Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

doi: 10.3791/58654 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Belirli fare doku işleme için fare histopatolojik analiz insan numuneler ile karşılaştırıldığında kalitesini azaltır. Burada, robot sistemleri işleme ve insan örnekleri katıştırma için rutin olarak kullanılan fizibilite göstermek için fare iltihaplı ve uninflamed kolon dokularında histopatolojik incelenmesi gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

İnsan hastalıkları anlayış hayvan modelleri çalışma sayesinde büyük ölçüde genişletti. Yine de, deneysel modeller histopatolojik değerlendirilmesi olarak insan örnekler için uygulanan sıkı olması gerekiyor. Nitekim, güvenilir ve doğru kararınızı eleştirel doku bölümü hazırlık kalitesi ile etkilenir. Burada, biz yordam, parafin gömmenin fare örnekleri ilk hazırlanması sırasında birkaç otomatik adımları uygular histopatolojik analiz fare dokuların bir protokol tanımlamak. Metodolojik değişkenler üzerinden titiz Protokolü standardizasyon otomatik yordamlar gelen azalma artan genel güvenilirliğini fare patolojik analiz için katkıda bulunur. Özellikle, bu iletişim kuralını otomatik işleme kullanımını açıklar ve robot sistemleri, gömme rutin olarak doku işleme ve parafin insan örnekleri katıştırma için fare bağırsak iltihabı örnekleri işlemek için kullanılan. Biz standart ve otomatik teknikleri getirilmesi fare dokuların histopatolojik muayene güvenilirliğini önemli ölçüde arttığını sonucuna.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Son yıllarda, insan hastalıkları1,2için önde gelen patojenik mekanizmaları incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bir hastalığın şiddetini değerlendirmek için araştırmacılar bir tedavinin etkisini değerlendirmek ve çalışma saytolojik ve histolojik mimari farklılıklar veya iltihap3miktarı. Bu modeller üzerinde gerçekleştirmek için detaylı histopatolojik analizler, fare ve insan örnekleri4,5kez karşılaştırma ihtiyaç vardır.

Ayrıca, insan örnekleri yaygın olarak işlenir ve histopatoloji çekirdek özellikleri tarafından attı ve histopatolojik kriterleri ve yöntemleri ile deneyimli insan patologlar standart. Bunun tersi olarak, fare dokular genellikle sabit, gömülü ve histopatolojik iletişim kurallarının sınırlı deneyimi olan araştırmacılar tarafından incelendi. Histopatolojik inceleme güvenilirliğini ve kalitesini yüksek kaliteli doku bölümleri hazırlanması ile başlar. Çeşitli faktörler eleştirel artmak ya da azalmak fiksasyon, makroskopik dahil olmak üzere son tahlilde kalitesini kesit, işleme, alkol gömme ve örnekleri6,7/ katıştırma için katkıda bulunur.

Manipülasyon örneği içeren bu pasajlar el ile hataları el ile gömme örnekleri de dahil olmak üzere ve daha az bir ölçüde, kesit ve boyama el ile microtome tabi tutulmaktadır. Şu anda, tüm fare doku hazırlık histolojik değerlendirme için Laboratuvar Laboratuvar farklı protokolleri ve el ile iletişim kuralları üzerinde dayanır. Bu çalışmanın amacı hatalar ve fare histopatolojik Muayene değişkenliği azaltmak için standart otomatik iletişim kuralları uygulamaktır.

Bilgimizi, burada ilk iletişim kuralları işleme ve fare dokuların histolojik değerlendirme için gömme tam otomatik dokusu için tanımlamak; Bunlar düzenli olarak insan numune analizleri için patoloji birimlerinde kullanılır. Yöntem fizibilite pratik bir örnek olarak, bağırsak iltihabı fare modeli, yani analiz edilmiştir, kronik kolit modeli tarafından neden yinelenen yönetim dextran sodyum sülfat (DSS) içme suyu8 ,9. DSS-tedavi hayvanlar Örneğin, kilo kaybı, gevşek dışkı veya ishal ve kolon gibi fibrozis kısalma bağırsak iltihabı belirtileri sergileyen bu yana bu deneysel ayarı yakından benzer insan iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD)10 8,9,11. İnsan IBD hastalar için gözlemlediği gibi DSS tedavi karmaşık hastalık sahası oluşturur. Bu bağlamda, ayrıntılı histolojik değerlendirme doku mimari derin İLETİMLERİNİZE anlamak için gereklidir. Bu nedenle, örnek hazırlık kalitesini artırmak için açıklanan protokoller uygulanması histolojik yorumlanması güvenerek araştırmacılar yararlanabilir ve immunohistokimyasal için fare deneysel ayarları inceliyor. İnsan hastalıkları doku mimari değişiklikler içeren fare deneysel modelleri, hücresel doku sızmak ya da farklı doku ve organların (bağırsak, beyin, karaciğer, cilt) iltihabı varlığı artan kalitesini kullanabilirsiniz histopatolojik inceleme için örnek hazırlanması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvan yordamlar İtalyanca (auth 127/15, 27/13) Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi ve onkoloji IACUC (kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi) Avrupa Enstitüsü ve hayvan bakımı kuralları takip

1. kronik kolit indüksiyon tekrarlayan DSS yönetim tarafından

  1. Ayrı yaş ve cinsiyet 2 grup (kontrol H2O vs tedavi DSS, deney grubu başına en az 5 fareler littermates) farelerde eşleştirdi.
  2. % 2.5 yönetmek DSS (40 kDa) 7 gün tedavi grubuna ve kontrol grubuna su içme suyu.
    Not: Bu model bir kronik transmural bağırsak iltihabı9neden olmaktadır.
  3. 7 gün sonra DSS tedaviyi durdurunca ve 14 gün boyunca her iki grup için su verin. Bu işlem 3 kez tekrarlayın.
    Not: DSS tekrarlayan yönetim yakından insan IBD, yani, fibrozis9benzeyen bağırsak mukoza değişikliklere neden olmaktadır.
  4. Fareler tarafından kurumsal IACUC, yani yetkili yordamlara, göre CO2 inhalasyon tarafından kurban.
  5. Fare karın ve karın zarını neşterle açmak.
    Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
  6. İki nokta üst üste ince bağırsak forseps ve cımbız ile ayırın. İki nokta üst üste cımbız ve forseps ile tüketim.
    Not: İki nokta üst üste uzunluk ölçüm (Şekil 1A) kolit DSS tedavi edilen farelerde meydana Eğer belirlemek için bir yöntemdir.
  7. Bir petri soğuk 1 fosfat tampon serum (PBS) x 10 mL ile iki nokta üst üste durulama ve fekal malzeme çıkarmak için hafifçe bastırın.

2. fare doku fiksasyon

  1. 10 ml % 10 fare her iki nokta üst üste numune bırakın tarafsız arabelleğe alınmış Formalin (NBF) RT (Oda sıcaklığında).
    Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
  2. 18-24 h için doku RT. düzeltmek

3. kolon kesit ve doku hazırlık

  1. Sabit dokular NBF kapsayıcıdan küçük cımbızla çıkarın ve bir kabında koydu. İki nokta üst üste ile küçük cımbız bir parça iş tabağa koy.
  2. İki nokta üst üste parçaları (0,3 cm uzunlukları 0.2 cm) steril neşter ile kesti. Bu parça uzunluğu kaset kalınlığını aşmayacak şekilde sırayla en iyi yöntemdir.
  3. Bir iki nokta üstüste segmenti kadar küçük cımbızla (Şekil 2A) seç. Bir iki nokta üstüste kesimi küçük cımbızla (Şekil 2B) kaset katıştırma odaklı parafin ipuçları çıkıntılı plastik birini takın.
  4. Kaset başına bir ek 3 iki nokta üstüste parçalarla (3.2-3.3) işlemini yineleyin. Segmentleri dokuları örtüşen en aza indirmek için bitişik çıkıntılı ipuçları ekleme kaçının
  5. Sıkıca kaset dikkatle dört kenarları (Şekil 2C) iterek kapatın. Doku hasarı önlemek için doku sıkma kaçının.
  6. Izgarayı plastik bir destek çerçeve içine yerleştirin. Örnek tanımlamak için destekleyici çerçeve etiket. Her biyolojik örnek için yineleyin.

4. doku işleme

  1. Otomatik işlemcilerde (Şekil 3A, 3B) güç düğmesine basarak kapatın.
  2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen özel simge (Şekil 3 c) varlığı gözlemleyerek erimiş araç doğrular kadar bekleyin.
  3. Otomatik işlemcisi (şekil 3D) tarafından sağlanan metal sepet içine odaklı kaset (doku örnekleri içeren) her el ile ekleyin. Kasetleri yakın bir diğer sepet doluluk optimize etmek için astar tarafından dikey olarak yerleştirin.
  4. Metal sepet (Şekil 3E) kapatın.
  5. İmbik (Şekil 3F) kapağını açın. İmbik sepeti makinenin içine yerleştirildiği yer. Sepet işlemci (Şekil 3 g) özel gövde içine yerleştirin. İmbik (Şekil 3 H) kapağını kapatın.
  6. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda çalışma Protokolü (Şekil 3I) tanımlamak için kullanın. Çözüm, zamanlama ve Tablo 1' de sağlanan düzenine göre uygulanacak sıcaklık sırasını seçin.
  7. Sepeti (Şekil 3J) özel bilgisayar ikonuna tıklayarak içeren imbik çalıştırılması için iletişim kuralı atayın. Protokolü Başlat düğmesini (Şekil 3 L) yanında tıkırtı üstünde başlamak.
  8. Özel simge varlığı gözlemleyerek ve makine gelen alarm zil sesi işitme tarafından Protokolü ' nün sonu araç onaylar kadar bekleyin.
  9. İmbik kapağını açın. Sepet işlemciden (Şekil 3 M) kaldırın.

5. doku gömme

  1. Otomatik embedder (Şekil 4A) güç düğmesine basarak kapatın.
  2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen aracı dahili termometre tarafından belirtilen parafin banyo sıcaklığı gözlemleyerek erimiş araç onaylar kadar bekleyin.
  3. Elle işlenmiş kaset işlemci sepetten embedder raf aktarın. Her raf en çok 32 kaset içerebilir. (Şekil 4B, 4 C).
  4. (Şekil 4 c, 4 D, 4E) ana embedder kapağı açın.
  5. Araç bilgisayarda robot için sinyal için dokunmatik ekranı kullanın bir raf olmak sistem takılı (Şekil 4F).
  6. Giriş konut kapak (Şekil 4 g) açın. Raf giriş gövde içine yerleştirin. Her embedder aynı anda 4 raflar içerebilir (Şekil 4 H, 4I). (Şekil 4J) giriş konut kapağını kapatın.
  7. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda Tablo 2 göre (Şekil 4 K) gömme işlemi başlatmak için kullanın.
    Not: Her raf 32 kaset katıştırılması için 45 dakika sürer.
  8. Özel simge (Şekil 4 L) varlığı gözlemleyerek Protokolü ' nün sonu araç doğrular kadar bekleyin.
  9. Çıkış raf (Şekil 4 M) kaldırın. Ana embedder kapağını kapatın.
  10. (Yönlendirme ızgaralar içeren) katıştırılmış blokları rafa kaldırın. Katıştırılmış blok depolama mukavva koli içerisinde aktarın.

6. mikrometre kesit

  1. Microtome soğutma plaka üzerinde açın. -8 arasında sıcaklığı ayarlamak ve -10 ° c
  2. 2 L distile su içeren microtome, termostatik su banyosu üzerinde açın. Su banyosu 42-45 ° c arasında sıcaklık ayarlayın
  3. Yer parafin blok soğutma plaka üzerinde gömülü. Blok soğutmak izin vermek için en az 5 dakika bekleyin.
  4. Soğutma plaka bir blok alın ve microtome blok yuvasına yerleştirin.
  5. 10 µm kalınlık 6 kere keserek ila 10 µm. Trim blok kesme microtome ayarlayın.
  6. Microtome kalınlık ayarı 10 µm Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için 3 µm. kesim bir 3 µm bölümüne değiştirin.
  7. Küçük bir fırça 3 µm bölümle toplamak. 3 µm bölümüne su banyosunda dikkatle doku kırışıklıkları azaltmak için su yüzeyine döşeme koymak. Doku bölümü termostatik kontrollü su banyosundan bir tek cam slayt üzerinde toplamak.
    1. Gerekirse, ek bölümler kesti.
  8. Cam slayt örnek kimliği yazılı olarak etiketleyin.
  9. En az 10 dk. 37 ° C fırında slaytları koymak.
  10. Cam slaytlar raflar hemen analizleri veya saklama kutuları içine koymak.

7. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

  1. Otomatik stainer güç düğmesine basarak geçin. Robotik kol Başlatma araç monitör yükleme çubuğu değişikliği gözlemleyerek izin.
  2. Cam slayt dikey olarak 30 slaytlar ekleme stainer raf yerleştirin.
  3. Raf ile uygun radyo frekansı tanımlama (RFID) plastik etiket etiket. RFID etiketleme stainer bilgisayara yüklenen doğru boyama Protokolü tanımlayan bir sistemdir.
  4. Raf stainer yerleştirin. Bilgisayar otomatik olarak yüklemek ve RFID etiket tanıma göre boyama Protokolü başlatmak izin veriyor.
    Not: H & E boyama için protokol açıklanan Tablo 3.

8. immunohistokimyasal boyama

  1. İmmunohistokimyasal ve Mallory yukarıda açıklanan7olarak boyama trichrome gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İçme suyundaki DSS yinelenen yönetim tarafından indüklenen deneysel kronik kolit bağırsak iltihabı yakından benzeyen insan IBD8,9fare bir modeldir. Şekil 1 kısalma iki nokta üst üste (Şekil 1A), DSS kaynaklı inflamasyon varlığı ve pro-inflamatuar genlerin CXCL10 dahil olmak üzere kolon ifade puanı için yaygın olarak kullanılan parametre de dahil olmak üzere DSS tedavisinin etkileri açıklar , tnf ve mcp-1 (Şekil 1B). İnflamatuar hücre infiltrasyonu büyük ölçüde DSS tedavi, işe alım bağışıklık yanıtının gösteren bağırsak lamina propria içinde cytofluorimetry (Şekil 1 c) tarafından analiz gibi tarafından geliştirilmiş oldu.

Şekil 2 gösteriyor nasıl kolon dokularında kesitli ve odaklı kaset eklenmiş. Bu kasetler bir kılavuz doku ekleme dikey olarak ve uygun yönlendirmeyi ile yani izin haddelenmiş ipuçları ile, iç kısım ve duvar Lümen ile harici içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 2A, 2B, 2 C ). Kasetleri kapandıktan sonra doku yönlendirme ne geleneksel histolojik kaset (Şekil 2B) ile olur aksine ızgaralar tarafından korunur.

Doku işleme otomatik bir işlemci (Şekil 3A-3 M ve Tablo 1), gömme sırasında gerçekleştirilir müdahalede bir otomatik embedder ile (Şekil 4A-4 M ve Tablo 2). İkinci alet bir robot kasetleri toplar ve parafin doğru miktarda dağıtır. Son olarak, bir microtome kullanarak, bölümler parafin blokların kesilir. Slaytları sonra daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlanır.

Şekil 5 otomatik H & E (Şekil 5A-5E ve Tablo 3) boyama ana pasajlar açıklar ve nasıl slaytları H & E (Şekil 5F) boyama sonra görünür. Şekil 6 ve 7 nasıl otomatik işleme ve Gömme iletişim kurallarının uygulanması önemle fare kolon örneklerin histopatolojik analizleri kalitesini artırmak göster. Tedavi edilmemiş fareler (Şekil 6A) türetilmiş otomatik protokolleri ile hazırlanan örnekleri H & E stainings bu tedavi DSS fareler (Şekil 6B) karşılaştırıldı. Histopatolojik puanları değişik parametrelerle bağırsak mukoza inflamatuar dahil olmak üzere hücreleri infiltrasyon, epitelyal değişiklikler ve değişikliklerin açıklandığı gibi mukozal mimarisinin meydana gelen değişiklikler değerlendirerek değerlendirildi Tablo 4. Şekil 6C bir temsilcisi H & E bir kolon doku el işleme ve geleneksel kaset dahil boyama gösteriyor. Şekil 7' de, fare doku hazırlık ve otomatik aletler gerçekleştirilen katıştırma kalitesini Ayrıca IHC tarafından doğrulandı CD20 ve Mallory trichrome boyama8,9 kolon içinde boyama tedavi edilmemiş (Şekil 7A, 7 C) ve DSS tedavi (Şekil 7B, 7 D) fareler.

Şekil 8 bu yöntemin pratik alaka açıklar. Aynı iki nokta üst üste örnekleri işleme ve el ile veya otomatik yöntemlerle gömülü. Her örnek (her iki denetim veya DSS tedavi) 2 eşit parçaya kesin ve manuel veya otomatik yöntemleri ile paralel olarak işlenir. H & E boyama sonra gerçekleştirilen ve tam bir microscopical değerlendirme hitaben bütün patolojik parametreler ile ilgili değişiklikler mukozal mimarisi, taneciklik, bağışıklık hücre sızmak, mukozal kalınlığı, salgı rarefaction normalde yapıldı. bağırsak iltihabı sırasında gözlenen, her örnek, her ikisi belgili tanımlık elle yapılan için için değerlendirildi ve otomatik Protokolü (Şekil 8A ve Tablo 4). Otomatik Protokolü örnekleriyle hazırlanması sürekli olarak yüksek oranda histolojik parametreleri elle yapılan yöntem daha değerlendirilmesi izin. Ayrıca, farklı histolojik parametreleri ayrı bir analizini gerçekleştirildi (Şekil 8B). Mimari ve bazal infiltrat değerlendirme olumlu, özellikle tedavi edilmezse farelerde, otomatik yöntemi ile numune hazırlama tarafından etkilendi.

İşleme ve şu anda insan histopatolojik analiz için kullanılan katıştırma örnek için otomatik yöntemi başarıyla fare numuneler analiz için uygulanabilir. Yüksek kaliteli örnekler mimarisi değerlendirilmesi ve fare kolon dokuların bazal bağışıklık infiltrat el ile yöntemi üzerinde üstünlük gösterir otomatik yöntemi ile oluşturulur.

Figure 1
Şekil 1: kronik bağırsak iltihabı değerlendirme. (A)iki nokta üstüste uzunluk ölçüm. (B) kolon ifade genlerin pro-inflamatuar (cxcl10, tnf, mcp-1) DSS tedavi (Siyah barlar, n = 12) ve tedavi edilmezse fareler (beyaz barlar, n = 6). (C) Immunophenotyping kolon lamina propria ve hücreleri DSS tedavi (kapalı sembolleri, n = 12) ve tedavi edilmezse fareler (açık sembolleri, n = 6). CD11b + Ly6G + nötrofil, CD11b + F4 / 80 + makrofajlar (sol kapı aynası), CD4 + ve CD8 + T hücreleri (doğru kapı aynası) infiltrasyon denetimlerindeki (açık sembolleri, n = 10) ve fareler DSS tedavi (kapalı sembolleri, n = 10). İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon eşleşen çiftleri ile imzalanan rütbe t testi hesaplanır. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. SEM bildirilen değer ± demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: numune hazırlama açıklaması. (A)bir dış kaset (beyaz) tarafından oluşan doku hazırlık ve resim odaklı kaset için aletleri gerekli ve iç kılavuzla kalıptan çekilmiş Yönlendirme ipuçları. (B, C) Fare iç ızgaralar kaset (B) önce iki nokta üst üste yerleştirilmesi ve Kılavuzlar (C) kapatılması sonra. Masası'nda B tasvir edilir (solda) odaklı kaset veya geleneksel kaset (sağda). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: otomatik işlem açıklaması. (A, B) işlemci otomatik. (C) simgesi erime sıcaklığı doğru parafin açıklayan. (D, E) Metal sepet (D) ve (E) kapatılması kasete ekleme. (F, G, H) İmbik metal sepete ekleme. (I, J, K) İşlem protokolü seçimi. Protokolü'nün (L) çalışan. İmbik sepet formunun (M) kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: otomatik katıştırma açıklama . Otomatik embedder(a)resmi. (B, C) Ekleme rafa kaset. (D, E) (D) açılış ve kapanış kapağı (E). (F) sinyal bir raf varlığı makine için. (G, H) Raf giriş konut içine ekleme. (I, J) kapağı kapanışı. Gömme Protokolü (K) başlar. (L) çıkış konut kapak açılması. Çıkış konut raf formunun (M) kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: otomatik H & E stainer açıklaması. (A)resim slayt tutucusunun. (B, C) Slayt tutucusunun içinde belgili tanımlık makine ekleme. (D) kapanış makine. Boyama Protokolü'nün (E) Başlat. (F) Exemplificative resmi bir slayttan sonra microtome kesme ve H & E boyama. Doğru kapı aynası, H & E örnek yönünü gösteren boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: H & E stainings kolon örnekleri formu tedavi edilmezse ve DSS tedavi fareler. H & E tedavi edilmemiş (A) ve DSS tedavi (B) örnekleri boyama hazırlanan (işlenen, gömülü, lekeli) ile (A, B) otomatik veya el ile (C) yöntemleri. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Mallory trichrome (A, B) ve CD20 + hücreler (C, D), sızmak, IHC stainings tedavi edilmezse (A-C) ve (B, D) tedavi DSS fareler. Mallory boyama: mavi, kollajen, koyu pembe, çekirdek, koyu kırmızı, sitoplazma. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: el ile ve otomatik iletişim kuralları ile histopatolojik analizler arasında karşılaştırma. (A)toplam histopatolojik parametrelerinde değerlendirilebilir Kılavuzu (beyaz çubukları) veya otomatik yöntemi (mor çubuk) ile hazırlanan tüm bölümleri. (B) yüzdesi Kılavuzu (beyaz çubukları) veya tedavi edilmemiş (düz çubuk) veya DSS tedavi fareler (noktalı çubuk) otomatik yöntemi (mor çubuk) ile hazırlanan örneklerde belirtilen parametreler. İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon eşleşen çiftleri ile imzalanan rütbe t testi hesaplanır. p < 0,05; p < 0.005. SEM bildirilen değer ± demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif Süresi (dk) sıcaklık (° C) basınç
NBF 1 RT ortam
Etanol %95 1 RT ortam
Etanol %95 1 RT ortam
Etanol %95 1 RT ortam
Mutlak etanol 1 45 ortam
Mutlak etanol 11 45 ortam
Mutlak etanol 30 RT ortam
Ksilen 1 RT ortam
Ksilen 1 45 ortam
Ksilen 28 45 ortam
Parafin mumu 5 65 Vakum

Tablo 1: otomatik doku işleme protokolü.

Her kaset için robot tarafından eylem perfomed
Bir kaset rafa kaldırmak
Kaset tanımlamak
Kalıp ön ısı
Üzerinde önceden ısıtılmış kalıp kaset yerleştirin
Parafin kaseti için miktarı dağıtmak
Kalıp serin
Parafin kuvvetlendirmek izin
Katılaşmış parafin blok kalıp kaldırma
Engellemek için kalite sensörler mevcut
Parafin blok çıkış kapı yerleştirin

Tablo 2: iletişim kuralı gömme otomatik.

Kategori Ölçüt Tanımı Puan değeri
İnflamatuar hücre sızmak Önem derecesi (lökosit yoğunluğu içinde sızmış lamina propria alanının hpf değerlendirilmesi) Hiçbir sızmak 0
En az akut (< % 10) 0,25
Hafif kronik (% 10-25, dağınık nötrofil) 0,5
Kronik (26-%50) orta 0,75
İşaretli (> % 51, yoğun sızmak) 1
Ölçüde (lökosit infiltrasyonu genişlemesi) Mukozal 0,5
Mukozal ve submucosal 0,75
Epitelyal değişiklikler Hiperplazi (boyuna kriptalarının, crypt uzama görünür epitel hücre sayıları artış) Hiçbir hiperplazi 0
En az (< % 25) 0,25
Hafif (26-%35) 0,5
Orta (36-%50, mitoses crypt epitel üst üçüncü) 0,75
İşaretli (> % 51, mitoses içinde crypt uzak epitel crypt temel üzerinden) 1
Goblet hücre kaybı (goblet hücre sayıları temel goblet hücre sayıları crypt başına göre azalma) Hiçbir kaybı 0
En az (< % 25) 0,25
Hafif (26-%35) 0,5
Orta (36-%50) 0,75
İşaretli (> % 51) 1
Mukozal mimarisi Ülserasyon (epitel defekti muscolaris mucosae ulaşan) Hiçbir ülser 0
Ülser 0,25
Granülasyon dokusu (bağ dokusu onarım ile yeni kılcal, hücreleri, infiltre tarafından çevrili alanlar hipertrofik) Hiçbir granülasyon dokusu 0
Granülasyon dokusu 0,25
Mukozal kalınlığı ve crypt derinliği Hiçbir kalınlaşma 0
Kalınlaşma 0,5
Salgı rarefaction Yok rarefaction 0
Rarefaction 0,5
Displazi Displazi 0
Displazi 0,5
MAX PUANI 6

Tablo 3: Protokolü boyama otomatik.

Eylem perfomed her slayt için boyayıcı tarafından Reaktif zaman (s) sıcaklık (° C)
Essicate 180 60
Essicate 180 60
Deparaffinize Ksilen 120 RT
Deparaffinize Ksilen 120 RT
Hidrat Etanol %96 120 RT
Hidrat Etanol %96 120 RT
Yıkama Distile wtaer 240 RT
Leke hematoksilen Carazzi'nın hematoksilen 540 RT
Durulama Musluk suyu 360 RT
Eozin leke Eozin Y % 1 aqueos çözüm 60 RT
Durulama Musluk suyu 120 RT
Kurutmak Etanol %96 20 RT
Kurutmak Etanol %96 20 RT
Kurutmak Mutlak etanol 15 RT
Kurutmak Mutlak etanol 15 RT
Açık Ksilen 30 RT
Açık Ksilen 30 RT

Tablo 4: düzeni bağırsak iltihabı değerlendirme için Puanlama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Histopatolojik analiz için fare doku hazırlanması sırasında farklı otomatik adımları kullanmak. Bu iletişim kuralı tekrarlanabilirlik ve böylece son histopatolojik değerlendirme genel kalitesini arttırmak tüm süreç standardizasyonu artırmak için teknik ipuçları sunmayı amaçlamaktadır. Biz otomatik aletler ve hazırlık ve rutin olarak insan örneklerin incelenmesi için patoloji çekirdek tesislerinde kullanılan dokuların katıştırma yöntemleri hayata.

Bu yöntemin potansiyel uygulanabilirliği göstermek için biz bağırsak iltihabı, DSS kaynaklı kronik kolit modeli olarak adlandırılan kronik fare deneysel ayarı seçti. Bu ayar kronik bağırsak iltihabı meydana gelen doku mimarisinin derin değişiklikler araştırmak için ayrıntılı histolojik değerlendirme gerektiren IBD hastalarda gözlenen karmaşık hastalık sahası benzer. Özet olarak, bu süreçlerin histolojik değerlendirme büyük ölçüde artan örnek hazırlama kaliteden yarar olabilir. Odaklı kaset olmadan bir lümen dokular için gerekli değildir o varlık notu için bu Protokolü (yani, dalağı, lenf bezleri, karaciğer, beyin), diğer fare doku ile tek fark uygulanır.

En önemli gözlem el ile hataları, azalma olduğunu (yani, örnek yönünü) verilen kaset Izgaralar ile kullanımı ve kaset (yaygın olarak el ile sırasında gerçekleştirilen bir adım gömmek için yeniden açılması kaldırılması iletişim kuralları), güçlü genel tekrarlanabilirlik Analizi gelişmiş. Deneyci odaklı kaset doku ekler, burada açıklanan protokol ile hazırlık, başlangıçta yalnızca örnek yönetilebilir. Bir kez kapalı, kasetleri asla, böylece doğru yönlendirmeyi bakım sağlanması ve el ile hataları3,11azaltarak tekrar hizmete vardır. Bu iki kritik adımı standardizasyon daha sonraki analizler tüm kalitesini arttırmak ve kayıp ya da değil değerlendirilebilir örnekleri, her ikisi de ve kaset yeniden açılması veya örnek3 yanlış yönünü bağlı sorunlar sayısı azaldı ,11.

Biz de çok sık deneysel bağırsak iltihabı, fare modellerinde otomatik protokolünün uygulaması tarafından hafife fibrozis (Şekil 7), gibi karmaşık bir biyolojik olay değerlendirilmesinde başarılı oldu. Protokol kurulumu sırasında biz kesinlikle biz doku değişiklikleri önlemek için 24 h'ü fark fiksasyon zamanı gibi teknik ayrıntılar standart. Böylece, sonraki immunohistokimyasal analizleri kalitesini korumak.

Otomatik yöntem ilişkilendirilmiş doku mimari, tedavi edilmemiş farelerde özellikle İLETİMLERİNİZE için bu parametrelerin değerlendirilmesi geliştirilmiş. Gerçekten de, sağlıklı bir muadili patolojik bir dokuyla doğru karşılaştırılması kritik deneysel model3son değerlendirme için önemlidir.

Doku işleme ile ilgili laboratuvarda olan otomatik işlemci çalıştırılmak üzere farklı protokolleri test ettik. Burada açıklanan protokol ses ve son derece tutarlı sonuçlar vermiştir. Biz de protokol için bir zaman uzunluğu hayata. Fare örnekleri insan küçük biopsic numuneler boyutunda karşılaştırılabilir yaşından beri bir daha kısa protokol antikorundan (Bu durumda bağırsak,) işlemek için yeterli doku. Son olarak, tüm otomatik işlemleri toplam deneysel zaman azaltılmış. Microtome kesme ve dilimleri hazırlık için işlem başlangıcından itibaren toplam zaman gerekli-5 h olduğunu hesaplanır. Aksine, operatör teknik yetenek bağlı olarak, aynı protokolleri tamamlanması el ile iki katından fazla miktarı saat, işlenmesi ve katıştırma özellikle sırasında gerektirebilir. Teknik bir sınırı otomatik işlemciler ve laboratuvarda olmak gerçekleştirilecek embedder gerektirmesidir.

Sonuç olarak, biz bu otomatik iletişim kurallarının uygulanması büyük ölçüde insan hastalıkları fare deneysel modelleri ile mücadele translasyonel araştırmacılar çalışmalarını iyileştirmek inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz IRCCS Policlinico hastane, Milan için teknik destek ve yardım için IEO hayvan tesisi patoloji bölümü Hayvancılık içinde teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. New York, N.S.N.Y. (2010).
  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter