Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü
Summary
Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.
Abstract
Yüksek keskinliği vizyon ağır enerji tüketen bir süreç ve retinanın tam şeffaflık görsel eksen koruyarak böyle taleplerini karşılamak için birkaç benzersiz uyarlamaları geliştirmiştir. Bu hassas denge için tedirginlikler diabetik retinopati gibi kör edici hastalıklar neden. Bu nedenle, enerji metabolizması değişiklikleri retina anlayış hastalığı sırasında vison kaybı çeşitli nedenleri için rasyonel tedavilerin geliştirilmesi şarttır. Piyasada bulunan hücre dışı akı Analizörleri son gelişiyle Retina enerji metabolizması çalışmanın daha erişilebilir yaptı. Bu iletişim kuralı katkıları Retina enerji arzına – Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz – iki prensip kolları aracılığıyla yapılan oksijen tüketimi (OCR) miktarının ölçmek için böyle bir çözümleyici kullanımını açıklar ve ekstrasellüler Bu yollar için proxy olarak asitleştirme oranları (D.H.T.). Bu tekniği tek denemede birden çok farmakolojik ajanlara yanıt değerlendirilmesi kolaylaştırılması explanted Retina dokusunda kolayca gerçekleştirilir. Retina çubuk photoreceptor sinyal eksik hayvanlardan metabolik imzalar bu yöntemi kullanarak vahşi-tür denetimlere karşılaştırılır. Bu teknikte önemli bir sınırlama ışık uyarlanmış ve dark-adapted enerji kullanımı, önemli bir fizyolojik göz retina doku arasında ayırımcılık için yetenek eksikliğidir.
Introduction
Retina Merkezi sinir sistemi1en enerji talep dokularda arasındadır. Çoğu dokular gibi bu mitokondri sitozol ya da yolu ile Oksidatif fosforilasyon adenozin trifosfat (ATP) üzerinden glikoliz oluşturur. Glikoliz glikoz bir molekül ATP üretmek için enerjik avantaj Oksidatif fosforilasyon açıktır: 36 molekül ATP üretilen eski vs 2 ikinci gelen üretilen ATP molekülleri. Buna göre Retina nöronlar mitokondrial solunum enerji arzı için öncelikle bağlıdır ve bu mitokondri2onların yüksek yoğunluklu tarafından yansıtılır. Oksijen bol olsa bile henüz, retina da ağır glycolytic makine üzerinde dayanır. Aerobik glikoliz bu sürecin aslında kim bir kez retina sadece sonrası mitotik doku metabolizması4bu tür yetenekli olduğunu kaydetti Otto Warburg3tarafından kanser hücrelerinin içinde tanımlanmıştır. Bu ilk gözlemler beri birçok sonrası mitotik doku glikoliz Oksidatif fosforilasyon ek olarak değişen derecelerde ATP taleplerini karşılamak için girişme tarif edilmistir.
Phototransduction, görsel pigment biyosentezi photoreceptor dış segmentleri ve sinirsel aktivite geri dönüşüm, tüm enerji photoreceptors, baskın nöronal alt sınıfta retina zorlu süreçlerde vardır. Ama karşı onların elektrik iyonları ve konsantrasyon degradeler aktif taşıma gerek en enerjik alıcı bir süreç nöronların1gereğidir. Photoreceptors Kanal kapatma ve sonraki hyperpolarization hafif bir uyarıcı tetikler Oysa onlar (Yani, karanlık), stimülasyon yokluğunda depolarized anlamda kendine özgü nöronlar vardır. Bu nedenle, karanlıkta, retina ATP olarak yaygın olarak adlandırılan depolarizasyon veya “karanlık akımı” korumak için büyük miktarlarda tüketmek. Adaptif değiştiremeyeceğinden, bu büyük miktarda ATP temin büyük bir meydan okuma optik eksen aracılığıyla görsel netlik sağlamak organizmalar için ihtiyaç vardır. Photoreceptors ışık yolunu uzak tedarik yoğun kılcal ağ tutar olarak modern yaratıkları görmüş ters Retina baskın çözüm mimarisidir. Ama bu hayret doğal Biyomühendislik retina metabolik rezerv açısından bir uçurumun yerleştirir. Hatta küçük hakaret retina için potansiyel enerji arz talep hassas dengesini bozabilir ve görsel fonksiyon bozukluğu veya frank körlüğü hızlı bir şekilde doğmak.
Sinirsel retinanın vasküler kaynağı, onun sıkı kısıtlama ile birleştiğinde, benzersiz enerjik talepleri göz önüne alındığında hastalığı sırasında ATP tüketimi retina ve değişiklikleri doğru ölçüm anlamakta ve tedavi derin etkileri olabilir retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi koşulları kör. Geleneksel olarak, bu ölçümler laboratuar tamamen metabolik aktivite2,5,6ölçümleri için adanmış bir avuç çıkan en çalışmaları ile pahalı, özel tasarlanmış ekipman gerektiren, 7,8. Teknikleri belirli metabolitleri, radyo etiketli öncüleri, oksijen tüketimi kayıt Clark elektrotlar ve9profil oluşturma metabolomic kullanarak kullanarak izleme çalışmaları için bireysel testleri içerir.
Gelişmeler ile yüksek-den geçerek teknoloji ve ticari cihazlar, kullanılabilirliğinin artması, giderek erişilebilir ve uygun teknikleri kayıt Retina metabolizma. Burada açıklanan yöntemi hem Oksidatif fosforilasyon ölçer ve glikoliz retina kullanarak doku ve piyasada bulunan hücre dışı akı analyzer9,10,11,12explanted. Bu Çözümleyicisi ayrı olarak oksijen tüketim oranını (OCR) ve Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz, sırasıyla13dolaylı göstergeleri olarak hizmet veren hücre dışı asitleştirme oranı (D.H.T.), kaydeder. Bu ölçümler faiz doku üzerinde oluşturulan bir microchamber içinde örtülü bir sonda tarafından yapılır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri bu uyum pankreas adacıkları of Langerhans için tasarlanan bir yakalama plaka fare retina küçük, dairesel bölümlerde metabolik etkinliklerini kaydetmek için kullanır. Birden fazla farmakolojik poz doku için sistem 4 enjeksiyon portu her örnek için de içerdiği için bir tek kayıt ders sırasında teslim edilebilir. D.H.T. ve OCR kayıtları için en iyi duruma getirilmiş ayrı protokol ile bu sistemi kullanarak, vahşi tipi Retina yanıt (Gnat1– / –), transducin eksik Retina karşılaştırılabilir bir nedeni konjenital sabit gece körlüğü insanlar14.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCR ve D.H.T. kolayca açıklanan teknikleri kullanarak bir bioanalyzer kullanarak explanted Retina dokularında ölçülür. Bu, diğer grupların birkaç kritik adımda bu yöntem başlamaktadır. Retina dokularının orijinali Winkler15tarafından açıklanan dünya, enucleating olmadan büyük bir korneal kesi izole edilmiştir. Bu yöntemi Retina tecrit (genellikle 5 dakika içinde) doku yakalama plaka içine hızlı bir transfer yaşam göz olanak sağlar. Doku hücresel solunum ne zaman buz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Alexander Kolesnikov ve Dr Vladimir Kefalov Gnat1– / –verdiğiniz için teşekkür ederizfareler, yararlı geribildirim ve öneriler için ve makale okumak için.
Bu eser tarafından NIH EY025269 (RR), diyabet araştırma merkezi Washington Üniversitesi – NIH DK020579 desteklenmiştir (JRM ve RR), araştırma önlemek körlüğü (RR), Horncrest Vakfı (RR), JDRF () bir kariyer geliştirme Ödülü için bir kariyer geliştirme Ödülü JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) ve DK114233 (JRM).
Materials
| Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer | Agilent, Santa Clara, CA | ||
| Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution) | Agilent, Santa Clara, CA | 101174-100 | Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution |
| RPMI 1640 Media (Powdered medium) | Millipore-Sigma | R1383 | RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate |
| D-Glucose | Millipore-Sigma | G8270 | 1M D-Glucose filtered, for media preparation |
| Sodium pyruvate | Corning | 25000CI | 100 mM sodium pyruvate |
| Antimycin-A | Millipore-Sigma | A8674 | Mitochondrial stress protocol component |
| FCCP | Millipore-Sigma | C2920 | Mitochondrial stress protocol component |
| Rotenone | Millipore-Sigma | R8875 | Mitochondrial stress protocol component |
| 2-deoxyglucose | Millipore-Sigma | D6134 | Glycolysis protocol component |
| 1 mm skin biopsy punches with plunger | Integra-Miltex | 33-31AA-P/25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Mini-Forceps Straight | Fine Science Tools | 11200-10 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees | Fine Science Tools | 11253-25 | Explanting retinal tissue tool |
| Dumont #7 Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11271-30 | Explanting retinal tissue tool |
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit | Fisher Scientific | P7589 | Loading normalization assay |
| Trizma base (Tris base) | Millipore-Sigma | T6066 | Component of lysis buffer |
| Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether) | Millipore-Sigma | X100 | Component of lysis buffer |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9262 | Component of lysis buffer |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | Strain 000664 | Animals |
| Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+ | Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine | Animals | |
References
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863 (2017).
- Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
- Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622 (2017).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113 (2017).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
- Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).
