قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية
Summary
ويصف هذا الأسلوب تسجيل الوقت الحقيقي لاستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في أنسجة الشبكية الماوس اكسبلانتيد محلل تدفق خارج الخلية باستخدام.
Abstract
رؤية عالية الحدة عملية استهلاك الطاقة بشكل كبير، والشبكية وقد وضعت عدة تعديلات فريدة من نوعها لتلبية هذه الطلبات مع المحافظة على الشفافية للمحور البصري تحديداً. اضطرابات بهذا التوازن الدقيق يسبب الأمراض المسببة للعمى، مثل اعتلال الشبكية السكري. ولذلك لا بد من تطوير العلاج العقلاني للأسباب المختلفة لفقدان الرؤية فهم تغيرات استقلاب الطاقة في الشبكية أثناء المرض. ظهور المحلﻻت التمويه المتاحة تجارياً خارج الخلية الأخيرة جعلت دراسة الأيض الطاقة الشبكية أكثر يسرا. ويصف هذا البروتوكول استعمال هذه محلل قياس المساهمات لإمدادات الطاقة الشبكية من خلال أسلحتها مبدأ اثنين-الفسفرة وتحلل-بالتحديد الكمي للتغيرات في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) وخارج الخلية معدلات التحمض (عكر) كوكلاء لهذه المسارات. يتم تنفيذ هذا الأسلوب سهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد، تيسير تقييم الاستجابات لعدة عوامل دوائية في تجربة واحدة. تتم مقارنة التوقيعات الأيضي في شبكية العين من الحيوانات التي تفتقر إلى ورود إشارات مستقبله إلى البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام هذا الأسلوب. قيداً رئيسيا في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين استخدام الطاقة داركادابتيد وتتكيف مع الضوء، الاعتبارات الفسيولوجية هامة في نسيج الشبكية.
Introduction
شبكية العين بين أنسجة معظم الطاقة تطالب في الجهاز العصبي المركزي1. مثل معظم الأنسجة، فإنه ينشئ الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق تحلل في سيتوسول أو عن طريق الفسفرة في الميتوكوندريا. ميزة حيوية من الفسفرة على تحلل لإنتاج ATP من جزيء واحد من السكر واضح: 36 جزيئات ATP الناتجة السابق مقابل 2 جزيئات ATP التي تم إنشاؤها من هذا الأخير. وبناء على ذلك، الخلايا العصبية الشبكية تعتمد أساسا على التنفس المتقدرية للإمداد بالطاقة وهذا ينعكس على كثافة عالية من الميتوكوندريا2. حتى الآن، الشبكية أيضا تعتمد اعتماداً كبيرا على الآلات جليكوليتيك حتى في حالة وفرة الأوكسجين. ووصفت هذه العملية تحلل الهوائية أصلاً في الخلايا السرطانية “أوتو واربورغ”3، الذين مرة لاحظ أن الشبكية الأنسجة فقط بعد انتهاء الانقسامية قادرة على هذا الشكل من الأيض4. منذ تلك الملاحظات الأولية، وقد وصف العديد من الأنسجة الانقسامية بعد القيام بدرجات متفاوتة من تحلل بالإضافة إلى الفسفرة لتلبية مطالبهم ATP.
فوتوترانسدوكشن، والصباغ البصرية إعادة التدوير، والتركيب الحيوي من شرائح الخارجي مستقبله، ونشاط متشابك، جميع العمليات تطلبا الطاقة في فوتوريسيبتورس، فئة فرعية العصبية الغالبة في الشبكية. ولكن الحاجة إلى النقل بنشاط الأيونات ضد تلك الكهربائية والتدرجات وتركيز هو إلى حد بعيد عملية تستهلك أكثر قوة في الخلايا العصبية1. فوتوريسيبتورس هي غريبة من الخلايا العصبية في الإحساس بأنهم ديبولاريزيد في غياب التحفيز (أي في الظلام)، بينما حافزا خفيفة يؤدي إغلاق القناة وفرط الاستقطاب اللاحقة. ولذلك، يستهلك الشبكية في الظلام، وكميات كبيرة من ATP الحفاظ على ديبولاريزيشن أو “الحالي الظلام” كما يطلق عليه عادة. من وجهة نظر تكيفية، تحديا كبيرا في توفير هذه الكميات الضخمة من ATP هو الحاجة للكائنات الحية للحفاظ على الوضوح البصري عن طريق المحور البصري. البنية الشبكية المقلوبة ينظر في المخلوقات الحديثة هو الحل المهيمنة، كما أنها تحافظ على الشبكة الشعرية الكثيفة توفير photoreceptors بعيداً عن مسار الضوء. ولكن هذه معجزة الهندسة البيولوجية الطبيعية يضع الشبكية في هاوية من حيث الاحتياطي الأيضية. الشتائم حتى الصغيرة للشبكية يمكن أن تعطل يحتمل أن التوازن الدقيق لإمدادات الطاقة للطلب، والخلل البصري أو عمي الصريح قد تنشأ بسرعة.
نظراً لمتطلبات حيوية فريدة من نوعها الشبكية العصبية، مقرونا قيود مشددة إمدادات الأوعية الدموية، ويمكن أن يكون القياس الدقيق لاستهلاك ATP في الشبكية والتغييرات أثناء المرض آثار عميقة في فهم وعلاج الظروف المسببة للعمى مثل التهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية السكري. عادة، تتطلب هذه القياسات معدات مكلفة، ومصممة خصيصا مع معظم الدراسات الناشئة من حفنة من مختبرات مكرسة تماما لقياس النشاط الأيضي2،،من56، 7،8. وتشمل تقنيات الاختبارات الفردية لنواتج الأيض محددة، دراسات التتبع باستخدام الراديو المسمى السلائف، استهلاك الأكسجين تسجيل باستخدام أقطاب كلارك والتنميط9metabolomic.
مع التقدم في تكنولوجيا عالية الإنتاجية، وزيادة توافر الأجهزة التجارية، تقنيات الأيض الشبكية سجل متزايدة وميسورة التكلفة. الأسلوب الموصوفة هنا يقيس كلا الفسفرة وتحلل في الشبكية باستخدام اكسبلانتيد الأنسجة والتمويه متاحة تجارياً خارج الخلية محلل9،10،،من1112. هذا المحلل بشكل منفصل يسجل معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر)، بمثابة المؤشرات غير المباشرة من الفسفرة وتحلل، على التوالي13. وتتم هذه القياسات بتحقيق سوبميرسيد داخل ميكروتشامبير تم إنشاؤها عبر الأنسجة لمصلحة. يستخدم هذا التكيف من أساليب المنشورة سابقا لوحة التقاط مصممة أصلاً للبنكرياس جزر لانجرهانز لتسجيل النشاط الأيضي في مقاطع صغيرة، دائرية الشبكية الماوس. يمكن تسليم التعرض دوائية متعددة للأنسجة أثناء تسجيل واحد لأن النظام يحتوي على 4 منافذ حقن لكل عينة أيضا. باستخدام هذا النظام مع بروتوكولات منفصلة الأمثل لتسجيلات عكر والتعرف الضوئي على الحروف، يمكن مقارنة ردود البرية من نوع شبكية العين على شبكية العين التي تفتقر إلى ترانسدوسين (Gnat1–/–)، سببا من أسباب خلقية ثابتة من العمى الليلي في 14من البشر.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعرف الضوئي على الحروف وعكر تقاس بسهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد باستخدام بيواناليزير استخدام الأساليب الموصوفة. ينطلق هذا الأسلوب من الفئات الأخرى في العديد من الخطوات الحاسمة. الأنسجة الشبكية المعزولة من خلال شق القرنية كبير دون انوكليتينج الكرة الأرضية، وصف أصلاً وينكلر<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور ألكسندر كولسنيكوف والدكتور فلاديمير كيفالوف لتقديم Gnat1-/-الفئران، لتغذية مرتدة مفيدة، والمشورة، وقراءة المخطوطة.
وأيد هذا العمل قبل EY025269 المعاهد الوطنية للصحة (RR)، مركز أبحاث السكري في جامعة واشنطن-DK020579 المعاهد الوطنية للصحة (جرم و RR)، “جائزة تطوير المهنة” من البحوث لمنع العمى (RR)، ومؤسسة هورنكريست (RR)، و “جائزة تطوير المهنة” من JDRF ( جرم)، المعاهد الوطنية للصحة DK101392 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK020579 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK056341 (لجنة الأمن الغذائي العالمي) و DK114233 (جرم).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
