Summary
Este manuscrito describe un método de CRISPR Cas9 basado en cluster regularmente otro corto palindrómico repite (CRISPR) simple y expedita investigación del papel de varios genes candidatos en la proliferación de células de leucemia mieloide aguda (AML) en paralelo. Esta técnica es escalable y puede ser aplicada en otras líneas celulares de cáncer así.
Abstract
Estudios de perturbación del gene se han utilizado para investigar el papel de los genes individuales en la patogenesia de la AML. Para lograr la interrupción del gen completo, muchos de estos estudios han hecho uso de modelos de complejos gene knockout. Si bien estos estudios con ratones knockout ofrecen un sistema elegante y comprobado para investigar relaciones genotipo a fenotipo, un método rápido y escalable para la evaluación de genes candidatos que juegan un papel en la proliferación de células AML o supervivencia en modelos AML le ayudará a acelerar el interrogatorio paralelo de múltiples genes candidatos. Los avances recientes en tecnologías de la edición del genoma han mejorado considerablemente nuestra capacidad para llevar a cabo las perturbaciones genéticas en una escala sin precedentes. Tal sistema de la edición del genoma es el método basado en el Cas9 CRISPR que puede utilizarse para hacer rápidas y eficaces alteraciones en el genoma de la célula blanco. La facilidad y la escalabilidad de la canceladura del gene CRISPR/Cas9-mediada, es una de las técnicas más atractivas para el interrogatorio de un gran número de genes en los ensayos fenotípicos. Aquí, presentamos un ensayo simple utilizando CRISPR/Cas9 mediada gen-interrupción combinada con ensayos de alto rendimiento basado en la citometría de flujo competencia para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel importante en la proliferación o la supervivencia del ser humano y líneas celulares de ratón AML.
Introduction
Las últimas décadas han visto numerosos esfuerzos de investigación se centró en la identificación de la contribución de principales vías moleculares en la patogenia de la leucemia mieloide aguda (AML). Tradicionalmente, interrupción de genes en las células de la AML se ha realizado con ratones knockout condicional o short hairpin RNA (shRNA). Mientras que los ratones knockout ofrecen un sofisticado sistema de control espacio-temporal de la canceladura del gene, generación de ratones knockout de genes es mano de obra intensiva, desperdiciador de tiempo y costoso. Por otra parte, gene knockouts utilizando estrategias de recombinación no es fácilmente escalable; Estas estrategias no se prestan bien al interrogatorio de varios genes en paralelo. Tras el descubrimiento de métodos de interferencia RNA mRNAs endógena de precipitación mediante ARN interferente pequeño (siRNA) o shRNA, muchos grupos comenzaron a utilizar técnicas de interferencia de RNA para investigar el papel de genes específicos en AML. Desde murinas y humanas células AML son notoriamente difíciles de transfectar utilizando métodos tradicionales de base de lípidos la transfección, la mayoría estudios shRNA empleada lentivirally o retrovirally codificadas para el estudio de funciones de los genes en las células de la AML. El reciente descubrimiento de agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y las nucleasas Cas asociadas (CRISPR-Cas9) ha revolucionado gene targeting tecnologías1,2,3. Usando CRISPR Cas9, determinados genes o regiones genómicas pueden ser eliminadas, editadas o etiquetadas con eficacia y facilidad. Basado en el Cas9 CRISPR gene-edición surge ahora como el método de elección para investigar la relación genotipo-fenotipo en tipos de células diferentes debido a la simplicidad, eficacia y amplia aplicabilidad de esta técnica. También se están convirtiendo CRISPR Cas9-métodos basados en el método de elección en la AML, no sólo para interrogar a los genes individuales, sino también como una manera de objetivo de múltiples genes en pantallas genéticas vestidas o combinados destinado a investigar varios genes en paralelo como potencial AML-dependencias4,5,6.
En este manuscrito, describimos un análisis simple crecimiento competitivo para la medición del impacto de la gene-interrupción en el crecimiento de las células de la AML, basado en estable mediada por Cas9 CRISPR gene-edición seguida por citometría de flujo de alto rendimiento. Este método es simple, eficiente y escalable a medio rendimiento experimentos para investigar el papel de varios genes en paralelo en las células de la AML.
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Protocol
1. generar AML celular línea Clones con alta expresión de Cas9 estables y activos
- Producción de lentivirus Cas9
- Día 0: Placa 4 x 106 293T células en 10 mL de DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina y L-glutamina en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en una bioseguridad nivel 2 (BSL2) certifican campana de cultivo celular. Coloque el plato en una incubadora de 37 ° C.
- Día 1: Las células 293T plateado deben ser confluente de 70 – 80% el día 1. Realizar la transfección con el siguiente protocolo de la tarde.
- Calentar el medio de transfección, medios de cultivo y reactivo de transfección a temperatura ambiente. Descongelar todos la plásmidos necesaria para transfección.
- Mix 9 μg de psPAX2, 0,9 μg de pMD2.G y 9 μg de Cas9 pLenti plásmidos con 500 μl de medio de transfección en un tubo de 5 mL.
- Añadir 1,7 mL de medio de transfección a una 14 mL tubo de fondo redondo. Añadir 57 μl de reactivo de transfección directamente en el medio de transfección en el tubo para evitar el contacto con la pared del tubo.
- Suavemente, añadir la mezcla de plásmido toda solución de reactivo de transfección y mezclar golpeando suavemente el tubo en el lado. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min. Mientras tanto, cambiar el medio de la placa de semillas 293T.
- Añadir la mezcla de transfección gota a gota a la placa y con cuidado la placa hacia los lados para la mezcla eficaz. Colocar la placa en una incubadora de 37 ° C.
- Día 2: Aspirar el sobrenadante de la placa de la transfección con suavidad tal que las células no son perturbadas o desalojadas de la placa. Deseche el sobrenadante. Añadir 10 mL de medio DMEM de fresco 10% deslizando suavemente hacia abajo de los lados de la placa para evitar el desalojo de las células.
- Día 3: Recoger el virus con sobrenadante de la placa de transfección lentamente dibujando en una jeringa estéril de 10 cm. Después el sobrenadante se recoge en la jeringa, conecte un filtro μm 0.45 estéril en la jeringa y sostenga la jeringa y el filtro en un tubo cónico polipropileno de 15 mL estériles, fresco. Hundir suavemente la jeringa para filtrar los virus que contiene el sobrenadante a través del filtro de 0,45 μm en el tubo cónico de 15 mL polipropileno.
- Almacenar el medio condicionado viral en alícuotas de 2 mL en crioviales de 2 mL a-80 ° C.
- Transducción de líneas de células de la AML
- Día -1: Diluir stock de fragmento de fibronectina humana recombinante de 1 mg/mL y 10 μg/mL con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Capa un cultivo de tejidos-no había tratado 6 bien la placa con 2 mL de la solución de trabajo de fragmento de fibronectina humana recombinante 10 μg/mL en una campana de cultivo celular BSL2 aprobado. Envolver la placa en el abrigo se aferra para evitar pérdidas por evaporación y almacenar a temperatura ambiente durante la noche.
- Día 0: Descongela el sobrenadante viral que contiene Cas9. Aspirar la solución de fragmento de fibronectina humana recombinante completamente de la placa de cubierta antes de spinfection. Añadir 2 mL de medio condicionado viral con Cas9 al plato y vuelta a 1.300 x g durante 90 minutos a 35 ° C. Esto ayuda a las partículas virales fije a la spinfected bien.
- Mientras tanto, contar las células para ser transduced y 2 x 106 células en un tubo cónico de polipropileno de 15 mL. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 mL de medio de cultivo fresco.
- Después de spinfection, quite todo el sobrenadante viral de la spinfected bien y deseche. Las partículas retrovirales en el sobrenadante se unen a la parte inferior de la spinfected bien. A esto bien, añadir las 2 x 106 células suspendidas en 2 mL de medio en el paso anterior.
- Haga girar la placa otra vez a 1.300 x g muy brevemente (1-2 min) suficiente para permitir que las células para instalarse en la parte inferior. Coloque la placa en la incubadora y dejar toda la noche para la transducción con las partículas virales spinfected conectadas al pozo.
- Día 1: Dependiendo de la densidad celular, añada medio más a las células transduced para evitar crecimiento excesivo.
- Día 2: Puesto que el plásmido pLenti Cas9 tiene un marcador de resistencia Blasticidin, agregue Blasticidin en una dosis de 10 μg/mL a untransduced y transduced (control) MOLM13 o células de la leucemia del ratón MLL-AF9 para la selección de Cas9 expresando las células.
Nota: Blasticidin selección de las Cas9-transduced MOLM13 o MLL-AF9 células de leucemia se considera completa cuando se han eliminado todas las células del control untransduced. Para líneas celulares que no sean MOLM13 y MLL-AF9 leucemia, una curva de respuesta de dosis debe realizarse antes de este experimento por lo que puede emplearse una dosis óptima. Titulación del sobrenadante viral también se puede realizar en caso de tarifas bajas-transducción.
- Selección de células expresando su alta Cas9 de clon.
Nota: Hemos notado que en algunas líneas de células de la AML, selección de clones podría no ser necesaria: la mayor parte población Cas9-Blasticidin seleccionado ya tiene eficacia alta edición del genoma. En este caso, es posible omitir paso 1.3 y pasemos al paso 1.4 evaluar Cas9 expresión en las células AML a granel Cas9 blasticidin por borrar occidental. Todavía sería importante evaluar eficiencia edición de gene en esas células a granel Cas9 AML (paso 1.5) antes de proceder a los análisis de la competencia. Suponemos que la selección de clones de alta sola-Cas9 reduce la variabilidad edición del genoma, que es especialmente importante cuando se prueba un número de guía solo diferentes RNAs (sgRNAs).- Realizar una sola célula de la Cas9 Blasticidin seleccionado MOLM13 y MLL-AF9 células de la leucemia, en adelante llamadas MOLM13-Cas9 y MLL-AF9-Cas9 células, respectivamente, mediante un clasificador de FACS contenido en una campana de BSL2 aprobado. Clasificación se puede realizar en 5 – 10 fondo redondo tejido de la cultura tratada 96 placas de pozos.
- Solo una vez MOLM13 Cas9 y MLL-AF9-Cas9 clones han sido recogidos y nombradas individualmente, amplían 10 – 20 clones con 10 μg/mL de Blasticidin en medios de cultivo para garantizar el mantenimiento de Cas9 expresión.
- Expresión para comprobar de proteína estable de Cas9 immunoblotting.
- Hacer extractos nucleares de todos los clones de Blasticidin seleccionado de la leucemia MOLM13 y MLL-AF9 utilizando el Kit de extracción Nuclear según protocolo del fabricante. Compruebe el uso de Anti-Flag M2 anticuerpos desde el Cas9 en el plásmido pLenti Cas9 está vinculada a un epitopo de la bandera del N-terminal de la expresión de la proteína de Cas9.
- 50 μg de la proteína total de la carga de cada extracto nuclear en 10% Bis-Tris del gel y el gel en 120 V hasta bandas superiores están bien separadas.
- Bloquear la membrana con solución de leche de 5% en buffer TBST durante 1 hora.
- Incubar la membrana con 1:1,000 dilución del anticuerpo de Anti-Flag M2 a una concentración final de 1 μg/mL a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, lavar la membrana con buffer TBST e incubar con HRP conjugado anti-ratón de anticuerpo secundario a la dilución de 1:5,000 (concentración final de 0.16 μg/mL) a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar la membrana con TBST y desarrollar la mancha blanca /negra usando sustrato de ECL.
- Toma 3-4 clones con la más alta expresión de la proteína de Cas9 por Western blotting para su posterior análisis funcional (figura 1).
- Garantizar la alta actividad de Cas9 de clones seleccionados
- Preparar sobrenadante lentivirales de un vector de codificación de sgRNA con sgRNAs a los humanos o ratón AAVS1 locus de puerto seguro como se describe en el paso 1.1.
- Transduce la parte superior expresando Cas9 MOLM13 o leucemia MLL-AF9 clones con el anti-AAVS1 sgRNA lentivirales sobrenadante utilizando el método de spinfection descrito anteriormente. Seleccione con puromicina de 2,5 μg/mL durante 4 días.
- Purificar el ADN genómico de los clones de leucemia MOLM13-Cas9 o MLL-AF9-Cas9 después selección puromicina junto con los respectivos controles de tipo salvaje utilizando el kit de extracción de ADN genómico según las instrucciones del fabricante. Uso 50 ng de ADN como plantilla para realizar una PCR con la AAVS1_test_primers usando el 2 x master mix de Taq polimerasa y el programa PCR enumerados en la tabla 1.
- Ejecutar el producto PCR en un gel de agarosa al 2% y gel-purificar la banda de 268 pares utilizando un kit de extracción de gel según protocolo del fabricante. Secuencia de Sanger el gel purificado producto de la polimerización en cadena usando la cartilla de AAVS1_target-frag_F.
- Evaluar la eficacia de edición por la comparación de AAVS1 editado y secuencias de tipo salvaje utilizando herramientas basadas en web en línea (figura 2).
2. clonación y transducción de sgRNAs en las células de la AML Cas9
-
Rendimiento medio de la clonación de sgRNAs
- Diseño de 4 a 6 sgRNAs para el gen de interés mediante un software de diseño CRISPR basada en web. Hay una serie de herramientas de diseño CRISPR disponibles en línea como http://crispr.mit.edu/ que generan secuencias sgRNA basado en una secuencia de ADN de entrada.
- Rellene una información apropiada en los campos con asteriscos. Haga clic en el genoma de destino sgRNA diseño. Pegue la secuencia de destino en el cuadro de secuencia y haga clic en el botón Enviar .
- Para clonar en el pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido de expresión sgRNA W, anteponer los nucleótidos "CACC" oligo sentido y "AAAC" a la inversa oligo antisentido complementada antes de ordenar. Orden premezclado sentido y anti-sentido oligos en una placa de 96 pocillos etiquetados Oligo-Mix de una empresa de síntesis de oligonucleótidos.
Nota: Hemos hecho uso de la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido W, que tiene el sitio de restricción BbsI sgRNA clonación. En el caso de otros plásmidos de expresión sgRNA se utilizan, los voladizos que se utiliza para los oligonucleótidos sgRNA deben cambiarse en consecuencia. - Tomar una placa de 96 pocillos de fondo de U separada etiquetada Del recocido de la placa. Hacer una mezcla maestra de 1 μl de T4 PNK, 1 μl de 10 x buffer de ligadura de ADN T4 y 6 μl de agua por reacción de recocido.
- Añadir 8 μl de la master mix a cada pocillo de la placa de recocido. Añadir 1 μl de 100 μm, sentido y oligo antisentido (o 2 μl de oligos de sentido-anti-sentido mixto) a la mezcla principal. Pipetear 2 – 3 veces suavemente para mezclar bien, hacer girar la placa para obtener las mezclas hasta el fondo de los pozos.
- Usar el siguiente programa de recocido en una máquina PCR: 30 min a 37 ° C, 2 min 30 s a 95 ° C seguido de un enfriamiento lento a 22 ° C a una velocidad de 0.1 ° C/s. Después de recocer, tomar una placa de 96 pocillos fresca etiquetada OligoMix diluido. En esta placa, diluir los oligos fosforilada y recocido de la reacción anterior con agua (1: 200) utilizando una pipeta multicanal.
- Digest 5 μg de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vector W con 1,5 μl de enzima de la restricción del BbsI (10.000 unidades/mL) utilizando un buffer apropiado a 37 ° C por 2 h para linealizar para después de la ligadura.
- Un plato bien fresco 96 con Ligadura de la placa y añadir 20 ng de lo títulos BbsI digerido (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 vector de W a un pozo por ligadura sgRNA deseada. A esto, añadir 2 μl de oligos fosforilada, recocido de la placa de OligoMix diluido .
- Añadir 1 μl de tampón de ligasa de x T4 10 y 1 μl de la enzima T4 ADN ligasa. Pipetear con una pipeta multicanal e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 h de ligadura.
Nota: Mezclas de ligadura pueden almacenarse a-20 ° C para el paso de la transformación más adelante. - Mientras tanto, deshielo 90 μl de químicamente competentes de e. coli las células en hielo 10 minutos antes del final de la etapa de la ligadura.
- Usando una pipeta multicanal, hacer 10 alícuotas de μl de células competentes en cada pocillo de una placa bien 96 independiente.
- Añadir la mezcla de la ligadura del paso 2.1.8 en el bien que contiene las células competentes, pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Pipeta de 5 μl de la mezcla de ADN de bacterias directamente de la reacción anterior en 6 bien placa conteniendo agar LB con 100 μg/mL de ampicilina. Repetir para cada una de las reacciones de transformación.
- Cada reacción de la transformación en una por separado con bien de una placa de 6 pozos de la placa. Añadir aproximadamente 5-8 granos de cristal a cada bien y agitar la placa todo bien 6 8 a 10 veces en un movimiento circular.
- Recoger las colonias solo 1 – 2 cada pocillo con una pipeta de 20 μl estériles y raya en un lugar cuidadosamente etiquetado en un estéril 10 cm plato de Petri con agar LB y 100 mg/mL de ampicilina. Después de rayar en la placa LB, simplemente expulsar la punta utilizada para clon rayas en 3 mL de LB-ampicilina que contiene medio de 14 mL tubo de fondo redondo marcado con el correspondiente número de clon bacteriano.
- Enviar la placa bacteriana directamente para Sanger secuenciación con el primer avance humano U6 promotor.
- Después de la confirmación de la secuencia de sgRNAs clonado, purificar el ADN del tubo correspondiente de 14 mL con el equipo de mini-prep según las instrucciones del fabricante.
- Medir la concentración y la calidad de cada uno de lo mini-Prep con un espectrofotómetro. Normalizar cada mini-prep a una concentración de 15 ng/μl y pipeta en una placa bien 96 etiquetados sgRNA placa de Clones.
Nota: Esta placa se puede almacenar a-20 ° C o utilizada directamente para la preparación de virus.
- Diseño de 4 a 6 sgRNAs para el gen de interés mediante un software de diseño CRISPR basada en web. Hay una serie de herramientas de diseño CRISPR disponibles en línea como http://crispr.mit.edu/ que generan secuencias sgRNA basado en una secuencia de ADN de entrada.
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Producción viral de sgRNA construcciones y transducción de señales
- Para la producción de partículas lentivirales sgRNA en el formato de 96 pocillos, siga el "shRNAs/sgRNA/ORF alto rendimiento producción Viral (96 bien)" Protocolo de la plataforma genética de perturbación (web Portal GPP) del Instituto Broad (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
- Transfiera 200 μL de sobrenadante viral a tubos estériles y congelar inmediatamente a-80 ° C.
- Día -1: Aplique un fondo plano no tejido placa bien 96 de cultivo tratado con 100 μl del fragmento de la fibronectina humana recombinante a una concentración de 10 μg/mL en una campana de cultura BSL2 celular. Envolver la placa con cling wrap para evitar pérdidas por evaporación y dejarlo en el Banco durante la noche.
- Día 0: Quitar el fragmento de la fibronectina humana recombinante de cada pozo. Descongelar el sobrenadante viral de cada sgRNA a temperatura ambiente. Añadir 50 μl de sobrenadante viral de cada tubo a cada cubierta de la placa de la transducción de señales. Girar la placa de la transducción a 1.300 x g durante 90 minutos a 35 ° C.
- Hacia el final de spinfection, Conde MOLM13-Cas9 (clon B3) células del frasco de cultivo. Utilizan 10.000 células por pocillo en volumen μl 100. Contar las celdas de todos los pozos de la transducción de señales, habida cuenta de volumen muerto.
- Después de la spinfection de 90 min., retire el sobrenadante de todos los pozos utilizando una pipeta multicanal ajustada a 50 μl lentamente inclinando la placa. Añadir 100 μl del cultivo de las células del clon B3 MOLM13 Cas9 a cada bien poco a poco deslizarse desde el borde.
- Haga girar la placa a 1.300 x g durante 2 min a 35 ° C a dejar que las células a instalarse en la parte inferior. Transferir la placa a la incubadora de 37 ° C cultivo de tejido grado.
- Día 1: Agregue 100 μl de medio fresco a cada bien que contenga sgRNA transduced Cas9 MOLM13 o Cas9-MLL-AF9 leucemia células tal que el volumen final del medio es 200 μl.
3. ensayo de crecimiento competitivo
- Día 3: 72 h (día 3) transducción de correos, compruebe el porcentaje de sgRNA que contiene las células positivas de BFP en cada pozo por citometría de flujo (FACS). Utilice un tinte de viabilidad celular para marcar y excluir las células muertas a partir del análisis.
- Continuar volver a platear una proporción de las células en nuevos pozos con medio fresco después de cada análisis FACS para evitar crecimiento excesivo durante el ensayo.
-
Repita el análisis FACS cada 2 – 3 días para comprobar la proporción relativa de BFP positivos (BFP + ve) las células en comparación con el BFP negativo (BFP-ve) (figura 3). Analizar el porcentaje de células positivas de BFP para cada punto de tiempo (utilizando el FlowJo o software similar de análisis FACS).
- Arrastre archivos de Fcs para cada muestra a FlowJo software. Haga doble clic en cualquier archivo de una muestra y marca un punto borran de forward scatter (FSC) vs dispersión lateral (SSC) con FSC en el eje de X y SSC en eje Y. Todas las células de la puerta.
- Haga doble clic en las celdas cerradas y parcela a la tinción de viabilidad (en eje Y) versus altura FSC (H) o área (A) punto mancha blanca/negra. Las viabilidad Tinción negativa (en vivo) las células de la puerta.
- Haga doble clic en células vivas cerradas y parcela BFP (en eje Y) vs FSC (A) en el eje X. Ve células + puerta BFP. Estas puertas se aplican a todas las muestras arrastrando la muestra seleccionada a Todas las muestras en Grupo ficha.
- Haga clic en Editor de la tabla para hacer una tabla de análisis de las muestras. Arrastre BFP + ve cuenta de una muestra en la tabla y haga clic en el botón de pantalla en el Editor de la tabla para crear un informe de lote de todas las muestras con una tabla mostrando el porcentaje de células BFP + ve . Guarde la tabla como un xls.
- Calcular el proporcional aumento o disminución en % células positivas de BFP en la población de células vivas en el tiempo y comparar esta relación a la proporción de células positivas de BFP en la sgRNAs de control (como luciferase, revueltos o GFP sgRNA).
- Parcela la proporción de células positivas de BFP para el sgRNAs diferentes incluyendo los genes de interés, así como controles mediante día 3 como base.
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Representative Results
En nuestro estudio, nosotros primero transduced la MOLM13 humana AML línea celular que lleva a la translocación MLL-AF9 con virus de alto título codificación el plásmido lentivirales Cas9-blasticidin. En nuestras manos, a granel sin clasificar MOLM13 Cas9 células no muestran el alto nivel Cas9 expresión por borrar occidental y también no se realizó bien cuando ensayaron por edición-el método eficaz de genes descritos7. Por lo tanto, se procedió a establecer los clones de células individuales y sólo seleccionar los clones con altos niveles de Cas9 por Western Blot (figura 1). Había escogido 2 clones distintos y transduced con sgRNAs dirigida a un sitio en el locus de puerto seguro de AAVS1 descrito anterior7. Usando la DNA genomic extraída de lo sgRNA seleccionado puromicina Cas9 AAVS1, MOLM13 clones, realizamos una PCR usando las cartillas que abarca lo sgRNA AAVS1 cortar sitio y sanger secuenció un determinado producto PCR bp 268 de 10 colonias aisladas para cada clon de MOLM13. Después de la alineación con la secuencia de los padres, encontramos que MOLM13 Cas9 clon B3 y MLL-AF9-Cas9 clon 8 tenían una eficacia del 100% (datos no mostrados). Luego seleccionamos estos clones con alta capacidad de edición del genoma mediaron Cas9 para nuestros ensayos de competencia sgRNA. Mientras se estaban realizando estos estudios, herramientas web para probar rápidamente eficacia edición genómica de Sanger secuencias fueron desarrolladas por diferentes grupos como marea8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) o hielo (https://ice.synthego.com/#/). Estas herramientas hacen extremadamente fácil y rentable para evaluar eficacia de edición del genoma sin tener que clonar los fragmentos individuales y realizar la secuencia de múltiples clones. Por lo tanto, a granel Cas9-expresar las células primero deben analizarse para el genoma edición eficacia usando estos métodos. En el caso de la eficacia de la edición del genoma es alta, entonces sola célula la clonación no es necesaria. También, en caso de clonación celular solo es necesario como se ha visto en nuestros estudios, estas herramientas de estimación de frecuencia mutacional en la web ofrecen un método mucho más rápido para probar varios clones en paralelo.
Para clonar los sgRNA, hicimos uso de lo sgRNA clonación plásmido pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, que alberga una proteína fluorescente azul (BFP) para el seguimiento de células transduced sgRNA y un impulsada por la ARN polimerasa III humano U6 promotor que impulsa a la expresión de la clonada sgRNAs junto con el andamio de tracer RNA (tracRNA). Hemos utilizado este sistema para clonar 2 sgRNAs a DOT1L, una proteína que juega un papel importante en la regulación epigenética de la expresión génica. DOT1L es una histona metiltransferasa que deposita mono, di y tri-metilación en genes de blanco9,10. Los estudios han demostrado que la DOT1L juega un papel importante en la AML impulsada por oncogenes de fusión MLL. Por lo tanto, se espera que DOT1L nocaut con CRISPR Cas9 conducir a deteriorar significativamente la proliferación de células de la leucemia del ratón MLL-AF9 en consonancia con anteriores estudios11,12,13,14. Hemos utilizado dos sgRNAs contra el AAVS1 puerto seguro del lugar geométrico, que se encuentra en el intrón del gen PPP1R12C. sgRNAs producir alteraciones genómicas en este sitio no son propensos a tener efectos sobre la capacidad proliferativa de líneas celulares de leucemia MLL. Como control positivo, clona sgRNAs dirigidas a lo asociados de replicación del gene del ADN RPA3. RPA3 es un gen esencial de pan que se ha demostrado para ser importante para la proliferación de varias células AML líneas4,de15,16 . Por lo tanto anti-RPA3 sgRNAs Mostrar fuertes efectos antiproliferativos en las células de la AML y se suelen utilizar como control positivo. Después de la transducción con anti-AAVS1 y anti-RPA3 sgRNA plásmidos, mide la proporción relativa de BFP + ve sgRNA transduced las células en comparación con sus contrapartes de BFP-ve cada 2 – 3 días en cultivo (figura 3). Con el protocolo descrito anteriormente, la transducción de células MOLM13 o MLL-AF9 AML resultó en un 60 – 70% eficiencia de transducción con la preparación viral, dejando las restantes células de 30-40% untransduced o BFP-ve en cada pozo. Esto permite el estudio de la relativa proliferación de células genoma editado con células de tipo salvaje en el mismo bien. El aumento proporcional o la disminución del porcentaje de células transduced sgRNA fue utilizado como una medida para reflejar el efecto funcional de sgRNA mediada por la canceladura del gene en las células MOLM13-Cas9. Si tu gen de interés es importante para la proliferación de las células AML de la prueba, luego sgRNA mediado interrupción de este gen dará lugar a la disminución relativa de la BFP expresando sgRNA + ve las células en comparación con las células de BFP-ve durante el transcurso del ensayo, mientras que sgRNAs a la luciferasa, GFP o genes no esenciales retendrá el BFP + ve-ve relación con el tiempo.
Utilizando 2 independiente anti-RPA3 sgRNAs, observamos una disminución progresiva y significativa en el porcentaje de BFP + ve las células en comparación con el BFP-ve untransduced homólogos. En contraste, el porcentaje de anti-AAVS1 sgRNA expresando células BFP seguía siendo relativamente constante en el tiempo, demostrando que AAVS1 targeting no tiene efecto sobre la proliferación de células de MOLM13 (figura 4a). Del mismo modo, en las células de ratón MLL-AF9-Cas9, hemos probado los efectos de la sgRNAs dirigidas a Rhodopsin (Rho1), el gen de pigmentación del ojo como un control negativo y Dot1l, un regulador epigenético conocido por ser necesario para la proliferación de células de leucemia MLL-AF9 con el tiempo . En este estudio, BFP + ve ratón MLL-AF9-Cas9 células transduced con 2 independiente anti-DOT1L sgRNAs demostraron una pérdida dramática y progresiva con el tiempo en comparación con las células BFP-ve sgRNA no-transduced (Figura 4b). En contraste, la proporción de anti-Rho1 sgRNA seguía siendo relativamente sin cambios en el tiempo. Estos resultados demuestran la vulnerabilidad de la MLL-AF9 expresando células de leucemia de ratón Dot1l agotamiento, confirmando resultados previamente publicados.
Figura 1: Representante Western blot resultado mostrando diferentes niveles de Cas9. Clones de la célula de la línea celular de MOLM13 AML transduced con CAS9 fueron sondeados para los niveles de expresión bandera Cas9 usando los anticuerpos de Anti-Flag. Se seleccionaron clones que muestra la máxima expresión de Cas9 para estudios posteriores. Las células HEK293 T transfectadas con un plásmido de expresión fueron utilizados como control positivo y las células no-transduced MOLM13 de Cas9 como controles negativos de Cas9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: análisis representativa de la edición del genoma en el Dot1l lugar geométrico determinado por análisis de hielo. Un amplicon PCR centrado alrededor del sitio de destino Dot1l sgRNA fue Sanger secuenciados y analizados mediante análisis de hielo. Una comparación de la secuencia sgDot1l (línea naranja) a la secuencia de ADN no dirigidos (línea verde) demuestra el alto nivel de eficiencia en células sgDot1l dirigidos alrededor del sitio de destino sgRNA de edición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: flujo de trabajo esquemático de los métodos propuestos. sgRNAs se clonan en vectores de expresión sgRNA Co expresando una proteína fluorescente como BFP. Las células diana son transduced en 30 – 60% tasas de transducción y seguidas por citometría de flujo cada 2 – 3 días. sgRNAs dirigidos a genes necesarios para la proliferación de células de la AML mostrará disminución relativa en el tiempo como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante resulta del análisis de la competencia en humanos y células de AML de ratón. (un) indican a una progresiva estadísticamente muy significativa disminución RPA3 transduced las células del clon B3 Cas9 MOLM13. Por el contrario, sgRNAs a la página de AAVS1 no tienen efecto. (b) sgRNAs a Dot1l muestran una disminución progresiva y notable en la proliferación competitiva, en contraste con sgRNAs a Rhodopsin (Rho). p > 0.05. p < 0.05. Barras de error representan la desviación estándar de la media (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: esquema General del Protocolo de. (una) hora para cada paso en la producción de virus Cas9 y sgRNA clonación descritos. Diseño y reproducción de sgRNAs pueden realizarse generando clones individuales de líneas de células de la AML con expresión Cas9 estable. (b) el protocolo General para la transducción de líneas de células de la AML con sgRNAs y ensayo de crecimiento competitivo utilizando FACS se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ciclos de | Duración del ciclo de | Temperatura |
| 1 | 2 min | 95 º C |
| 35 | 30 s | 95 º C |
| 30 s | 55 º C | |
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Tabla 1: programa PCR para la amplificación del locus de AAVS1 de la DNA Genomic. Programa PCR utilizado para la amplificación del locus AAVS1 de la DNA genomic para prueba eficiencia de corte de Cas9 en Cas9 expresando clones.
Archivo complementario: secuencias de oligo sgRNA. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En este manuscrito, se describe un protocolo detallado para llevar a cabo un ensayo de crecimiento competitivo basado en el Cas9 CRISPR para investigar el papel de genes candidatos en líneas de células de la AML mediante citometría de flujo en células AML de humano/murino (figura 5). El objetivo del análisis es identificar el efecto de la canceladura del gene en el mantenimiento de la proliferación de células AML durante dos a tres semanas en una escala de rendimiento medio. Algunos pasos críticos deben seguirse cuidadosamente para facilitar la ampliación del protocolo descrito. En la producción de Cas9 lentivirus, es necesario filtrar el medio condicionado de virus a través de un filtro de 0.45 μm para evitar el arrastre de células 293T que el virus que contiene el sobrenadante. Durante spinfection, envolver la placa spinfection con cling wrap o parafilm ayuda a evitar la posible contaminación durante la centrifugación. Sin embargo, la envoltura debe retirarse antes de colocar la placa de spinfected en incubadora de cultivo de tejidos. Es muy importante evaluar clones expresando Cas9 para la eficacia de edición. Clones con genoma baja eficiencia edición reflejan actividad Cas9 inadecuada y pueden afectar la tasa de éxito del experimento. En nuestros experimentos, primero transduced clones humanos Cas9 AML con sgRNAs al lugar geométrico de AAVS1 y ordenados sus DNAs genómicos para la edición de eficiencia. Comparación de AAVS1 editado y secuencias tipo salvaje pueden ser evaluadas usando herramientas web online como marea8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) o hielo (https://ice.synthego.com/#/). Estos programas comparan a Sanger secuencia del PCR potencialmente editado fragmento a la secuencia de wildtype o referencia sin editar y estimar la frecuencia de cambios. Se trata de una forma rápida de evaluar cambios mutacionales provocados por lo sgRNA de prueba, que es la medida de la actividad celular de Cas9. Alternativamente, la clonación de la polimerización en cadena producto en un plasmid PCR clonación como el TOPO embotado de vector de clonación se puede realizar, seguido por Sanger secuenciación de colonias individuales para evaluar eficiencia edición del genoma por alineamiento de secuencias de cada copia a la tipo salvaje. Preferimos el método anterior, dado su facilidad y rentabilidad en comparación con el método de clonación. Por lo general, cambios en el descubrimiento de pares como mutaciones de punto, indels, etcetera., en o alrededor del sitio de corte sgRNA en una gran mayoría de clones secuenciados indican la presencia de un Cas9 altamente activa. Así, elegimos la leucemia MOLM13 o MLL-AF9 clones B3 y 8, respectivamente, con la mayor eficiencia de edición para más experimentos.
Diseñamos sgRNAs a diferentes genes mencionados en el protocolo utilizando http://crispr.mit.edu/, un software basado en web que da una lista de sgRNAs. Se recomienda seleccionar sgRNAs mayor puntaje de la lista para eliminarlos efectos off-target previstos. El sgRNAs diseñado puede clonarse usando cualquiera de los protocolos publicados como el en sitio web (http://www.addgene.org/67974/). Sentido y antisentido oligos primero fosforilados y recocidos según el paso 2.1.5. El primer paso a 37 ° C es importante para fosforilar los oligos con la cinasa T4 y subsiguientes ciclos PCR son importantes para recocido del sentido y oligonucleótidos anti-sentido en dsDNA. Es importante tener una proteína fluorescente en el vector de clonación sgRNA que es crucial para el seguimiento de células transduced sgRNA más adelante en el análisis de la competencia. sgRNA clonación es aumentada con el uso de 96 placa bien en todos los pasos incluyendo el recocido y la ligadura. Para la ligadura, tiras de microtubos PCR limpiamos también pueden ser utilizadas ya son compatibles con pipetas multicanales. En caso de que la transformación de una serie de clones sgRNA es necesario, una placa de 96 pocillos en que 10 μL de células competentes son pre-alícuotas en cada pozo y congelados a-80 ° C se pueden utilizar para agilizar todo el proceso. El propósito de las reacciones de ligadura de la galjanoplastia es escoger colonias individuales, que es difícil de realizar en el formato de 96 pozos. Por lo tanto, para la transformación bacteriana, hay una leve pérdida de escalabilidad. Sin embargo, incluso para la galjanoplastia de las reacciones de transformación de una placa de 96 pocillos toda, sólo requerirá un total de dieciséis placas de 6 pocillos de todo el proyecto. Uno tiene que tener cuidado en el siguiente paso de selección de colonias de las placas de la transformación. Mientras rayas una colonia en un lugar etiquetado, asegurar que el lugar está claramente aislado de los otros lugares. Marcar una cuadrícula en la parte inferior de la caja Petri con un oscuro marcador permanente ayuda a prevenir la contaminación cruzada de clones bacterianos.
Una vez listos el minipreps de sgRNA construcciones, el virus se puede hacer en el formato de 96 pozos. En este nivel de rendimiento, no es práctico filtrar 200 μL de virus que contiene el sobrenadante. Por lo tanto, el sobrenadante viral se debe congelar por lo menos durante la noche para evitar la contaminación cruzada de cualquier células 293T en el sobrenadante. También se puede almacenar en alícuotas de μl 50 en tubo estéril de PCR tiras para evitar congelación descongelación del sobrenadante. Además, estos sobrenadantes virus acondicionado se utilizan para la transducción de las células de la AML. En caso de que bajo los títulos de transducción viral se observa, según lo determinado por la baja frecuencia de BFP + ve células, entonces puede ser importante determinar el título viral y transducciones prueba en diferente multiplicidad de infecciones (MOI) para 40-60 por ciento tipos de transducción de señales. Determinación del título viral y MOI cálculo se describe en detalle aquí17. En el análisis de la competencia, como se describe en el paso 3 del Protocolo, es muy importante excluir las células no viables para evitar artefactos falsos de auto fluorescencia mientras analizando el BFP relación BFP no. En el momento de FACS, antes de analizar las muestras de prueba, el uso de BFP negativo y controles positivos BFP recomienda para ajustar con precisión las tensiones. En cada punto de tiempo re-galjanoplastia, el volumen de las células para ser re-plateado depende de la concentración de células en el momento dado. Nos suelen volver a habían plateado 20 μL de un total de 200 μL en cada momento en un pozo fresco con 180 μL de medio fresco. Mezcla completa de las células mediante pipeteo suavemente arriba y abajo justo antes de volver a la galjanoplastia es altamente recomendable. Por lo general, hemos observado que el ensayo debe realizarse durante 15-20 días para aviso fuerte cambios en la BFP + ve-ve ratios, aunque esto varía de un gen a gen.
Este montaje experimental es muy adecuado para probar varios genes en paralelo en múltiples líneas de células AML para identificar rápidamente la función de genes candidatos en la supervivencia o proliferación de las células de la AML. Una advertencia del ensayo de proliferación competitivo descrito aquí es que no considera factores potenciales células extrínsecas como paracrina eventos de señalización de células dirigida de genes que pueden influir en la población de células no dirigido en el mismo bien. Aunque esto puede ser una ocurrencia rara, este factor debe tenerse en cuenta al realizar este ensayo. Aunque hemos utilizado AML como ejemplo para los ensayos de competencia basado en el Cas9 CRISPR descritos en este manuscrito, este método puede utilizarse para cualquier línea celular de cáncer para identificar el papel de los genes múltiples en paralelo. Hay varias ventajas de canceladura del gene usar CRISPR Cas9 knockdown de genes mediante RNA de interferencia. En primer lugar, en contraste con shRNAs, que típicamente muestran una amplia gama de inhibición de ARNm blanco, sgRNAs juntados con la nucleasa Cas9 efectuar completa knockout de genes diana. Esto puede resultar en fenotipos más dramáticos y consistentes con el método basado en el Cas9 de CRISPR, aunque deben ser advertido que la eficiencia objetivo de sgRNAs individuales como shRNAs puede variar ampliamente.
El análisis de competencia basado en la citometría de flujo ofrece varias ventajas sobre ensayos de proliferación tradicional en el que un número fijo de células se platean para medir la relativa actividad proliferativa de células gene perturbado. Una ventaja es que la relativa actividad proliferativa de las células puede ser fácilmente y rápidamente medida por citometría de flujo por varios días, pasando por alto la necesidad de contar en cada paso de la galjanoplastia de la célula. Esto es útil cuando un gran número de sgRNAs candidato a varios genes, como contar todos los pozos de prueba es engorrosa y puede conducir a imprecisiones. A diferencia de, ensayos de medición de ATP para el crecimiento celular, citometría de flujo puede realizarse en una muestra de células vivas, lo que hace este método útil para el análisis a largo plazo. Esto es especialmente beneficioso en el estudio de factores como epigenéticos moduladores, que pueden mostrar efectos finales de acción sobre la proliferación de las células AML y pueden requerir ensayos a largo plazo. En segundo lugar, la presencia de células transduced no dentro del mismo también permite una población celular bien controlada que puede utilizarse para establecer la línea base para el análisis. En tercer lugar, cuando la instalación en formato de 96 pocillos, el ensayo puede realizarse casi por completo utilizando pipetas de varios canales, substancialmente acelerar todo el proceso de clonación de sgRNAs preparación de virus y finalmente evaluación de citometría de flujo de fluorescencia.
El método descrito aquí puede ser eficientemente escalado-para arriba para la investigación de hasta 96 sgRNAs en paralelo en una pantalla de matriz. Suponiendo que sgRNAs 4 – 6 por gen, este método puede por tanto utilizarse para el interrogatorio rápido de al menos 16 – 24 genes en paralelo. En caso de mayor número de genes, como un todo camino molecular que necesita para ser interrogado en las células de la AML, agrupados CRISPR Cas9 basado en pantallas será más útiles.
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Disclosures
A.J.D es consultora de productos farmacéuticos A2A (Nueva Jersey) y terapéutica Salgomed (San Diego). Otros autores no tienen ninguna conflictos para declarar.
Acknowledgments
El plásmido pCW Cas9 fue un regalo de Eric Lander & David Sabatini (plásmido Addgene # 50661) y pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plásmido W del laboratorio Yusa (plásmido Addgene #67974. Nos gustaría agradecer al núcleo de la citometría de flujo en Pas Medical Discovery Institute por oportuna ayuda con análisis de flujo y clasificación. Nos gustaría agradecer el apoyo de la Fundación Señora Tata Memorial a A.D. Nos gustaría también agradecer el apoyo de las siguientes fuentes de financiamientos: NIH/NCI P30 CA030199 cáncer centro patrocinado por donación, la Fundación de la V y los centros de cáncer del NCI de San Diego (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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