Summary

Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için

Published: November 28, 2018
doi:

Summary

Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.

Abstract

Standart spermiograms sperm kalitesini açıklayan çoğunlukla ejakülat hacmi ve konsantrasyonu, hareketliliği ve ilerici hareketliliği ve sperm morfolojisi ve canlılık gibi fizyolojik ve görsel parametreleri temel alır. Ancak, bu değerlendirmeler sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değil. Sperm canlılığı ve döllenme potansiyel bakım membran bütünlüğü ve hücre içi işlevine bağlıdır göz önüne alındığında, bu parametrelerin değerlendirilmesi daha iyi bir tahmin sperm fertilizasyon yeterlilik etkinleştirmek. Burada, floresan mikroskopi veya akış sitometresi analizleri ile birlikte belirli floresan problar kullanarak sperm kalitesini değerlendirmek için üç uygun yöntemleri açıklanmaktadır. Analizleri değerlendirildi plazma membran bütünlüğü (DAPI) 4′, 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak ve propidium iyodür (PI), acrosomal membran bütünlüğü floresein isothiocyanate Birleşik kullanarak Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) ve Mitokondrial membran bütünlüğü kullanarak 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1). Bu yöntemler kombinasyonları da sunulmaktadır. Örneğin, V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte. Spermatozoon membranlar inceleyerek üzerinde temel alır, bu metodolojileri sperm kalitesinin değerlendirilmesi için çok yararlı olduğuna inanıyoruz.

Introduction

Bütünlük ve sperm membran işlevselliğini sperm canlılığı ve fertilizasyon potansiyeli gösteren faktörlerden birkaçıdır. Plazma zarı böylece hücresel ozmotik denge1bakımı, hücre içi ve hücre dışı bölmeleri arasında bir bariyer görevi görür. Plazma membran bütünlüğü zarar indükler herhangi bir stres homeostazı bozabilir, canlılık ve döllenme kapasite azaltmak ve hücre ölümü artırmak. Örneğin, dondurma sperm canlılığı nedeniyle sıcaklık değişiklikleri ve ozmotik stres2bir sonucu olarak onun plazma zarı zarar azaltır. Biz daha önce gıda kaynaklı kirleticiler pestisit atrazine, onun büyük metaboliti diaminochlorotriazine veya mikotoksin Aflatoksin B1, gibi düşük konsantrasyonlarda boğa sperm açığa sperm canlılığı1,3 azaltır rapor . Bu PI, hasarlı bir plazma zarı içeren hücrelerin DNA bağlar ile birlikte çift iplikçikli DNA DAPI ile etiketleme tarafından tespit edilmiştir.

Füzyon acrosomal enzimler4,5sürümde kaynaklanan örten plazma zarı ve dış acrosome membran acrosome reaksiyon (AR) içerir. Zona pelusida penetrasyon ve daha fazla sperm yumurta6ile birleştirilmesi için önemli olaylar bunlar. Bu nedenle, acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi erkek üreme7,8,9ve sperm kalitesini değerlendirmek için yararlı bir parametre kabul ettiğiniz anlamına gelir. Çeşitli floresan teknikler acrosome bütünlüğü, FITC-PNA uygulamasına ait veya FITC-PSA8,10doğrulaması için uygundur. FITC-PSA boyama1,3, kalıpları kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz sağlam acrosome doğru tanımları (ı) için sağlanan (II) zarar acrosome membran ve (iii) acrosome tepki gösterdi. Geçerli rapordaki sperm adanmış akış sitometresi kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek ve bu floresans mikroskobu kullanarak sonuçları karşılaştırın.

Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri, diğer şeyler, ATP sentezi, reaktif oksijen türleri üretim, kalsiyum sinyal ve Apoptozis arasında yer vardır. Fizyolojik işlev bozuklukları, kısırlık, erkek ve kadın da dahil olmak üzere değiştirilmiş mitokondriyal işlev11ile ilişkilidir. Sperm mitokondri midpiece içinde düzenlenir ve sperm hareketliliği12‘ çok önemli bir rol oynamaktadır. İyi yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) yüksek fertilizasyon kapasitesi13ve normal hareket ile ilişkili olduğunu kabul edilir. Buna ek olarak, düşük ΔΨm reaktif oksijen türleri yükseltilmiş bir düzeyiyle ilişkilidir ve döllenme oranı14düşük. Yine de, çeşitli çevresel bileşenleri, örneğin Endokrin bozucular, hücresel stres teşvik ve ΔΨm, hyperpolarization1,3, artan üretim serbest radikallerin ve sonunda geçici bir artış yol, Apoptozis15. Floresan sonda 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1) sağlar örneğin, sperm ΔΨm1,3gıda kaynaklı toksinler etkilerini inceleyerek.

Standart spermiograms fizyolojik ve morfolojik parametreleri temel alınarak, sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değildir. Daha doğru yöntemleri sperm kalitesini sağlamak için gereklidir. Burada, sperm membran değerlendirme üzerinde dayalı sperm kalitesini belirlemek için kullanabileceğiniz iki uygun yöntem sağlamak: aynı anda dört kişilik belirli floresan problar ve bizim çalışmalar1,3 ‘ te açıklanan floresans mikroskobu ile boyama ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi, son zamanlarda kullanılan bizim laboratuvar ve başkaları tarafından zaten kullanılmakta16,17,18.

Protocol

Tüm deneyler için hayvan refah 1994 İsrail yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sığır sperm Suni tohumlama ve ıslahı için ticari İsrail şirketi tarafından sağlandı. Cinsel ilißki 11 boğa bu çalışmada değerlendirildi. 1. sperm hazırlama örnek Not: Yordamı Roth Laboratuvarı protokol1,3temel alır. Yaklaşık 1-6 mL, Boğa Meni oda sıcaklığınd…

Representative Results

Şekil 1 gösterir aynı anda fluorimetric sperm membran (plazma, acrosomal ve mitokondrial) değerlendirilmesi PI, DAPI, FITC-PSA ve JC-1 kullanarak. Aynı anda dört floresan problar ile boyama kullanarak sperm membran değerlendirmesini sağlar, örneğin, her kategoride sperm oranı değerlendirilmesi — canlı ölü vs ; yüksek ve düşük ΔΨm; sağlam vs. acrosome zarar — aynı anda her spermatozoon için. <p class="…

Discussion

Sperm fertilizasyon potansiyel çoklu kalitesini yansıtan faktöre bağlıdır. Sperm hücreleri yüksek konsantrasyon ve çok kademeli hareketli sperm hücreleri yüksek oranda yüksek kaliteli sperm kabul olabilir. Yine de, böyle bir değerlendirme dikkate almaz diğer hücresel ve fonksiyonel parametreler. ‘Tezgah üstü’ microcapillary akış sitometresi kullanımı floresan problar, daha önce başkaları tarafından17 gösterilen ve burada (tekniği #3) gösterildiği gibi kullanarak çeş…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar “SION” İsrail şirketi Suni tohumlama ve üreme (Hafetz-Haim, İsrail) için onların yardım ve işbirliği ve Bayan Li Na (te teknolojileri, L’Aigle, Fransa) araç kurulum ve eğitim ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] Sigma M1254
PBS Sigma P5493
DMSO Sigma D2438
Ethanol absolute Sigma 64-17-5
Hemacytometer Neubauer Germany hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542 fluorescent probe
PI (propidium iodide ) Sigma P4170 fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) Sigma L0770 fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) ENZOBiochem, New York, NY, USA ENZ52304 fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC MACS, Miltenyi Biotec 130-093-060 fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20X stock solution MACS, Miltenyi Biotec 130-092-820 buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u Nikon, Tokyo, Japan inverted fluorescence microscope
Nis Elements Nikon, Tokyo, Japan software
Nikon DXM1200F Nikon, Tokyo, Japan digital camera
Guava EasyCyte Plus IMV Technologies, L'Aigle, France microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies software
Buffered solution for cytometry IMV Technologies, L'Aigle, France 023862 buffer
Viability and concentration kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024708 kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 024864 kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit IMV Technologies, L'Aigle, France 025293 kit for acrosome integrity assessment
JMP-13 SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA software
Bovine sperm "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel

References

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

Play Video

Cite This Article
Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes. J. Vis. Exp. (141), e58622, doi:10.3791/58622 (2018).

View Video