Summary
Dette manuskriptet beskriver en gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar (CRISPR) CRISPR-Cas9-basert metode for enkel og rask undersøkelse av rollen som flere kandidat gener i akutt myelogen leukemi AML celle spredning i parallell. Denne teknikken er skalerbar og kan brukes i andre kreftcelle linjer også.
Abstract
Gene forstyrrelsene studier har blitt brukt å undersøke rollen av enkelte gener i AML patogenesen. For å oppnå fullstendig genet avbrudd, mange av disse studiene har gjort bruk av komplekse genetiske knockout modeller. Disse studiene med knockout mus tilbyr et elegant og velprøvde system for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner, en rask og skalerbar metode for å vurdere kandidat gener som spiller en rolle i AML celle spredning eller overlevelse i AML modeller hjelpe akselerere parallelle avhør av flere kandidat gener. Nylige fremskritt innen genomet-redigering teknologiene har dramatisk forbedret vår evne til å utføre genetiske forstyrrelser i et enestående omfang. Et slikt system genomet redigering er CRISPR-Cas9-baserte metoden som kan brukes til å gjøre rask og effektiv endringer i målet cellen genomet. Den enkle og skalerbarheten til CRISPR/Cas9-mediert genet sletting gjør det en av de mest attraktive teknikkene for avhør av et stort antall gener i fenotypiske analyser. Her presenterer vi en enkel analysen bruker CRISPR/Cas9 mediert gen-avbrudd kombinert med høy gjennomstrømming flyt-cytometri-baserte konkurranse analyser for å undersøke rollen av gener som kan spille en viktig rolle for utbredelsen eller overlevelsen av menneskelige og murine AML linjer.
Introduction
De siste tiårene har sett mange forskningsinnsats fokusert på å identifisere bidrag fra viktige molekylær stier i akutt myelogen leukemi (AML) patogenesen. Tradisjonelt, er Gen-avbrudd i AML celler utført ved hjelp av betinget knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Knockout mus tilbyr et sofistikert system for spatio-temporale kontroll av genet sletting, er genererer genet knockout mus arbeidskrevende, tidkrevende og kostbar. Videre gen-fortrenging rekombinasjon strategier er ikke lett skalerbar; disse strategiene egner ikke seg godt til avhør av flere gener parallelt. Etter oppdagelsen av RNA forstyrrelser metoder for å slå ned endogene mRNAs lite forstyrrende RNA (siRNA) eller shRNA, begynte mange grupper med RNA forstyrrelser teknikker for å undersøke hvilken rolle bestemte gener i AML. Siden både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskelig å transfect med tradisjonelle lipid-baserte transfection metoder, de fleste studier ansatt lentivirally eller retrovirally-kodede shRNA for å studere gen funksjon i AML celler. Den nylige oppdagelsen av gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og de tilhørende Cas-nucleases (CRISPR-Cas9) har revolusjonert genet målretting teknologier1,2,3. Bruker CRISPR-Cas9, kan bestemte gener og genomisk regioner slettes, redigert eller merket med effektivitet og brukervennlighet. CRISPR-Cas9-baserte gen-redigering fremstår nå som metoden for valg for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner i ulike celletyper enkelhet, effektivitet og bred anvendelse av denne teknikken. CRISPR-Cas9-baserte metoder er også blitt metoden for valg i AML, ikke bare for avhør enkelte gener, men også som en måte å målrette flere gener i plassert eller gruppert genetisk skjermer å undersøke flere gener parallelt som mulig AML-avhengigheter4,5,6.
I dette manuskriptet beskriver vi en enkel konkurransedyktig vekst analysen for å måle virkningen av gen-avbrudd på veksten av AML celler, basert på stabil CRISPR-Cas9-mediert gen-redigering etterfulgt av høy gjennomstrømming flowcytometri. Denne metoden er enkel, effektiv og skalerbar til medium gjennomstrømming eksperimenter for å undersøke rollen av flere gener parallelt i AML celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generere AML cellen linje kloner med høy uttrykk for stabil og aktiv Cas9
- Produksjon av Cas9 lentivirus
- Dag 0: Plate 4 x 106 293T celler i 10 mL av DMEM med 10% fosterets bovin serum (FBS) og penicillin og L-glutamin i 10 cm vev kultur parabol i en biosafety nivå 2 (BSL2) sertifisert celle kultur hette. Plass rett i en 37 ° C inkubator.
- Dag 1: Belagt 293T cellene skal 70 – 80% confluent på dag 1. Utføre hva bruker følgende protokollen på ettermiddagen.
- Varm transfection medium, kultur medier og hva reagens til romtemperatur. Tine alle nødvendige plasmider for hva.
- Mix 9 µg psPAX2, 0.9 µg av pMD2.G og 9 µg av pLenti-Cas9 plasmider med 500 µL av hva medium i en 5 mL tube.
- Legge til 1,7 mL transfection medium i en 14 mL rundt bunnen rør. Legge til 57 µL av transfection reagensen direkte til transfection medium i røret å unngå å berøre veggen av røret.
- Forsiktig legge hele plasmider blandingen til transfection reagens løsning og bland ved å trykke forsiktig røret på siden. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 20-30 min. I mellomtiden, endre mediet fra seeded 293T platen.
- Legg transfection mix dropwise til platen og forsiktig rock platen sidelengs for effektiv blanding. Plass platen i en 37 ° C inkubator.
- Dag 2: Sug opp nedbryting fra hva platen forsiktig slik at cellene ikke forstyrret eller forskyves fra platen. Kast nedbryting. Legge til 10 mL av fersk 10% DMEM medium ved å skyve ned forsiktig fra sidene av platen å unngå dislodging cellene.
- Dag 3: Samle viruset som inneholder nedbryting fra hva platen langsomt ved å tegne det 10 cm sterile sprøyter til. Etter nedbryting samles i sprøyten, knytte et sterilt 0,45 µM filter til sprøyten og holder sprøyten og filter over en frisk og sterile 15 mL polypropylen konisk rør. Forsiktig kaste sprøyten for viruset som inneholder nedbryting gjennom 0,45 µM filteret i 15 mL polypropylen konisk røret.
- Lagre viral betinget mediet i dele 2 mL hver i 2 mL cryovials på-80 ° C.
- Signaltransduksjon AML cellen linjer
- Dag -1: Fortynne 1 mg/mL rekombinant menneskelige fibronectin fragment lager til 10 µg/mL med sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS). Lag en vev kultur behandlet 6 godt plate med 2 mL 10 µg/mL rekombinant menneskelige fibronectin fragment fungerende løsning på BSL2 godkjent celle kultur hette. Pakk platen i klynge vikle å unngå tap på fordampning og store i romtemperatur over natten.
- Dag 0: Tine viral nedbryting som inneholder Cas9. Sug opp rekombinant menneskelige fibronectin fragment oppløsningen helt fra belagt tallerken like før spinfection. Legg 2 mL viral betinget medium med Cas9 til platen og spinn på 1300 x g for 90 min på 35 ° C. Dette hjelper de virus partiklene knytte til spinfected godt.
- I mellomtiden telle celler å være transduced og rotere ned 2 x 106 celler i et 15 mL polypropylen konisk rør. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 2 mL frisk kultur medier.
- Etter spinfection, Fjern alle viral nedbryting fra spinfected vel og kast. Retroviral partikler fra nedbryting knyttes til bunnen av spinfected godt. Dette godt, Legg 2 x 106 celler resuspended i 2 mL av medium fra steg over.
- Spinne platen igjen ved 1300 x g kort tid (1-2 min) tilstrekkelig til at cellene å slå seg ned på bunnen. Plasser platen tilbake i inkubator og la stå over natten i signaltransduksjon med spinfected virus partikler knyttet til brønnen.
- Dag 1: Avhengig av cellen tetthet, legge til flere medium transduced cellene å unngå overvekst.
- Dag 2: Siden pLenti-Cas9-plasmider har en Blasticidin motstand markør, legge til Blasticidin på en 10 µg/mL dose transduced og untransduced (kontroll) MOLM13 eller musen MLL-AF9 leukemi celler for valg av Cas9 uttrykke celler.
Merk: Blasticidin utvalg av Cas9-transduced MOLM13 eller MLL-AF9 leukemi cellene blir ansett som fullstendig når alle untransduced kontroll cellene har blitt eliminert. For linjer enn MOLM13 og MLL-AF9 leukemi, må en dose respons kurve utføres før dette eksperimentet slik at en optimal dose kan være ansatt. Titrering viral nedbryting av kan også utføres ved lav-signaltransduksjon priser.
- Klone utvalg av høy-Cas9 uttrykke celler.
Merk: Vi har lagt merke til at i noen AML cellelinjer, klone utvalg ikke kan være nødvendig: bulk Cas9-Blasticidin valgt befolkningen allerede har høy genomet-redigering effektivitet. I dette tilfellet er det mulig å hoppe over trinn 1.3 og gå videre til trinn 1.4 å vurdere Cas9 uttrykk i bulk Cas9-blasticidin AML cellene av vestlige blotting. Det vil fortsatt være viktig å vurdere gen-redigering effektivitet i bulk Cas9-AML cellene (trinn 1.5) før du fortsetter til konkurransen analyser. Vi anta at utvalget av enkle high-Cas9 kloner reduserer genomet-redigering variasjon, som er spesielt viktig når testing en rekke forskjellige enkelt guide RNAs (sgRNAs).- Utføre en enkeltcelle slags Cas9-Blasticidin valgt MOLM13 og MLL-AF9 leukemi celler heretter kalt MOLM13-Cas9 og MLL-AF9-Cas9 celler, henholdsvis med FACS sortering i BSL2 godkjent hette. Sortering kan utføres i 5-10 runde vev kultur behandlet 96 godt bunnplater.
- En gang single MOLM13-Cas9 og MLL-AF9-Cas9 kloner er plukket og individuelt benevnt, utvide 10-20 kloner med 10 µg/mL av Blasticidin i kultur medier å sikre opprettholdelse av Cas9 uttrykk.
- Uttrykket se stabil Cas9 protein ved immunoblotting.
- Gjør kjernefysisk trekker ut alle Blasticidin valgt kloner av MOLM13 og MLL-AF9 leukemi bruke kjernefysiske utvinning Kit som produsentens protokollen. Sjekk Cas9 protein uttrykk bruker anti-flagg M2 antistoff siden Cas9 i pLenti-Cas9-plasmider er knyttet til en N-terminal flagg epitope.
- Laste 50 µg totale protein fra hver kjernefysiske pakke på 10% Bis-Tris gel og kjøre gel på 120 V til øvre band skilles godt.
- Blokkere membranen med 5% melk løsning TBST buffer 1t.
- Inkuber membranen med 1:1,000 fortynning av anti-flagg M2 antistoff i en siste konsentrasjon av 1 µg/mL på 4 ° C over natten.
- Neste dag, vask membranen med TBST buffer og ruge med HRP konjugert anti-musen sekundære antistoff på en fortynning av 1:5,000 (siste konsentrasjon av 0,16 µg/mL) ved romtemperatur 1t.
- Vask membranen grundig med TBST og utvikle blot bruke ECL substrat.
- Velg 3-4 kloner med det høyeste protein uttrykket for Cas9 sett av vestlige blotting for ytterligere funksjonsanalyse (figur 1).
- Sikre høy Cas9 aktivitet i valgte kloner
- Forberede lentiviral nedbryting fra en sgRNA koding vektor med sgRNAs målretting menneskelige eller mus AAVS1 trygg-havn locus som beskrevet i trinn 1.1.
- Transduce de Cas9-uttrykke MOLM13 eller MLL-AF9 leukemi kloner med anti-AAVS1 sgRNA lentiviral nedbryting bruker spinfection metoden beskrevet ovenfor. Velg med 2,5 µg/mL Puromycin for 4 dager.
- Rense genomisk DNA fra MOLM13-Cas9 eller MLL-AF9-Cas9 leukemi kloner etter Puromycin utvalg med respektive vill-type kontroller ved hjelp av genomisk DNA utvinning kit henhold til produsentens instruksjoner. Bruk 50 ng av DNA som en mal til å utføre en PCR med AAVS1_test_primers bruker 2 x master blanding av Taq utvalg og programmet PCR oppført i tabell 1.
- Kjøre PCR produktet på en 2% agarose gel og gel-rense 268 base par bandet bruker en gel utvinning kit som produsentens protokollen. Sanger sekvens gel renset PCR produktet bruker AAVS1_target-frag_F primer.
- Vurdere redigering effektiviteten av sammenligning av AAVS1 endret og wildtype sekvenser ved hjelp av online web-basert verktøy (figur 2).
2. kloning og Albin på sgRNAs i AML-Cas9 celler
-
Medium gjennomstrømming kloning av sgRNAs
- Utforme 4-6 sgRNAs for genet av interesse ved hjelp av en web-basert CRISPR programvare. Det finnes en rekke CRISPR verktøy online som http://crispr.mit.edu/ som genererer sgRNA sekvenser basert på en inngang DNA sekvens.
- Fyll ut en passende informasjon i feltene med stjerner. Klikk på målet genomet for sgRNA design. Lim inn målet sekvensen i rekkefølge -boksen og klikk på Send -knappen.
- For kloning i pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA uttrykk plasmider, før før nukleotider "CACC" følelse oligo og "AAAC" til den omvendte complemented antisense oligo før du bestiller. Bestill Forhåndsblandet følelse og anti-følelse oligos i en 96-brønns plate merket Oligo-Mix fra en oligonucleotide syntese company.
Merk: Vi har gjort bruk av pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmider, som har BbsI begrensning området for sgRNA kloning. I tilfelle andre sgRNA uttrykk plasmider brukes, må overheng brukes for sgRNA oligonucleotides endres tilsvarende. - Ta en separat U bunnen 96-brønns plate merket Annealing Plate. Gjøre en master blanding av 1 µL T4 PNK, 1 µL av 10 x T4 DNA ligation buffer og 6 µL vann per annealing reaksjon.
- Legge til 8 µL av master mix hver brønn av annealing plate. Legg 1 µL av 100 µM, følelse og antisense oligo (eller 2 µL av blandet følelse-anti-sense oligos) til master mix. Pipetter 2 – 3 ganger forsiktig for å blande godt, spin platen kort for å få mikser til bunnen av brønner.
- Bruk følgende annealing programmet på en PCR maskin: 30 min ved 37 ° C, 2 min 30 s på 95 ° C etterfulgt av langsom avkjøling 22 ° c ved hastighet på 0,1 ° C/s. Etter annealing, ta en fersk 96-brønns plate merket Fortynnet OligoMix. I denne platen, fortynne den fosforylert og glødet oligos over reaksjonen med vann (1:200) bruker en flerkanals pipette.
- Digest 5 µg av pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektor med 1,5 µL av BbsI begrensning enzym (10.000 enheter/mL) bruker en passende buffer på 37 ° C for 2t å linearize det for hemorroider senere.
- Ta en fersk 96 godt plate merket Ligatur Plate og legge til 20 ng av BbsI fordøyd pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektor til en brønn per ønsket sgRNA hemorroider. Dette legger til 2 µL av fosforylert, glødet oligos fra Fortynnet OligoMix platen.
- Legg 1 µL av 10 x T4 ligase buffer og 1 µL av T4 DNA Ligase enzym. Forsiktig Pipetter med en flerkanals pipette og ruge ligation blandingen ved romtemperatur for 2T.
Merk: Hemorroider mikser kan lagres på 20 ° C for transformasjon trinn senere. - I mellomtiden tine 90 µL av kjemisk kompetent E. coli celler på is 10 min før slutten av hemorroider trinnet.
- Bruke en flerkanals pipette, lage 10 µL dele kompetent cellene i hver brønn av en separat 96 godt plate.
- Legg ligation blandingen fra trinn 2.1.8 i den godt som inneholder kompetente cellene, pipette opp og ned forsiktig og ruge i 10 min ved romtemperatur.
- Pipetter 5 µL av bakterier-DNA miksen direkte over reaksjonen til en 6 vel plate som inneholder LB-agar med 100 µg/mL Ampicillin. Gjenta for hver av transformasjon reaksjoner.
- Plate hver transformasjon reaksjon i en separat merket godt av en 6-vel plate. Legge til ca 5-8 glassperler hver godt og riste hele 6-vel platen 8-10 ganger i en sirkelbevegelse.
- Velg 1 – 2 enkelt kolonier i hver brønn med sterilt 20 µL pipette tips og strek det inn nøye merket plass på et sterilt 10 cm Petriskål LB agar og 100 mg/mL Ampicillin. Etter striper inn i LB plate, bare kaste ut spissen brukt klone striper i 3 mL LB-Ampicillin inneholder medium i en 14 mL rundt bunnen tube merket med tilsvarende bakteriell klone nummer.
- Sende bakteriell platen direkte for Sanger sekvensering med menneskelige U6 promoter frem primer.
- Etter rekkefølge bekreftelse av Klon sgRNAs, rense DNA fra tilsvarende 14 mL røret ved hjelp av en mini prep kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Mål konsentrasjonen og kvaliteten av mini-forutbetalt med et spektrofotometer. Normalisere hver mini prep til en konsentrasjon av 15 ng/µL og Pipetter i en 96 godt plate merket sgRNA kloner Plate.
Merk: Denne platen kan lagres på 20 ° C eller brukes direkte for virus forberedelse.
- Utforme 4-6 sgRNAs for genet av interesse ved hjelp av en web-basert CRISPR programvare. Det finnes en rekke CRISPR verktøy online som http://crispr.mit.edu/ som genererer sgRNA sekvenser basert på en inngang DNA sekvens.
-
Viral produksjon av sgRNA konstruksjoner og signaltransduksjon
- For produksjon av sgRNA lentiviral partikler i 96-brønnen format, følger det "shRNA/sgRNA/ORF høy gjennomstrømning Viral produksjon (96 godt)" protokollen fra genetisk forstyrrelsene plattformen (GPP web Portal) av bred Institute (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/PROTOCOLS).
- Overføre 200 µL av viral nedbryting til sterilt rør og fryse-80 ° c umiddelbart.
- Dag -1: Coat en flat bunn Non-vev kultur behandlet 96 godt plate med 100 µL av rekombinant menneskelige fibronectin fragment i en konsentrasjon av 10 µg/mL i BSL2 celle kultur hette. Pakk platen med klynge vikle å unngå fordamping tap og la den på benken over natten.
- Dag 0: Fjern fragmentet rekombinant menneskelige fibronectin i hver brønn. Tine viral nedbryting av hver sgRNA ved romtemperatur. Legge til 50 µL av viral nedbryting fra hver rør til hver belagt godt av signaltransduksjon plate. Spin signaltransduksjon platen 1300 x g for 90 min på 35 ° C.
- Mot slutten av spinfection, Tell MOLM13-Cas9 (klone B3) celler fra kultur kolbe. Bruke 10 000 celler per brønn i 100 µL volum. Telle celler for alle signaltransduksjon brønnene, hensyntatt døde volum.
- Etter 90 min spinfection, fjerne nedbryting fra alle brønnene bruker en flerkanals pipette justert til 50 µL langsomt ved å vippe platen. Legge til 100 µL av kulturen i MOLM13-Cas9 klone B3 celler hver godt sakte glir ned fra kanten.
- Spinne platen 1300 x g i 2 minutter på 35 ° C la cellene bosette til bunnen. Overføre platen til 37 ° C vev kultur klasse inkubator.
- Dag 1: Legge til 100 µL av fersk middels til hver godt med sgRNA transduced Cas9-MOLM13 eller Cas9-MLL-AF9 leukemi celler slik at det endelige middels volumet 200 µL.
3. konkurransedyktige vekst analysen
- Dag 3: 72 h (dag 3) post signaltransduksjon, se sgRNA som inneholder for positiv celler i hver brønn ved flowcytometri (FACS). Bruk en celle levedyktighet fargestoff å merke og utelate døde celler fra analysen.
- Fortsette re plating en andel av cellene i nye brønner med fersk medium etter hver FACS analyse å unngå overvekst under analysen.
-
Gjenta FACS analysen hver 2-3 dager for å sjekke den relative andelen for positive (for + ve) celler sammenlignet for negative (for-ve) kolleger (Figur 3). Analysere andelen for positiv celler for hvert punkt (bruk FlowJo eller lignende FACS analyseprogramvare).
- Dra Fcs filene for hver prøve FlowJo programvare. Dobbeltklikk på noen en eksempelfil og tegne en prikk klatt av fremover xy (FSC) vs Side punktdiagram (SSC) med FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen. Gate alle cellene.
- Dobbeltklikk på gated cellene og tegne dem på levedyktighet flekk (på Y-aksen) g. FSC høyden (H) eller området (A) dot blot. Gate levedyktigheten flekken negativ (live) celler.
- Dobbeltklikk på gated lever celler og tegn for (på Y-aksen) vs FSC (A) på X-aksen. Porten for + ve celler. Bruke alle disse portene på alle prøvene ved å dra det merkede utvalget til Alle prøvene under fanen .
- Klikk på Redigeringsprogrammet for å gjøre en analyse tabell med alle prøvene. Dra for + ve teller fra ett utvalg i tabellen og klikker på Vis. i Redigeringsprogrammet for å opprette en satsvis rapport av alle prøvene med en tabell som viser prosentandelen av for + ve celler . Lagre tabellen som en xls.
- Beregne proporsjonale økning eller nedgang i % for positiv celler i levende celle befolkningen over tid og sammenligne dette forholdet til forholdet mellom for positiv celler i kontrollen sgRNAs (som luciferase, forvrengt eller GFP sgRNA).
- Tegne forholdet mellom for positiv celler for de ulike sgRNAs inkludert gene(s) interesse i tillegg til kontroller som bruker dag 3 som grunnlinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår studie transduced vi først MOLM13 menneskelige AML celle linjen som bærer MLL-AF9 translokasjon med høy-titer virus koding Cas9-blasticidin lentiviral plasmider. I våre hender beskrevet bulk usortert MOLM13-Cas9-celler ikke vise høyt nivå Cas9 uttrykk av vestlige blotting og også utførte ikke bra når assayed for effektiv genet redigering-ved hjelp av metoden tidligere7. Derfor fortsatte vi å etablere enkeltcelle kloner og bare velge clones med høye nivåer av Cas9 sett av vestlige blotting (figur 1). Vi plukket 2 forskjellige kloner og transduced dem med sgRNAs rettet mot et område i AAVS1 trygg-havn locus som beskrevet tidligere7. Bruke genomisk DNA utvunnet fra Puromycin-merket MOLM13-Cas9-AAVS1-sgRNA kloner, vi utført en PCR bruker primere spenner over AAVS1 sgRNA kuttet nettstedet og sanger sekvensielt et bestemt 268 bp PCR produkt fra 10 isolerte koloniene for hver MOLM13 klone. Etter justering med foreldrekontroll sekvensen fant vi at MOLM13-Cas9 klone B3 og MLL-AF9-Cas9 klone 8 hadde en virkningsgrad på 100% (data ikke vist). Vi valgte deretter disse Klonene viser høy Cas9-mediert genomet-redigering evne for vår sgRNA konkurranse analyser. Mens disse studiene ble utført, ble nettbaserte verktøy for å raskt teste genomet-redigering effektivitet fra Sanger sekvenser utviklet av ulike grupper som TIDEVANNET8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) eller is (https://ice.synthego.com/#/). Disse verktøyene gjør det svært enkelt og kostnadseffektivt å vurdere genomet-redigering effektivitet uten å klone enkelte fragmenter og utføre sekvensering av flere kloner. Derfor bør bulk Cas9-uttrykke celler først testes for genomet redigering effektivitet ved hjelp av disse metodene. I tilfelle genomet-redigering effektiviteten er høy, er så encellede kloning ikke nødvendig. Også i tilfelle at enkeltcelle kloning er nødvendig som i våre studier, tilbyr verktøyene webbaserte mutational frekvens estimering en mye raskere metode for å teste flere kloner parallelt.
For sgRNA kloning, vi gjort bruk av sgRNA kloning plasmider pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, som en blå fluorescerende protein (for) for sporing sgRNA transduced celler og en RNA Polymerase III-drevet menneskelige U6 selskapet som driver uttrykk for det klonede sgRNAs sammen med tracer RNA (tracRNA) stillaset. Vi brukte dette systemet for å klone 2 sgRNAs rettet mot DOT1L, et protein som er kjent for å spille en viktig rolle i epigenetic regulering av genuttrykk. DOT1L er en histone methyltransferase som setter mono, di og tri-metylering på målet gener9,10. Studier har vist at DOT1L spiller en viktig rolle i AML drevet av MLL-fusion oncogenes. Derfor er DOT1L knockout med CRISPR-Cas9 ventet å føre til betydelig svekke musen MLL-AF9 leukemi celle spredning i tråd med tidligere studier11,12,13,14. Vi brukte to sgRNAs målretting AAVS1 trygg havn locus, som i intron av PPP1R12C genet. sgRNAs produsere genomisk endringer i dette området sannsynligvis ikke vil ha noen effekt på proliferativ kapasitet MLL-leukemi linjer. Som en positiv klonet vi sgRNAs målretting DNA replikering-assosiert genet RPA3. RPA3 er et pan-essensielle gen som har vist seg å være viktig for spredning av flere AML cellen linjer4,15,16 . Anti-RPA3 sgRNAs derfor vise sterke anti-proliferativ effekter i AML celler og brukes vanligvis som en positiv. Etter signaltransduksjon med anti-AAVS1 og anti-RPA3 sgRNA plasmider, vi målte den relative andelen for + ve sgRNA transduced celler i forhold til papirformat for ve hver 2-3 dager i kultur (Figur 3). Med protokollen beskrevet ovenfor, resulterte Albin på MOLM13 eller MLL-AF9 AML i en 60-70% signaltransduksjon effektivitet med forberedelsene viral, forlater de gjenværende 30 – 40% cellene untransduced eller for-ve i hver brønn. Dette muliggjør studiet av relativ spredning av genomet-redigert celler med vill-type celler i samme godt. Proporsjonal forhøye eller nedgang i andelen sgRNA transduced celler ble brukt som et mål å reflektere funksjonelle effekten av sgRNA mediert genet sletting i MOLM13-Cas9-celler. Hvis din genet av interesse er viktig for spredning av testen AML celler, så fører sgRNA-mediert avbrudd i dette genet til relativ reduksjon av sgRNA-uttrykke for + ve celler i forhold til for-ve cellene i løpet av analysen, mens sgRNAs rettet mot luciferase, GFP eller uvesentlig gener vil beholde for + ve/ve forholdet over tid.
Bruker 2 separate anti-RPA3 sgRNAs, observerte vi en progressiv og betydelig nedgang i andelen for + ve celler sammenlignet med for-ve untransduced kolleger. I kontrast, forble prosentandelen av anti-AAVS1 sgRNA uttrykke for celler relativt konstant over tid, viser at AAVS1 målretting har ingen innvirkning på spredning av MOLM13 celler (figur 4a). Tilsvarende i musen MLL-AF9-Cas9 cellene testet vi effekten av sgRNAs målretting Rhodopsin (Rho1), pigmentering øye genet som negativ kontroll og Dot1l, en epigenetic regulator kreves for spredning av MLL-AF9 leukemi celler over tid . I denne studien, for + ve musen MLL-AF9-Cas9 celler transduced med 2 separate anti-DOT1L sgRNAs viste en dramatisk og progressiv tap over tid i forhold til for-ve sgRNA ikke-transduced celler (figur 4b). I kontrast, forble forholdet mellom anti-Rho1 sgRNA relativt uendret over tid. Disse resultatene viser sårbarheten i MLL-AF9 uttrykke musen leukemi celler til Dot1l utarming, bekrefter tidligere publiserte resultatene.
Figur 1: representant Western blot resultater viser ulike Cas9 nivåer. Enkelt celle kloner av MOLM13 AML celle linjen transduced med CAS9 ble undersøkt for flagg-Cas9 uttrykk nivåer med anti-flagg antistoffer. Kloner viser det høyeste uttrykket for Cas9 ble valgt for videre studier. HEK293-T celler transfekterte med en Cas9 uttrykk plasmider ble brukt som en positiv kontroll og Cas9 ikke transduced MOLM13 celler som negative kontroller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant analyse av genomet redigering på Dot1l locus vurdert av ICE analyse. En PCR amplicon sentrert rundt Dot1l sgRNA målområdet var Sanger sekvensert og analysert ICE analyse. En sammenligning av sgDot1l sekvensen (oransje linje) til ikke-målrettede DNA sekvens (grønn linje) viser høy redigering effektivitet i sgDot1l målrettet cellene rundt sgRNA målområdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk arbeidsflyten av foreslåtte metoder. sgRNAs er klonet i sgRNA uttrykk vektor co uttrykke et fluorescerende protein som for. Målcellene er transduced på 30-60% signaltransduksjon priser og etterfulgt av flowcytometri hver 2-3 dager. sgRNAs rettet mot gener kreves for AML celle spredning viser relativ uttømming over tid som vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultater fra konkurransen analyser i menneskelig og mus AML celler. (en) resultatene viser en statistisk svært betydelig progressiv nedgang i RPA3 transduced MOLM13-Cas9 klone B3 celler. Derimot har sgRNAs målretting området AAVS1 ingen virkning. (b) sgRNAs målretting Dot1l viser en bemerkelsesverdig og progressiv nedgang i konkurransedyktig spredning, i motsetning til sgRNAs rettet mot Rhodopsin (Rho). p > 0,05. p < 0,05. Feilfelt representerer standardavvik betyr (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: generell oversikt over protokollen. (en) tid for hvert trinn i produksjonen av Cas9 virus og sgRNA kloning beskrevet. Design og kloning av sgRNAs kan utføres under generering enkelt kloner av AML cellelinjer stabil Cas9-uttrykk. (b) generelle protokollen for signaltransduksjon AML cellen linjer med sgRNAs og konkurransedyktig vekst analysen bruker FACS vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sykluser | Varigheten av syklusen | Temperatur |
| 1 | 2 min | 95 ºC |
| 35 | 30 s | 95 ºC |
| 30 s | 55 ºC | |
| 30 s | 72 º C | |
| 1 | 5 min | 72 º C |
| Hold | uendelig | 4 ºC |
Tabell 1: PCR programmet for AAVS1 locus forsterkning fra Genomic DNA. PCR programmet brukes for forsterkningen på AAVS1 locus fra genomisk DNA for testing kutte effektivitet av Cas9 i Cas9 uttrykker kloner.
Supplerende filen: sgRNA oligo sekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskrive vi en detaljert protokoll for å gjennomføre en CRISPR-Cas9-baserte konkurransedyktig vekst analysen for å undersøke rollen kandidat gener i AML cellelinjer bruke flowcytometri i menneskelige/murint AML celler (figur 5). Målet med analysen er å identifisere effekten av genet sletting på vedlikehold i AML celle spredning over to til tre uker i medium gjennomstrømming skala. Noen kritiske trinn må følges nøye for å lette skalere opp beskrevet protokollen. Produksjon av Cas9 lentivirus er det nødvendig å filtrere virus betinget mediet gjennom et 0,45 µM-filter for å unngå carryover 293T celler for viruset som inneholder nedbryting. Under spinfection, innpakning spinfection platen med klynge vikle eller parafilm bidrar til å unngå potensielle forurensning under sentrifugering. Sjalet bør imidlertid fjernes før du plasserer spinfected platen tilbake i vev kultur inkubator. Det er svært viktig å vurdere Cas9-uttrykke kloner for redigering effektivitet. Kloner med lav-genome redigering effektivitet reflekterer utilstrekkelig Cas9 aktivitet og kan påvirke suksessraten av eksperimentet. I vårt forsøk, vi først transduced menneskelige AML Cas9 kloner med sgRNAs målretting AAVS1 locus og sekvensert deres genomisk DNAs for redigering effektivitet. Sammenligning av AAVS1 endret og wildtype sekvenser kan vurderes med online web-basert verktøy som TIDEVANNET8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) eller is (https://ice.synthego.com/#/). Disse programmene sammenligne Sanger sekvens spor av potensielt redigerte PCR fragment til uredigerte wildtype eller referanse sekvensen og beregne frekvensen av endringer. Dette er en rask måte å vurdere mutational endringer forårsaket av test-sgRNA som kan måles i cellular Cas9 aktivitet. Alternativt, kloning av PCR produkt i et PCR-kloning plasmider som TOPO sløv kloning vektor kan utføres, etterfulgt av Sanger sekvensering av personlige kolonier å vurdere genomet-redigering effektiviteten av sekvens justering av hver klone til den vill-type. Vi foretrekker tidligere metoden, gitt dens lette og kostnadseffektivitet sammenlignet med metoden kloning. Vanligvis oppdagelsen av base par endringer som punkt mutasjoner, indeler, osv., på eller rundt sgRNA kutte området i et stort flertall av sekvensert kloner indikere tilstedeværelse av en svært aktiv Cas9. Derfor valgte vi MOLM13 eller MLL-AF9 leukemi kloner B3 og 8, henholdsvis med høyeste redigering effektivitet for videre studier.
Vi har utformet sgRNAs målretting ulike gener nevnt i protokollen bruker http://crispr.mit.edu/, en web-basert programvare som gir en liste over sgRNAs. Det anbefales å velge topp-scoring sgRNAs fra listen for å eliminere de med forutsigelige off-målet. Designet sgRNAs kan klones ved hjelp av en av publiserte protokoller som den på (http://www.addgene.org/67974/) nettsted. Fornuft og antisense oligos er første fosforylert og herdet som trinn 2.1.5. Det første skrittet på 37 ° C er viktig for phosphorylating oligos med T4 kinase påfølgende PCR sykluser er viktig for avspenning følelse og anti-følelse oligonucleotides i dsDNA. Det er viktig å ha et fluorescerende protein i sgRNA kloning vektoren som er avgjørende for sporing sgRNA transduced celler senere i konkurransen analyser. sgRNA Klon er skalert opp med bruk av 96 godt plate på alle trinnene inkludert avspenning og ligatur. For hemorroider, kan også ren PCR microtube strimler brukes siden de er kompatible med flerkanals pipetter. I tilfelle at transformasjonen av et større sett med sgRNA kloner er nødvendig, en 96-brønns plate i som 10 μL kompetent cellene er pre-aliquoted i hver brønn og frosne-80 ° c kan brukes å fremskynde hele prosessen. Formålet med plating ligation reaksjonene er å plukke personlige kolonier, som er vanskelige å utføre i 96-brønnen format. Derfor for bakteriell transformasjon er det litt i skalerbarhet. Likevel, selv for at belegget av transformasjon reaksjoner fra en hel 96-brønns tallerken, det bare krever totalt seksten 6-vel plater for hele prosjektet. Man må være forsiktig i neste trinn av plukke kolonier fra transformasjon platene. Mens striper en koloni på et merket sted, sikre at stedet er klart isolert fra de andre stedene. Merke et kvadratisk rutenett nederst Petriskål med en mørk permanent markør bidrar til å forhindre kryss-kontaminering av bakteriell kloner.
Når minipreps av sgRNA konstruerer er klar, kan viruset gjøres i 96-brønnen format. På dette nivået av ytelse er det upraktisk å filtrere 200 µL av virus som inneholder nedbryting. Viral nedbryting bør derfor fryses minst over natten for å unngå kryss-kontaminering fra 293T celler overført til nedbryting. Det kan også lagres i 50 µL dele i sterilt PCR tube strimler å unngå fryse tiner nedbryting. Videre brukes disse virus betinget supernatants for transducing AML celler. I tilfelle at lav titers av viral signaltransduksjon er observert, som vurdert av lav frekvens for + ve celler, så kan det være viktig å finne viral titer og teste transductions på ulike mangfold av infeksjoner (MOI) å sikre 40-60 prosent signaltransduksjon priser. Viral titer besluttsomhet og MOI beregningen er beskrevet i detalj her17. I konkurranse analysen, som beskrevet i trinn 3 av protokollen, er det svært viktig å ekskludere ikke-levedyktige celler for å hindre falske gjenstander fra auto-fluorescens under analysen for ikke-for-forhold. Ved FACS, før analysere testprøvene, anbefales bruk av for negative og for positiv kontroller nøyaktig angi spenninger. På hvert nytt plating punkt avhenger volumet av cellene skal re belagt av konsentrasjonen av celler på det gitte tidspunktet. Vi vanligvis belagt re 20 μL fra totalt 200 μL på hvert tidspunkt i en fersk godt med 180 μL frisk medium. Grundig blande cellene av pipettering forsiktig opp og ned like før re plating anbefales. Vanligvis vi har observert at analysen skal bli utført over 15-20 dager til varsel sterk endres i for + ve/ve prosenter, men dette varierer fra gene til genet.
Denne eksperimentelle set-up er godt egnet til testing flere gener parallelt i flere AML linjer til å raskt identifisere rollen kandidat gener i overlevelse eller spredning av AML celler. En påminnelse til konkurransedyktig spredning analysen beskrevet her er at det ikke tar hensyn til potensielle celle-ytre faktorer som paracrine signalisering hendelser fra gene målrettede celler som kan påvirke befolkningen ikke-målrettede celle i samme godt. Selv om dette kan være en sjelden forekomst, bør denne faktoren bæres i bakhodet når du utfører denne analysen. Selv om vi har brukt AML som et eksempel for de CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser beskrevet i dette manuskriptet, kan denne metoden brukes for alle kreft cellen linje for å identifisere rollen flere gener parallelt. Det finnes flere fordeler av genet sletting bruker CRISPR-Cas9 gen-knockdown ved hjelp av RNA-interferens. Først, i motsetning til shRNAs, som vanligvis viser et bredt spekter av målet mRNA hemming, sgRNAs sammen med Cas9 nuclease effektuere komplett knockout av målet gener. Dette kan resultere i mer dramatiske og konsekvent fenotyper med CRISPR-Cas9-baserte metoder, selv om det må være advarte at målretting effektiviteten av personlige sgRNAs samt shRNAs kan variere mye.
Flyt-cytometri-baserte konkurranse analysen tilbyr flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle spredning analyser som et fast antall celler er belagt for å måle den relative proliferativ aktiviteten til genet-opprørt celler. En fordel er at den relative proliferativ aktiviteten til cellene kan enkelt og raskt måles ved flowcytometri i flere dager, omgåelsen behovet for cellen telle alle plating trinn. Dette er nyttig når et stort antall kandidat sgRNAs rettet mot flere gener, som teller alle brønnene er tungvint og kan føre til feil. I motsetning, ATP-basert måling søk for cellevekst, flowcytometri kan utføres på et utvalg av levende celler, noe som gjør denne metoden nyttig for langsiktige analyser. Dette er spesielt nyttig i studiet av faktorer som epigenetic modulatorer, som kan vise sent-fungerende effekter på spredning av AML celler og krever langsiktige analyser. Dernest gir tilstedeværelsen av ikke-transduced celler i den samme også et godt kontrollerte celle befolkningen som kan brukes til å angi den opprinnelige planen analysen. For det tredje, når satt opp en 96-brønns format, analysen kan nesten bli utført med flerkanals Pipetter, betydelig påskynde hele prosessen fra kloning av sgRNAs virus forberedelse og til slutt flyt-cytometric vurdering av fluorescens.
Metoden beskrevet her kan være effektivt skaleres opp for etterforskningen av opptil 96 sgRNAs parallelt i en plassert skjermen. Forutsatt 4-6 sgRNAs per genet, kan denne metoden derfor brukes for rask avhør av minst 16-24 gener parallelt. Ved større antall gener, som et hele molekylær veien som trenger å bli avhørt i AML celler, blir gruppert CRISPR-Cas9-baserte skjermer mer nyttig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.J.D er en konsulent A2A legemidler (New Jersey) og Salgomed Therapeutics (San Diego). Andre forfattere har ingen konflikter å erklære.
Acknowledgments
PCW-Cas9 plasmider var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmider # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmider fra Yusa lab (Addgene plasmider #67974. Vi ønsker å takke flowcytometri kjernen SBP medisinsk Discovery Institute for betimelig hjelp med flyt analyse og sortering. Vi ønsker å erkjenne støtte fra Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi ønsker å erkjenne også støtte fra følgende finansiering kilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponset Grant, V-stiftelsen og San Diego NCI kreft sentre (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).
