Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys
Summary
Denna teknik beskriver realtid inspelning av syreförbrukning och extracellulära försurning priser i explanterad mus näthinnans vävnader med hjälp av en extracellulär flux analysator.
Abstract
Hög skärpa vision är en mycket energikrävande process och näthinnan har utvecklat flera unika anpassningar för att exakt uppfylla sådana krav bibehållen insyn i den visuella axeln. Störningar till denna ömtåliga jämvikt orsaka förblindande sjukdomar, såsom diabetesretinopati. Förståelsen av energi metabolism förändringar i näthinnan under sjukdom är därför absolut nödvändigt att utvecklingen av rationella terapier för olika skadeorsaker vison. Senaste tillkomsten av kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analysatorer har gjort studien av retinal energiomsättningen mer tillgänglig. Det här protokollet beskriver användningen av sådan en analysator att mäta bidrag till retinal energiförsörjning genom sina två princip vapen – oxidativ fosforylering och glykolys – genom att kvantifiera förändringar i syre förbrukning (OCR) och extracellulära försurning priser (ECAR) som proxyservrar för dessa vägar. Denna teknik utförs lätt i explanterad retinala vävnaden, underlättar bedömning av Svaren till flera farmakologiska agenter i en enstaka experiment. Metaboliska signaturer i näthinnor från djur saknar rod ljusmätare signalering jämförs vildtyps-kontroller med denna metod. En stor begränsning i denna teknik är bristen på förmåga att diskriminera mellan ljus-anpassat och stjärnkartsschema energiutnyttjande, en viktig fysiologisk faktor i retinala vävnaden.
Introduction
Näthinnan är bland de mest energi-krävande vävnaderna i centrala nervsystemet1. Som de flesta vävnader genererar det adenosintrifosfat (ATP) via glykolys i den cytosol eller via oxidativ fosforyleringen i mitokondrier. Energisk fördelen av oxidativ fosforylering över glykolys att producera ATP från en molekyl av glukos är tydlig: 36 molekyler ATP genereras från den tidigare vs. 2 molekyler av ATP som genereras från den senare. Följaktligen, retinala nervceller är främst beroende av mitokondriell respiration för energiförsörjning och detta avspeglas i deras hög täthet av mitokondrier2. Ännu, näthinnan också starkt beroende glycolytic maskiner även när syre är riklig. Denna process av aerob glykolys ursprungligen beskrevs i cancerceller av Otto Warburg3, som en gång konstaterade att näthinnan var endast efter mitotiska vävnaden kan denna form av metabolism4. Sedan de inledande observationerna, har många efter mitotiska vävnader beskrivits för att engagera sig i varierande grad av glykolys förutom oxidativ fosforylering sin ATP-krav.
Phototransduction, visual pigment återvinning, biosyntesen av ljusmätare yttre segment och synaptisk aktivitet är alla energi krävande processer i fotoreceptorer, dominerande neuronala underklassen i näthinnan. Men behovet av att aktivt transportera joner mot deras elektriska och koncentration lutningar är överlägset mest energiskt tidskrävande processen i nervceller1. Fotoreceptorer är säregna nervceller i den meningen att de är Aricebo i avsaknad av stimulans (dvs. i mörkret), medan en ljus stimulans utlöser kanal stängning och efterföljande hyperpolarisering. Därför, i mörkret, näthinnan förbrukar stora mängder ATP att bibehålla dess depolarisation eller ”mörk ström” som det vanligen kallas. Från en adaptiv synvinkel är en stor utmaning i att leverera dessa enorma mängder ATP behovet av organismer att upprätthålla visuell tydlighet genom den optiska axeln. Inverterad retinal arkitekturen sett i moderna varelser är den dominerande lösningen, eftersom det håller tät välutbyggt nät levererar fotoreceptorer från vägen av ljus. Men detta underverk av naturliga bioengineering platser näthinnan vid en avgrund i form av metabolisk reserv. Även små förolämpningar mot näthinnan kan potentiellt störa den känsliga balansen i energiförsörjningen till efterfrågan och visuell dysfunktion eller frank blindhet kan uppstå snabbt.
Ges unika energisk krav av neurala näthinnan, tillsammans med dess snäva begränsningen av kärlen, kan exakt mätning av ATP förbrukningen i näthinnan och dess förändringar under sjukdomen få djupgående konsekvenser i förståelse och behandling av bländande villkor såsom retinitis pigmentosa och diabetesretinopati. Traditionellt har kräver dessa mätningar kostsamma, anpassade utformade utrustning med de flesta studier framväxande från en handfull laboratorier helt tillägnad mätningar av metabolisk aktivitet2,5,6, 7,8. Tekniker inkluderar enskilda analyser för specifika metaboliter, tracer studier med radioaktivt märkt prekursorer, syreförbrukning inspelning med Clark elektroder och metabolomiska profilering9.
Framstegen inom hög genomströmning teknik och ökad tillgänglighet till kommersiella enheter är tekniker till rekord retinal metabolism allt mer tillgängliga och ekonomiskt överkomliga. Den metod som beskrivs här mäter både oxidativ fosforylering och glykolys i näthinnan med explanterad vävnad och ett kommersiellt tillgängliga extracellulära flux analyzer9,10,11,12. Denna analysator registreras separat syre förbrukning (OCR) och den extracellulära försurning skattesats (ECAR), som serverar som indirekta indikatorer på oxidativ fosforylering och glykolys, respektive13. Dessa mätningar görs av en sond dränka inom en microchamber som skapade över vävnaden av intresse. Denna anpassning av tidigare publicerade metoder använder en capture tallrik ursprungligen för bukspottkörtelns Langerhanska öar för att registrera metabolisk aktivitet i små, cirkulära sektioner av mus näthinnan. Flera farmakologiska exponeringar kan levereras till vävnaden under loppet av en enda inspelning eftersom systemet innehåller 4 injektion portar för varje prov väl. Med detta system med separata protokoll optimerad för ECAR och OCR-inspelningar, svaren från vildtyp näthinnor kan jämföras näthinnor saknar transducin (Gnat1– / –), en orsak till medfödd stationära nattblindhet i människor14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR och ECAR mäts lätt i explanterad retinala vävnaden med hjälp av en bioanalyzer med de beskrivna teknikerna. Denna metod avviker från dem i andra grupper i flera kritiska steg. Näthinnans vävnader isoleras genom en stor hornhinnan snitt utan enucleating i världen, som ursprungligen beskrevs av Winkler15. Denna metod av retinal isolering möjliggör en snabb överföring från levande ögat i vävnad fånga plattan (ofta inom 5 minuter). Vävnaderna hålls vid 37 ° C under hela den proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Alexander Kolesnikov och Dr. Vladimir Kefalov för att ge Gnat1– / –möss, för bra feedback och råd och läsa manuskriptet.
Detta arbete fick stöd av NIH EY025269 (RR), Diabetes Research Center vid Washington University – NIH DK020579 (JRM och RR), en karriär Development Award från forskning till förhindra blindhet (RR), Horncrest Foundation (RR), en karriär Development Award från JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) och DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
