Summary

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Abstract

A pesar del aumento de la esperanza de vida de los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de su morbilidad. La inmunopatología hepática causada por el VIH-1 sigue siendo esquiva. Los modelos animales de xenoinjerto pequeños con hepatocitos humanos y el sistema inmunitario humano pueden recapitular la biología humana de la patogénesis de la enfermedad. En este documento, se describe un protocolo para establecer un modelo de ratón humanizado dual a través de hepatocitos humanos y CD34+ trasplante de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC), para estudiar la inmunopatología hepática observada en pacientes infectados por el VIH. Para lograr la reconstitución dual, el TK-NOG masculino (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) ratones se inyectan intraperitonealmente con dosis de ganciclovir (GCV) para eliminar las células hepáticas transgénicas del ratón, y con treosulfán para el acondicionamiento no mieloablativo, los cuales facilitar el injerto de hepatocitos humanos (HEP) y el desarrollo del sistema inmunológico humano (HIS). Los niveles de albúmina humana (ALB) se evalúan para el injerto hepático, y la presencia de células inmunitarias humanas en la sangre detectadas por citometría de flujo confirma el establecimiento del sistema inmunitario humano. El modelo desarrollado utilizando el protocolo descrito aquí se asemeja a múltiples componentes de daño hepático por infección por VIH-1. Su establecimiento podría resultar esencial para los estudios de la coinfección por el virus de la hepatitis y para la evaluación de medicamentos antivirales y antirretrovirales.

Introduction

Desde el advenimiento de la terapia antirretroviral, se ha producido una disminución sustancial de las muertes relacionadas con la monoinfección del VIH-1. Sin embargo, la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de morbilidad en pacientes infectados por el VIH1,2. Las coinfecciones de virus de la hepatitis con infección por VIH-1 son más frecuentes, y representan entre el 10% y el 30% de las personas infectadas por el VIH en los Estados Unidos3,4,5.

La especificidad del huésped de los virus del VIH-1 y la hepatitis limita la utilidad de los modelos de animales pequeños para estudiar enfermedades infecciosas específicas del ser humano o para investigar múltiples aspectos de la patogénesis hepática asociada al VIH-1. Los ratones inmunodeficientes que permiten el injerto de células y/o tejidos humanos (llamados modelos de ratón humanizados) son modelos animales aceptables para estudios preclínicos6,7,8. Desde la introducción de ratones humanizados a principios de la década de 2000, múltiples estudios preclínicos de toxicidad hepática humana colestásica, patógenos específicos del ser humano, incluidos el VIH-1 y trastornos neurocognitivos asociados al VIH, el virus de Epstein Barr, hepatitis y otros enfermedades infecciosas, se han investigado en estos ratones6,9,10,11. Múltiples modelos de ratón para CD34+ HSCCP y/o trasplante de hepatocitos humanos han sido desarrollados durante mucho tiempo y han mejorado con el tiempo para estudiar la enfermedad patogénesis del virus de la hepatitis B (VHB) enfermedad hepática asociada12, 13 , 14. Varios modelos para el trasplante de HSPC y hepatocitos humanos (HEP) se basan en cepas, conocidas como NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- c-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, y fah-/- NOD rag1-/- il2r-null ratón16. Sin embargo, cada modelo tiene sus propias ventajas y limitaciones; por ejemplo, el fondo atravesado de dos ratones humanizados AFC8 para HEPs y células madre humanas (HSC) en un fondo Balb/C-Rag2-/- -/- permite el injerto exitoso de células inmunitarias y HSC, pero existe la ausencia de un fondo de células T y B específicos para antígenos respuesta en este modelo12. Las principales preocupaciones en la reconstitución de ratones humanizados dobles incluyen el injerto subóptimo, la falta de modelos adecuados para apoyar diferentes tejidos, condiciones no coincidentes, rechazo inmune, o enfermedad de injertofrentea huésped (GVHD), y técnicos dificultades, como manipulaciones de riesgo con recién nacidos y altas tasas de mortalidad debido a anomalías metabólicas13.

Aunque ratones humanizados se han utilizado para la investigación del VIH durante muchos años17,18,19, el uso de ratones humanizados para estudiar el daño hepático causado por el VIH-1 ha sido limitado20. Hemos informado previamente del establecimiento de un modelo de ratón TK-NOG humanizado dual y su aplicación en la enfermedad hepática asociada al VIH8. Este modelo muestra el injerto robusto de hígado y células inmunitarias y recapitula la patogénesis por infección por VIH. Esta discusión presenta un protocolo detallado, incluyendo los pasos más críticos en el trasplante de hepatocitos humanos. También se presenta una descripción de los HSCCP necesarios para un injerto exitoso de HEPs y el establecimiento de un sistema inmunitario funcional en ratones TK-NOG. Se detalla el uso de estos ratones para estudiar la inmunogénesis hepática asociada al VIH. Se utilizan ratones macho TK-NOG que llevan un transgén transgén transgén de virus del herpes simple tipo 1 específico del hígado. Las células hepáticas de ratón que expresan este transgén pueden ser fácilmente abladas después de una breve exposición a una dosis no tóxica de GCV. Las células hepáticas humanas trasplantadas se mantienen establemente dentro del hígado del ratón sin fármacos exógenos21. Los ratones también están preacondicionados con dosis no mieloablativas de treosulfano para crear un nicho en la médula ósea del ratón para las células humanas8. Los ratones inmunodeficientes TK-NOG se inyectan por vía intrasíptica con HEPs y HSPC multipotentes. A continuación, los ratones son monitoreados regularmente para la reconstitución de sangre y hígado mediante inmunofenotipado en sangre y mediciones de los niveles séricos de albúmina humana, respectivamente. Los ratones con una reconstitución exitosa de más del 15% tanto para las células inmunitarias humanas como para los HEP se inyectan por vía intraperitoneal con VIH-1. El efecto del VIH en el hígado se puede evaluar tan pronto como 4 – 5 semanas después de la infección. Es fundamental tener en cuenta que, debido a que se utiliza el VIH-1, se deben tomar todas las precauciones necesarias mientras se maneja el virus y se inyecta en ratones.

Protocol

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska. NOTA: Obtener la aprobación de la IACUC local antes de realizar experimentos con animales. 1. Procesamiento de la sangre del cordón umbilical y el aislamiento de los HSpC shumanos Realice todos los pasos del protocolo en condiciones estériles en armarios de flujo laminar. Tomar l…

Representative Results

El establecimiento de un modelo de ratón humanizado dual con hígado humano y células inmunitarias se puede monitorear fácilmente en cada paso con ELISA y citometría de flujo muy simple, respectivamente. La citometría de flujo se realiza regularmente para evaluar el desarrollo de un sistema inmunitario funcional y para ver el efecto de la infección por VIH en las células inmunitarias. En ratones humanizados duales, el desarrollo de células inmunitarias funcionales puede variar del…

Discussion

El hígado está comprometido y dañado en pacientes infectados por el VIH24. Los modelos experimentales de animales pequeños para el estudio de las enfermedades hepáticas humanas en presencia del VIH-1 son extremadamente limitados, a pesar de la disponibilidad de algunos modelos animales cotrasplantes con CD34+ HSPC y hepatocitos7,12, 25. En experimentos in vitro, se ha demostrado que los h…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la beca R24OD018546 del Instituto Nacional de Salud (a L.Y.P. y S.G.). Los autores quieren agradecer a Weizhe Li, Ph.D., por la ayuda en procedimientos quirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para inmunohistología, miembros del centro de investigación de citometría de flujo de la UNMC Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., y Samantha Wall, B.S., miembros avanzados de las instalaciones centrales de microscopía Janice A. Taylor, B.S., y James R. Talaska, B.S., para el apoyo técnico. Los autores reconocen a los Doctores Mamoru Ito y Hiroshi Suemizu de CIEA por proporcionar ratones TK-NOG y al Dr. Joachim Baumgart por proporcionar treosulfán. Los autores agradecen al Dr. Adrian Koesters, de la UNMC, su contribución editorial al manuscrito.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

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Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

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