazine, sin hovedmetabolitten diaminochlorotriazine eller mycotoxin aflatoxin B1, reduserer sperm levedyktighet1,3 . Dette ble bestemt av merking double-strandet DNA med DAPI i kombinasjon med PI, som binder seg til DNA av celler med en skadet plasma membran.
Acrosome reaksjon (AR) innebærer blanding av ytre acrosome membranen og overliggende plasma membranen som resulterer i utgivelsen av acrosomal enzymer4,5. Dette er viktige hendelser for zona-pellucida gjennomtrenging og ytterligere sammenslåing av sæd med oocyte6. Evaluering av acrosomal membran integritet utgjør derfor en nyttig parameter for å evaluere sædkvalitet og mannlig fertilitet7,8,9. Flere fluorescerende teknikker er egnet for verifisering av acrosome integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våre tidligere studier, bruke mønstre av FITC-PSA flekker1,3, vi følger nøyaktig definisjoner for (i) intakt acrosome, (ii) skadet acrosome membran og (iii) reagerte acrosome. Gjeldende rapporten vi evaluere acrosome status ved hjelp av sæd-dedikert flowcytometri og sammenligner resultatene til de som bruker fluorescens mikroskopi.
Mitokondrier er multifunksjonell organelles involvert, blant andre ting, ATP syntese, reaktive oksygen arter produksjon, kalsium signalering og apoptose. Fysiologiske dysfunksjoner, herunder mannlige og kvinnelige ufruktbarhet, knyttes endret mitokondrie funksjonen11. Sperm mitokondrier ordnes i midpiece og spille en avgjørende rolle i sperm motilitet12. Det er godt akseptert at høy mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er tilknyttet normal motilitet og høy befruktning kapasitet13. I kontrast, lav ΔΨm er forbundet med et forhøyet nivå av frie radikaler og redusert befruktning rate14. Likevel, ulike miljømessige forbindelser, for eksempel endokrine disruptors, kan indusere mobilnettet stress og føre til en midlertidig økning i ΔΨm, hyperpolarization1,3, økt produksjon av frie radikaler og til slutt, apoptose15. Fluorescerende sonden 5, 5′, 6, 6′-tetra-klor-1, 1″, 3, 3-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1) kan for eksempel undersøke effektene av matbårne giftstoffer på sperm ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, basert på fysiologiske og morfologiske parametere, er ikke god nok til å forutsi sædkvalitet. Mer nøyaktig metoder er nødvendig for å sikre kvaliteten. Her gir vi to mulige metoder for å fastslå kvaliteten basert på vurderinger av sæd membraner: samtidige firemannsrom farging med bestemte fluorescerende sonder og fluorescens mikroskopi, beskrevet i våre studier1,3 og avanserte sæd-dedikerte flowcytometri, nylig benyttet i vårt laboratorium, og allerede brukes av andre16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperm befruktning potensielle avhenger av flere faktorer som reflekterer kvaliteten. En høy konsentrasjon av spermatozoa og en høy andel av svært gradvis motile spermatozoa kan anses som høy kvalitet sæd. Likevel slike en evaluering tar ikke hensyn til andre cellulære og funksjonelle parametere. Bruk av “benk-topp” microcapillary flyt cytometer kan enkelt tilpasses til evaluering av ulike sperm strukturer med fluorescerende sonder, som tidligere vist av andre17 og demonstrert her (teknikk #3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke “SION” israelsk selskap for kunstig insemination og avl (Hafetz-Haim, Israel) for deres hjelp og samarbeid og Ms. Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Frankrike) for hjelp med instrumentet oppsett og trening.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
