Summary

Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH

Published: September 11, 2019
doi:

Summary

Ce protocole fournit une méthode fiable pour établir des souris humanisées avec le système immunitaire humain et les cellules hépatiques. Les souris immunodéficientes doublement reconstituées réalisées par injection intrasplégique d’hépatocytes humains et de CD34 cellules souches hématopoïétiques sont sensibles à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine-1 et récapitulent les lésions hépatiques observées dans patients infectés par le VIH.

Abstract

Malgré l’espérance de vie accrue des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1), l’affection hépatique est devenue une cause fréquente de leur morbidité. L’immunopathologie hépatique causée par le VIH-1 reste insaisissable. Les petits modèles animaux de xénogreffe avec des hépatocytes humains et le système immunitaire humain peuvent récapituler la biologie humaine de la pathogénie de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour établir un modèle de souris humanisée double par des hépatocytes humains et CD34 cellules hématopoïétiques de tige/progénitrice (HSPc) transplantation, pour étudier la pathologie immuno-hépatique telle qu’observée dans les patients HIV-infectés. Pour parvenir à une double reconstitution, hommes TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) souris sont injectées par voie intrapéritone avec des doses de ganciclovir (GCV) pour éliminer les cellules transgéniques du foie de la souris, et avec treosulfan pour le conditionnement nonmyeloablatif, qui faciliter l’engraftment de l’hépatocyte humain (HEP) et le développement du système immunitaire humain (HIS). Les niveaux humains d’albumine (ALB) sont évalués pour l’engraftment de foie, et la présence des cellules immunitaires humaines dans le sang détecté par cytométrie de flux confirme l’établissement du système immunitaire humain. Le modèle développé à l’aide du protocole décrit ici ressemble à de multiples composants des dommages au foie causés par l’infection par le VIH-1. Sa mise en place pourrait s’avérer essentielle pour l’étude de la co-infection par le virus de l’hépatite et pour l’évaluation des médicaments antiviraux et antirétroviraux.

Introduction

Depuis l’avènement du traitement antirétroviral, il y a eu une diminution substantielle des décès liés à la monoinfection par le VIH-1. Cependant, l’affection hépatique est apparue comme une cause fréquente de morbidité chez les patients infectés par le VIH1,2. Les coinfections des virus de l’hépatite par infection par le VIH-1 sont plus fréquentes, représentant 10 % à 30 % des personnes infectées par le VIH aux États-Unis3,4,5.

La spécificité de l’hôte des virus du VIH-1 et de l’hépatite limite l’utilité des modèles de petits animaux pour étudier des maladies infectieuses spécifiques à l’homme ou pour étudier de multiples aspects de la pathogénie hépatique associée au VIH-1. Les souris immunodéficientes qui permettent l’engraftment des cellules et/ou des tissus humains (appelés modèles humanisés de souris) sont des modèles animaux acceptables pour des études précliniques6,7,8. Depuis l’introduction de souris humanisées au début des années 2000, de multiples études précliniques sur la toxicité du foie humain cholestatique, les agents pathogènes spécifiques à l’homme, y compris le VIH-1 et les troubles neurocognitifs associés au VIH, le virus Epstein Barr, l’hépatite et d’autres maladies infectieuses, ont été étudiés chez ces souris6,9,10,11. Plusieurs modèles de souris pour les CD34et les HSPC et/ou la transplantation d’hépatocytes humains ont été développés depuis longtemps et se sont améliorés au fil du temps pour étudier la pathogénie de la maladie de l’hépatite B (HBV)-associée à la maladie du foie12, 13 (en) , 14. Plusieurs modèles de transplantation de HSPC et d’hépatocytehumain humain (HEP) sont basés sur des souches, connues sous le nom de NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/– (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, et fah-/- NOD rag1-/- souris il2r-null16. Cependant, chaque modèle a ses propres avantages et limites; par exemple, les souris aFR8 doublement humanisées pour les PHE et les cellules souches humaines (HSC) sur un fond Balb/C-Rag2-/-C-/- permet l’engraftment réussi des cellules immunitaires et des HSC, mais il y a une absence d’un T- et d’un B-cellule réponse dans ce modèle12. Les principales préoccupations dans la reconstitution de souris double humanisées comprennent l’engraftment sous-optimal, l’absence de modèles appropriés pour soutenir différents tissus, des conditions dépareillées, le rejet immunitaire, ou la maladie degreffe-contre-hôte(GVHD), et technique difficultés, telles que les manipulations risquées avec les nouveau-nés et les taux de mortalité élevés dus à des anomalies métaboliques13.

Bien que les souris humanisées aient été utilisées pour la recherche sur le VIH depuis de nombreuses années17,18,19, l’utilisation de souris humanisées pour étudier les dommages au foie causés par le VIH-1 a été limitée20. Nous avons précédemment rapporté l’établissement d’un modèle de souris TK-NOG doublement humanisé et son application dans la maladie hépatique associée au VIH8. Ce modèle montre l’engraftment robuste des cellules hépatiques et immunitaires et récapitule la pathogénie d’infection par le VIH. Cette discussion présente un protocole détaillé, y compris les étapes les plus critiques dans la transplantation des hépatocytes humains. Une description des HSPC exigées pour une engraftment réussie des HEPs et l’établissement d’un système immunitaire fonctionnel dans les souris de TK-NOG est également présentée. L’utilisation de ces souris pour étudier l’immunopathogenèse hépatique associée au VIH est détaillée. Des souris mâles TK-NOG porteuses d’un transgène de type 1 de type 1 de type de thymidine kinase (HSV-TK) de type 1 de la kinase (HSV-TK) de type. Les cellules hépatiques de souris exprimant ce transgène peuvent facilement être alendues après une brève exposition à une dose non toxique de GCV. Les cellules du foie humain transplantées sont maintenues de façon stable dans le foie de souris sans médicaments exogènes21. Les souris sont également préconditionnées avec des doses non myélobolatives de treosulfan pour créer une niche dans la moelle osseuse de la souris pour les cellules humaines8. Les souris immunodéficientes de TK-NOG sont intrasplenically injectées avec des HEPs et des HSPC multipotents. Les souris sont alors régulièrement surveillées pour la reconstitution de sang et de foie par l’immunophénotypage de sang et les mesures des niveaux humains-albumins de sérum, respectivement. Les souris dont la reconstitution réussie est de plus de 15 % pour les cellules immunitaires humaines et les PHE sont injectées par voie intrapéritone avec le VIH-1. L’effet du VIH sur le foie peut être évalué dès 4 à 5 semaines après l’infection. Il est essentiel de noter que, parce que le VIH-1 est utilisé, toutes les précautions nécessaires doivent être prises lors de la manipulation du virus et de l’injecter chez la souris.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre médical de l’Université du Nebraska. REMARQUE: Obtenir l’approbation de l’IACUC local avant d’effectuer des expériences sur des animaux. 1. Traitement du sang de cordon ombilical et isolement des HSPC humains Effectuer toutes les étapes du protocole dans des conditions stériles dans des armoires à débit laminaire. Prenez le s…

Representative Results

L’établissement d’un modèle de souris doublement humanisé avec le foie humain et les cellules immunitaires peut être facilement surveillé à chaque étape avec eLISA très simple et cytométrie de flux, respectivement. La cytométrie des flux est régulièrement pratiquée pour évaluer le développement d’un système immunitaire fonctionnel et pour voir l’effet de l’infection par le VIH sur les cellules immunitaires. Chez les souris doublement humanisées, le développement de cellu…

Discussion

Le foie est compromis et endommagé chez les patients infectés par le VIH24. Les modèles expérimentaux de petits animaux pour étudier les maladies du foie humain en présence du VIH-1 sont extrêmement limités, malgré la disponibilité de quelques modèles animaux cotransplantés avec CD34et HSPc et hépatocytes7,12, 25. Dans les expériences in vitro, il est démontré que les hépatocy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention r24OD018546 de l’Institut national de la santé (à L.Y.P. et S.G.). Les auteurs tenons à remercier Weizhe Li, Ph.D., pour l’aide dans les procédures chirurgicales, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng pour l’immunohistologie, les membres de l’installation de recherche sur la cytométrie des flux de flux de l’UNMC Directeur Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., et Samantha Wall(S.-B.), membres avancés de l’installation de microscopie de l’UNMC, Janice A. Taylor, B.S., et James R. Talaska, B.S., pour le soutien technique. Les auteurs reconnaissent les Drs Mamoru Ito et Hiroshi Suemizu de la CIEA pour avoir fourni des souris TK-NOG et le Dr Joachim Baumgart pour avoir fourni des treosulfan. Les auteurs remercient le Dr Adrian Koesters, UNMC, pour sa contribution éditoriale au manuscrit.

Materials

27G1/2" needles BD biosciences 305109
30G1/2" needles BD biosciences 305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 x 75 mm style Corning 352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle BD biosciences 309659
BD FACS array bioanalyzer  BD Biosciences For purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array software BD Biosciences Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solution BD Biosciences 349202 To lyse red blood cells
BD LSR II BD Biosciences Instrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube BD biosciences BD 367874 To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin  Sigma-aldrich A9576
Buprenorphine Controlled substance and pain-killer
CD14-PE BD Biosciences 555398 Specific to human
CD19-BV605 BD Biosciences 562653 Specific to human
CD34 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-046-702 For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, human Miltenyi Biotec 130-081-002 Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700 BD Biosciences 557943 Specific to human
CD45-PerCPCy5.5 BD Biosciences 564105 Specific to human
CD4-APC BD Biosciences 555349 Specific to human
CD8-BV421 BD Biosciences 562428 Specific to human
Cell counting slides Bio-rad 1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit Thermofisher scientific CS11204 for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5  Roche Molecular Diagnostics bioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators   McKesson 24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18) DAKO M7010 Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-aldrich D2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile BD biosciences 30914 Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6 BD Biosciences flow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10438026
FLOWJO analysis software
v10.2
FLOWJO, LLC flow cytometry analysis software
Ganciclovir APP Pharmaceuticals, Inc. 315110 Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA Tubes Greiner bio-one 450475
Hepatocytes thawing medium  Triangle Research Labs  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip Appliers Teleflex 537061 To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for Injection ACE surgical supply co. Inc. 001-1187 For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation Set Bethyl laboratories E80-129 For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyte Triangle Research Labs  HUCP1  Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, Straight Ted Pella, Inc. 13295
Lancet MEDIpoint Goldenrod 5 mm
LS columns  Miltenyi Biotec 130-042-401 Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM) MP Biomedicals 50494 For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument Co. RS-5605 Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting Forceps Roboz Surgical Instrument Co. RS-5157  to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITC BD Biosciences 553080 mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline) Hyclone SH30256.02
Qudro MACS separator  Miltenyi Biotec 130-090-976 holds four LS columns
RPMI 1640 medium Gibco 11875093
StepOne Plus Real Time PCR  Applied Biosystems Instrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml DYMAX CORP T15469 Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale suture Henry Schein Animal Health 41178 Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermofisher scientific 4369016
TC20 automated cell counter Bio-rad 1450102
TK-NOG mice  Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
Treosulfan Medac GmbH Provided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan Blue Bio-rad 1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L Ted Pella, Inc. 1346 Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clips Esutures 523700 To ligate the spleen post-injection

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Cite This Article
Dagur, R. S., Wang, W., Makarov, E., Sun, Y., Poluektova, L. Y. Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis. J. Vis. Exp. (151), e58645, doi:10.3791/58645 (2019).

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