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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

आनुवंशिक निर्भरता की जांच CRISPR-Cas9-आधारित प्रतियोगिता परख का उपयोग

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन एक संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता (CRISPR) CRISPR-Cas9-आधारित विधि तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) सेल प्रसार में कई उंमीदवार जीन की भूमिका की सरल और शीघ्र जांच के लिए समानांतर. इस तकनीक स्केलेबल है और अंय कैंसर सेल लाइनों में लागू किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से ।

Abstract

जीन गड़बड़ी अध्ययनों को एएमएल रोगजनन में व्यक्तिगत जीन की भूमिका की जांच के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है. पूरा जीन व्यवधान प्राप्त करने के लिए, इन अध्ययनों के कई जटिल जीन नॉकआउट मॉडल का उपयोग किया है । हालांकि नॉकआउट चूहों के साथ ये अध्ययन जीनोटाइप-टू-phenotype संबंधों की जांच के लिए एक सुरुचिपूर्ण और समय-परीक्षण प्रणाली की पेशकश करते हैं, जो उंमीदवार जीन का आकलन करने के लिए एक तीव्र और स्केलेबल विधि है, जो एएमएल मॉडल में एएमएल सेल प्रसार या अस्तित्व में भूमिका निभाते हैं एकाधिक उंमीदवार जीन के समानांतर पूछताछ में तेजी लाने में मदद मिलेगी । जीनोम में हाल ही में अग्रिम-संपादन प्रौद्योगिकियों नाटकीय रूप से हमारे एक अभूतपूर्व पैमाने पर आनुवंशिक perturbations प्रदर्शन करने की क्षमता को बढ़ाया है । एक जीनोम संपादन की ऐसी प्रणाली CRISPR-Cas9 आधारित विधि है कि लक्ष्य सेल जीनोम में तेजी से और प्रभावोत्पादक परिवर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । CRISPR/Cas9 की सहजता और दरिद्रता-मध्यस्थता जीन-विलोपन यह phenotypic परख में जीन की एक बड़ी संख्या के पूछताछ के लिए सबसे आकर्षक तकनीकों में से एक बनाता है । यहां, हम एक सरल CRISPR/Cas9 मध्यस्थता जीन-व्यवधान उच्च प्रवाह प्रवाह के साथ संयुक्त-cytometry-आधारित प्रतियोगिता परख के लिए जीन की भूमिका की जांच है कि प्रसार या मानव के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है और murine एएमएल कक्ष रेखाएं ।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में कई अनुसंधान तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) रोगजनन में प्रमुख आणविक रास्ते के योगदान की पहचान पर ध्यान केंद्रित प्रयासों को देखा है । परंपरागत रूप से, एएमएल कोशिकाओं में जीन व्यवधान सशर्त नॉकआउट चूहों या लघु hairpin आरएनए (shRNA) का उपयोग किया गया है । जबकि नॉकआउट चूहों जीन-विलोपन के spatio-लौकिक नियंत्रण के लिए एक परिष्कृत प्रणाली की पेशकश, जीन नॉकआउट चूहों पैदा श्रम गहन, समय लेने वाली और महंगी है । इसके अलावा, जीन-नॉकआउट पुनर्संयोजन रणनीतियों का उपयोग आसानी से स्केलेबल नहीं है; इन रणनीतियों खुद को अच्छी तरह से समानांतर में कई जीन की पूछताछ के लिए उधार नहीं है । छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) या shRNA का उपयोग mRNAs अंतर्जात नीचे दस्तक करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप विधियों की खोज के बाद, कई समूहों एएमएल में विशिष्ट जीन की भूमिका की जांच करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप तकनीक का उपयोग शुरू कर दिया. दोनों murine और मानव एएमएल कोशिकाओं के बाद से पारंपरिक लिपिड आधारित अभिकर्मक तरीकों का उपयोग कर transfect के लिए बेहद मुश्किल है, सबसे अध्ययन lentivirally कोशिकाओं में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए retrovirally या shRNA इनकोडिंग एएमएल कार्यरत हैं । संकुल की हाल ही की खोज नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR) और संबद्ध कैस nucleases (CRISPR-Cas9) जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकियों1,2,3में क्रांति ला दिया है । CRISPR-Cas9, विशिष्ट जीन या जीनोमिक क्षेत्रों का उपयोग कर हटाया, संपादित किया जा सकता है या दक्षता और आसानी के साथ टैग । CRISPR-Cas9 आधारित जीन-संपादन अब सादगी, प्रभावशीलता, और इस तकनीक की व्यापक प्रयोज्यता के कारण विविध कोशिका प्रकार में जीनोटाइप-phenotype संबंधों की जांच के लिए पसंद की विधि के रूप में उभर रहा है । CRISPR-Cas9 आधारित तरीकों को भी एएमएल में पसंद की विधि बन रहे हैं, न केवल व्यक्तिगत जीन पूछताछ के लिए, लेकिन यह भी एक तरीका है सरणी या परित आनुवंशिक में कई जीन लक्ष्य के रूप में समानांतर में अनेक जीन की जांच के उद्देश्य से स्क्रीन क्षमता एएमएल-निर्भरताएं4,5,6।

इस पांडुलिपि में, हम एएमएल कोशिकाओं के विकास पर जीन-व्यवधान के प्रभाव को मापने के लिए एक सरल प्रतिस्पर्धी विकास परख का वर्णन करते हैं, जो स्थिर CRISPR-Cas9-मध्यस्थता जीन-संपादन के बाद उच्च-प्रवाह प्रवाह cytometry के आधार पर किया जाता है । इस विधि एएमएल कोशिकाओं में समानांतर में कई जीनों की भूमिका की जांच के लिए मध्यम प्रवाह प्रयोगों के लिए सरल, कुशल, और स्केलेबल है.

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Protocol

1. स्थिर और सक्रिय Cas9 की उच्च अभिव्यक्ति के साथ एएमएल सेल लाइन क्लोन पैदा

  1. Cas9 lentivirus का उत्पादन
    1. 0 दिन: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM के 10 मिलीलीटर में प्लेट 4 x 106 293T कोशिकाओं और पेनिसिलिन और एल-glutamine एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश में एक सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) प्रमाणित सेल संस्कृति हूड में । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में पकवान प्लेस ।
    2. दिन 1: मढ़वाया 293T कोशिकाओं 70-80% 1 दिन पर धाराप्रवाह होना चाहिए । दोपहर में निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग कर अभिकर्मक निष्पादित करें ।
    3. कमरे के तापमान को अभिकर्मक मीडियम, कल्चरल मीडिया और अभिकर्मक रिएजेंट को गर्म करें । गल सभी अपे plasmids के लिए अभिकर्मक ।
    4. एक 5 एमएल ट्यूब में µ मीडियम के ५०० pLenti l के साथ pMD2 के 9 µ g को psPAX2, ०.९ µ g के Cas9 जी और 9 plasmids के माम-µ अभिकर्मक का मिश्रण ।
    5. एक 14 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब करने के लिए अभिकर्मक मध्यम के १.७ मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब की दीवार को छूने से बचने के लिए सीधे ट्यूब में अभिकर्मक मीडियम में अभिकर्मक रिएजेंट के ५७ µ एल जोड़ें ।
    6. धीरे से अभिकर्मक के लिए पूरी प्लाज्मिड मिश्रण जोड़ें और धीरे से साइड पर ट्यूब दोहन द्वारा मिश्रण । 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण की मशीन । इस बीच, बीज 293T थाली से मध्यम बदलें ।
    7. थाली में अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें और धीरे कुशल मिश्रण के लिए बग़ल में थाली रॉक । एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में थाली प्लेस ।
    8. Day 2: अभिकर्मक प्लेट से supernatant को धीरे से महाप्राण इस तरह कि कोशिकाएं परेशान न हों या थाली से उखाड़ फेंकें । supernatant को त्यागें । ताजा 10% DMEM मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें प्लेट के पक्षों से धीरे नीचे फिसलने से कोशिकाओं के विपक्षी से बचने के लिए ।
    9. 3 दिन: यह एक 10 सेमी बाँझ सिरिंज में ड्राइंग द्वारा धीरे अभिकर्मक प्लेट से supernatant युक्त वायरस ले लीजिए. supernatant सिरिंज में एकत्र किया जाता है के बाद, सिरिंज के लिए एक बाँझ ०.४५ µ मीटर फिल्टर देते हैं और एक ताजा, बाँझ 15 एमएल वाले शंकु ट्यूब पर सिरिंज और फिल्टर पकड़. धीरे सिरिंज के लिए 15 एमएल supernatant शंकु ट्यूब में ०.४५ µ मीटर फिल्टर के माध्यम से युक्त वायरस फिल्टर करने के लिए डुबकी ।
    10. 2 मिलीलीटर के aliquots में वायरल वातानुकूलित माध्यम की दुकान प्रत्येक में 2 मिलीलीटर cryovials में-८० ° c ।
  2. एएमएल सेल लाइंस का Transduction
    1. Day-1: पतला 1 मिलीग्राम/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा स्टॉक बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ 10 µ g/ कोट एक गैर ऊतक संस्कृति 10 µ जी के 2 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह से थाली का इलाज/एमएल रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा काम कर रहे समाधान एक BSL2 अनुमोदित सेल कल्चर हूड में । रात भर कमरे के तापमान पर वाष्पीकरण और दुकान पर नुकसान से बचने के लिए चिपके लपेट में थाली लपेटें ।
    2. दिन 0: गल वायरल supernatant युक्त Cas9 । महाप्राण रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा हल पूरी तरह से लेपित प्लेट से बस spinfection से पहले । प्लेट को Cas9 के साथ वायरल वातानुकूलित मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और ३५ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए १,३०० x g पर स्पिन । यह वायरल कणों में मदद करता है spinfected अच्छी तरह से देते हैं ।
    3. इस बीच, transduced होने के लिए कोशिकाओं की गणना और एक 15 एमएल के शंकु ट्यूब में 2 x 106 कोशिकाओं नीचे स्पिन । महाप्राण supernatant और ताजा संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
    4. spinfection के बाद सभी वायरल supernatant को spinfected से निकालकर अच्छी तरह से हटा लें । supernatant से Retroviral कण spinfected के नीचे की ओर अच्छी तरह से जुड़ जाते हैं । इस अच्छी तरह से, 2 एक्स 106 ऊपर के कदम से मध्यम की मिलीलीटर में resuspend कोशिकाओं जोड़ें ।
    5. प्लेट पर फिर से स्पिन १,३०० एक्स जी बहुत संक्षेप में (1-2 मिनट) कोशिकाओं नीचे बसने के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त. थाली मशीन में वापस प्लेस और spinfected वायरल अच्छी तरह से जुड़े कणों के साथ transduction के लिए रात भर छोड़ दें ।
    6. दिन 1: कोशिका घनत्व पर निर्भर करता है, transduced कोशिकाओं को अधिक माध्यम से अधिक वृद्धि से बचने के लिए जोड़ें ।
    7. 2 दिन: के बाद से pLenti-Cas9 प्लाज्मिड एक Blasticidin प्रतिरोध मार्कर है, Blasticidin एक्सप्रेस कोशिकाओं के चयन के लिए µ और transduced (नियंत्रण) untransduced या माउस MOLM13-MLL ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए एक 10 AF9 जी/एमएल खुराक में Cas9 जोड़ें ।
      नोट: सभी MLL नियंत्रण कोशिकाओं को समाप्त कर दिया गया है जब Cas9-transduced MOLM13 या AF9-untransduced ल्यूकेमिया कोशिकाओं के Blasticidin चयन पूरा माना जाता है । MOLM13 और MLL-AF9 ल्यूकेमिया के अलावा अंय सेल लाइनों के लिए, एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र इस प्रयोग से पहले किया जाना चाहिए ताकि एक इष्टतम खुराक नियोजित किया जा सकता है । अनुमापन की कम-transduction दरों के मामले में भी वायरल supernatant का प्रदर्शन किया जा सकता है ।
  3. उच्च-Cas9 एक्सप्रेस कोशिकाओं के क्लोन चयन ।
    नोट: हमने देखा है कि कुछ एएमएल सेल लाइनों में, क्लोन चयन आवश्यक नहीं हो सकता है: थोक Cas9-Blasticidin चयनित जनसंख्या पहले से ही उच्च जीनोम संपादन क्षमता है । इस स्थिति में, यह चरण १.३ को छोड़ दें और पश्चिमी सोख्ता द्वारा बल्क Cas9-blasticidin एएमएल कक्षों में Cas9 व्यंजक का आकलन करने के लिए चरण १.४ पर जाने के लिए संभव है । यह अभी भी उन थोक Cas9-एएमएल कोशिकाओं में जीन संपादन दक्षता का मूल्यांकन महत्वपूर्ण होगा (चरण १.५) प्रतियोगिता परख करने के लिए आगे बढ़ने से पहले । हम शंका है कि एकल उच्च Cas9 क्लोन का चयन जीनोम संपादन परिवर्तनशीलता कम कर देता है, जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब विभिंन एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के एक नंबर का परीक्षण ।
    1. Cas9-Blasticidin चयनित MOLM13 और MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिकाओं के एक एकल सेल प्रकार के बाद से, क्रमशः MOLM13-Cas9 और MLL-AF9-Cas9 कोशिकाओं, एक FACS अनुमोदित हुड में निहित एक सॉर्टर BSL2 का उपयोग करते हुए क्रमश: कहा जाता है । छंटाई 5 में प्रदर्शन किया जा सकता है-10 दौर नीचे गैर ऊतक संस्कृति इलाज ९६ अच्छी तरह से प्लेटें ।
    2. एक बार एकल MOLM13-Cas9 और MLL-AF9-Cas9 क्लोन उठाया गया है और व्यक्तिगत रूप से नामित, 10-20 क्लोन के साथ 10 µ जी/Blasticidin की संस्कृति मीडिया में एमएल Cas9 अभिव्यक्ति के रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए ।
  4. immunoblotting द्वारा स्थिर Cas9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करें ।
    1. MOLM13 और MLL-AF9 ल्यूकेमिया के सभी Blasticidin चयनित क्लोन के परमाणु अर्क बनाने के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार परमाणु निष्कर्षण किट का उपयोग कर । जांच Cas9 प्रोटीन अभिव्यक्ति विरोधी झंडा M2 एंटीबॉडी का उपयोग कर के बाद से pLenti-Cas9 प्लाज्मिड में Cas9 एक N-टर्मिनल झंडा epitope से जुड़ा हुआ है ।
    2. लोड ५० 10% बीआईएस-Tris जेल पर प्रत्येक परमाणु निकालने से कुल प्रोटीन का µ जी और जेल में चला १२० V तक ऊपरी बैंड अच्छी तरह से अलग कर रहे हैं ।
    3. 1 ज के लिए TBST बफर में 5% दूध समाधान के साथ झिल्ली ब्लॉक ।
    4. 1 के साथ झिल्ली की मशीन: विरोधी झंडा M2 एंटीबॉडी के 1000 कमजोर पड़ने 1 µ जी के अंतिम एकाग्रता पर/
    5. अगले दिन, TBST बफर के साथ झिल्ली धोने और एचआरपी संयुग्मित विरोधी माउस के साथ मशीन 1 के एक कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी: 5000 (०.१६ µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए ।
    6. TBST के साथ अच्छी तरह से झिल्ली धोने और ECL सब्सट्रेट का उपयोग दाग विकसित.
    7. उठाओ 3 – Cas9 के उच्चतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ 4 क्लोन के रूप में आगे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा देखा (चित्रा 1) ।
  5. चयनित क्लोनों में उच्च Cas9 गतिविधि सुनिश्चित करना
    1. supernatant चरण १.१ में वर्णित के रूप में मानव या माउस AAVS1 सुरक्षित-हार्बर लोकस लक्ष्यीकरण sgRNAs के साथ एक sgRNA एंकोडिंग वेक्टर से lentiviral तैयार करें ।
    2. Transduce ऊपर वर्णित AF9 विधि का उपयोग कर शीर्ष Cas9-व्यक्त MOLM13 या MLL-AAVS1 ल्यूकेमिया क्लोन विरोधी sgRNA lentiviral supernatant spinfection के साथ । 4 दिनों के लिए २.५ µ g/mL Puromycin के साथ चयन करें ।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार AF9 डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर संबंधित जंगली प्रकार के नियंत्रण के साथ एक साथ Cas9 चयन के बाद MOLM13-Cas9 या MLL-Puromycin-जीनोमिक ल्यूकेमिया क्लोन से जीनोमिक डीएनए शुद्ध । Taq पोलीमरेज़ के 2x मास्टर मिश्रण और पीसीआर 1 तालिकामें सूचीबद्ध कार्यक्रम का उपयोग AAVS1_test_primers के साथ एक पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए के ५० एनजी का प्रयोग करें ।
    4. 2% agarose जेल और जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाने-२६८ आधार युग्म बैंड निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध । सैंज अनुक्रम AAVS1_target-frag_F प्राइमर का उपयोग कर जेल शुद्ध पीसीआर उत्पाद ।
    5. संपादित AAVS1 की तुलना द्वारा संपादन दक्षता का आकलन करें और ऑनलाइन वेब आधारित उपकरणों का उपयोग कर wildtype अनुक्रम (चित्रा 2) ।

2. एएमएल-Cas9 कोशिकाओं में sgRNAs की क्लोनिंग और Transduction

  1. sgRNAs का मध्यम-प्रवाह क्लोनिंग
    1. डिजाइन 4-एक वेब का उपयोग कर ब्याज की जीन के लिए 6 sgRNAs आधारित CRISPR डिजाइन सॉफ्टवेयर । वहां CRISPR डिजाइन उपकरणों की एक संख्या है जैसे http://crispr.mit.edu/जो sgRNA एक इनपुट डीएनए अनुक्रम पर आधारित दृश्यों उत्पंन ऑनलाइन उपलब्ध हैं ।
      1. तारों के साथ खेतों में एक उपयुक्त जानकारी भरें । sgRNA डिजाइन के लिए लक्ष्य जीनोम पर क्लिक करें । अनुक्रम बॉक्स में लक्ष्य अनुक्रम चिपकाएं और सबमिट बटन पर क्लिक करें ।
    2. pKLV2 में क्लोनिंग के लिए-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W sgRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, prepend न्यूक्लियोटाइड "CACC" को भाव oligo और "AAAC" को उल्टे पूरित antisense oligo आदेश देने से पहले. आदेश मिश्रित भावना और विरोधी भावना ओलिगोस्पर्मिया एक ९६ में अच्छी तरह से थाली एक oligonucleotide संश्लेषण कंपनी से Oligo-मिश्रण लेबल ।
      नोट: हमने pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W प्लाज्मिड का उपयोग किया है, जो BbsI क्लोनिंग के लिए sgRNA प्रतिबन्ध स्थल है. यदि अंय sgRNA व्यंजक plasmids का उपयोग किया जाता है, तो sgRNA oligonucleotides के लिए उपयोग किए जाने वाले हैंगर तदनुसार परिवर्तित किए जाने की आवश्यकता होती है ।
    3. एक अलग यू बॉटम ९६-वेल प्लेट बला एनीलिंग प्लेटले. 1 µ एल टी-4 PNK, 10x टी-4 डीएनए बंधाव बफर के 1 µ एल और µ प्रतिक्रिया प्रति पानी की 6 एनीलिंग एल का एक मास्टर मिश्रण बनाओ ।
    4. एनीलिंग थाली के प्रत्येक कुआं पर मास्टर मिश्रण के 8 µ एल जोड़ें । इसमें 1 µ l का १०० µ मी प्रत्येक, भाव और antisense oligo (या 2 µ l के मिश्रित भाव-विरोधी भाव ओलिगोस्पर्मिया) को गुरु मिश्रण से जोड़ें. पिपेट 2-3 बार धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए, प्लेट संक्षेप में स्पिन कुओं के नीचे करने के लिए घोला जा सकता है पाने के लिए ।
    5. एक पीसीआर मशीन पर निंनलिखित एनीलिंग कार्यक्रम का प्रयोग करें: 30 मिनट में ३७ ° c, 2 मिनट 30 एस पर ९५ डिग्री सेल्सियस के बाद 22 डिग्री सेल्सियस के लिए धीमी गति से ठंडा करने के बाद ०.१ ° c/ एनीलिंग के बाद, एक ताजा ९६-अच्छी तरह से प्लेट लें बला पतला OligoMix. इस थाली में, phosphorylated और annealed ओलिगोस्पर्मिया को पानी के साथ ऊपर की प्रतिक्रिया से पतला (1:200) एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर ।
    6. डाइजेस्ट 5 µ g of pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W वेक्टर के साथ १.५ µ एल के BbsI प्रतिबंध एंजाइम (१०,००० इकाइयों/एमएल) के लिए ३७ ° c पर एक उपयुक्त बफर का उपयोग कर के लिए 2 ज linearize के लिए यह बाद बंधाव ।
    7. एक ताजा ९६ अच्छी तरह से प्लेट लेबल बंधाव प्लेट ले और BbsI पच pKLV2 के एनजी-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W वेक्टर एक अच्छी तरह से वांछित sgRNA बंधाव प्रति के लिए जोड़ें । इस के लिए, phosphorylated के 2 µ एल, पतला OligoMix प्लेट से annealed ओलिगोस्पर्मिया जोड़ें ।
    8. 10x टी-4 ligase बफर और टी-4 डीएनए ligase एंजाइम के 1 µ एल के 1 µ एल जोड़ें । धीरे से एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ पिपेट और 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर बंधाव मिश्रण गर्मी ।
      नोट: बंधाव घोला जा सकता है-20 ° c में परिवर्तन के लिए कदम बाद में संग्रहीत ।
    9. इस बीच, गल ९० µ बंधाव कदम के अंत से पहले बर्फ पर 10 मिनट रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के एल ।
    10. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, सक्षम कोशिकाओं के 10 µ l aliquots एक अलग ९६ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में बनाओ ।
    11. अच्छी तरह से सक्षम कोशिकाओं युक्त में कदम 2.1.8 से बंधाव मिश्रण जोड़ें, ऊपर और धीरे नीचे पिपेट और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गर्मी ।
    12. पिपेट 5 µ एल के बैक्टीरिया-डीएनए मिश्रण सीधे ऊपर की प्रतिक्रिया से एक 6 अच्छी प्लेट में पौंड-आगर युक्त १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन के साथ । परिवर्तन प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक के लिए दोहराएँ ।
    13. थाली में प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया एक अलग लेबल एक 6 अच्छी तरह से प्लेट की अच्छी तरह से । प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 5-8 गिलास मोती जोड़ें और एक परिपत्र गति में पूरे 6 अच्छी तरह से प्लेट 8-10 बार हिला ।
    14. उठाओ 1-एक बाँझ 20 µ l पिपेट टिप और एक बाँझ 10 सेमी पेट्री-पौंड के साथ पकवान और १०० मिलीग्राम/एमएल एम्पीसिलीन पर एक सावधानी से बला स्थान में यह लकीर के साथ एक अच्छी तरह से 2 एकल कालोनियों । पौंड प्लेट में लकीर के बाद, बस एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब इसी जीवाणु क्लोन संख्या के साथ चिह्नित में पौंड-एम्पीसिलीन मध्यम से 3 मिलीलीटर में धारिता क्लोन के लिए इस्तेमाल टिप बेदखल ।
    15. मानव U6 प्रमोटर आगे प्राइमर के साथ सीधे सैंज अनुक्रमण के लिए बैक्टीरियल प्लेट भेजें ।
    16. क्लोन sgRNAs के अनुक्रम की पुष्टि के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक मिनी तैयारी किट का उपयोग कर इसी 14 मिलीलीटर ट्यूब से डीएनए शुद्ध ।
    17. एकाग्रता और एक Spectrophotometer के साथ मिनी तैयारी के प्रत्येक की गुणवत्ता को मापने । एक ९६ अच्छी तरह से थाली लेबल sgRNA क्लोन प्लेटमें 15 एनजी/µ एल और पिपेट की एकाग्रता के लिए प्रत्येक मिनी-तैयारी को सामान्य ।
      नोट: इस प्लेट में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c या वायरस तैयारी के लिए सीधे इस्तेमाल किया ।
  2. sgRNA construction and transduction का वायरल उत्पादन
    1. ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में sgRNA lentiviral कणों के उत्पादन के लिए, का पालन करें "shRNA/sgRNA/ओआरएफ उच्च प्रवाह वायरल उत्पादन (९६ अच्छी तरह से)" आनुवंशिक गड़बड़ी मंच (GPP वेब पोर्टल) से व्यापक संस्थान के प्रोटोकॉल (यूआरएल: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols) ।
    2. हस्तांतरण २०० µ वायरल supernatant के l बाँझ ट्यूबों के लिए और फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस तुरंत ।
    3. दिन-1: कोट एक फ्लैट नीचे गैर ऊतक संस्कृति एक BSL2 सेल संस्कृति हूड में 10 µ जी/एमएल की एकाग्रता पर रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा के १०० µ एल के साथ ९६ अच्छी तरह से थाली का इलाज किया । लपेटें प्लेट लपेट का उपयोग करने वाष्पीकरण नुकसान से बचने और यह रात भर बेंच पर छोड़ दें ।
    4. 0 दिन: एक अच्छी तरह से रिकॉमबिनेंट मानव fibronectin टुकड़ा निकालें । प्रत्येक sgRNA के वायरल supernatant को कमरे के तापमान पर गल । प्रत्येक ट्यूब से वायरल supernatant के ५० µ एल जोड़ें transduction प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से लेपित करने के लिए । ३५ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए १,३०० x जी पर transduction प्लेट स्पिन ।
    5. spinfection के अंत की ओर, गिनती MOLM13-Cas9 (क्लोन B3) कोशिकाओं संस्कृति कुप्पी से । १०० µ एल मात्रा में प्रति अच्छी तरह से १०,००० कोशिकाओं का उपयोग करें । सभी transduction कुओं के लिए कोशिकाओं की गणना, विचार में मृत मात्रा ले ।
    6. ९० मिनट spinfection के बाद, सभी कुओं से supernatant को हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट के लिए समायोजित ५० µ एल धीरे प्लेट झुका द्वारा । MOLM13-Cas9 क्लोन B3 कोशिकाओं की संस्कृति के १०० µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से धीरे रिम से नीचे फिसलने ।
    7. १,३०० एक्स जी में ३५ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए थाली स्पिन करने के लिए नीचे पर बसने कोशिकाओं । ३७ डिग्री सेल्सियस ऊतक संस्कृति ग्रेड मशीन के लिए प्लेट स्थानांतरण ।
    8. दिन 1: ताजा माध्यम के १०० µ एल जोड़ने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त sgRNA transduced Cas9-MOLM13 या Cas9-MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिकाओं है कि अंतिम मध्यम मात्रा २०० µ एल है ।

3. प्रतिस्पर्धी विकास परख

  1. दिन 3:72 ज (day 3) पोस्ट transduction, प्रत्येक कुआं में बीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं से युक्त sgRNA के प्रतिशत की जांच फ्लो cytometry (FACS) से करें । विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को चिह्नित और बहिष्कृत करने के लिए एक सेल व्यवहार्यता डाई का उपयोग करें ।
  2. ताजा माध्यम के साथ नए कुओं में कोशिकाओं के अनुपात को फिर से चढ़ाना जारी रखें हर FACS विश्लेषण के बाद परख के दौरान अधिक वृद्धि से बचने के लिए ।
  3. बीएफपी ऋणात्मक (बीएफपी-ve) समकक्षों (चित्रा 3) की तुलना में बीएफपी धनात्मक (बीएफपी + ve) कक्षों के सापेक्ष अनुपात की जांच करने के लिए FACS विश्लेषण हर 2 – 3 दिनों तक दोहराएं । प्रत्येक समय बिंदु (FlowJo या समान FACS विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके) के लिए बीएफपी धनात्मक कक्षों के प्रतिशत का विश्लेषण करें.
    1. FlowJo सॉफ़्टवेयर के लिए प्रत्येक नमूने के लिए Fcs फ़ाइलें खींचें । किसी भी एक नमूना फ़ाइल पर डबल क्लिक करें और Y अक्ष पर X अक्ष और एसएससी पर FSC के साथ आगे तितर बितर (FSC) बनाम साइड कैटर (एसएससी) के एक डॉट दाग साजिश । गेट सब सेल ।
    2. gated कोशिकाओं पर डबल क्लिक करें और व्यवहार्यता दाग पर उंहें भूखंड (Y अक्ष पर) बनाम FSC ऊंचाई (एच) या क्षेत्र (एक) डॉट दाग । Gate व्यवहार्यता दाग नकारात्मक (लाइव) कोशिकाओं ।
    3. X अक्ष पर gated लाइव सेल और प्लॉट बीएफपी (Y अक्ष पर) बनाम FSC (A) पर डबल क्लिक करें । Gate बीएफपी + ve कोशिकाओं । सभी नमूनों को समूह टैब के अंतर्गत सभी नमूनों में चयनित नमूना खींचकर इन सभी द्वारों पर लागू करें.
    4. सभी नमूनों की एक विश्लेषण तालिका बनाने के लिए तालिका संपादक पर क्लिक करें । खींचें बीएफपी + ve गिनती एक नमूना से तालिका के लिए और तालिका संपादक में प्रदर्शन बटन पर क्लिक करें बीएफपी + ve कोशिकाओं का प्रतिशत प्रदर्शित करने के लिए एक तालिका के साथ सभी नमूनों की एक बैच रिपोर्ट बनाने के लिए । तालिका को xls के रूप में सहेजें ।
  4. आनुपातिक वृद्धि की गणना या समय के साथ लाइव सेल जनसंख्या के भीतर% बीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं में कमी और नियंत्रण sgRNAs (जैसे luciferase, तले या GFP sgRNA) में बीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात के लिए इस अनुपात की तुलना करें ।
  5. भूखंड जीन (एस) ब्याज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण के आधार पर दिन 3 का उपयोग सहित विभिंन sgRNAs के लिए बीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात ।

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Representative Results

हमारे अध्ययन में, हम पहले transduced MOLM13 मानव एएमएल सेल लाइन है कि उच्च AF9 वायरस एंकोडिंग के साथ MLL-translocation titer भालू Cas9-blasticidin lentiviral प्लाज्मिड । हमारे हाथ में, थोक unsort-Cas9 कोशिकाओं पश्चिमी सोख्ता द्वारा उच्च स्तर Cas9 अभिव्यक्ति प्रदर्शित नहीं किया और भी अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं किया था जब कुशल जीन संपादन के लिए परख-विधि का उपयोग कर पहले7वर्णित है । इसलिए, हम एक सेल क्लोन स्थापित करने और केवल Cas9 के उच्च स्तर के रूप में पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 1) द्वारा देखा के साथ क्लोन का चयन कर दीं । हम 2 अलग क्लोन उठाया और उंहें AAVS1 सुरक्षित-बंदरगाह लोकस में एक साइट के रूप में पहले7वर्णित लक्ष्यीकरण sgRNAs के साथ transduced । Puromycin-चयनित MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA क्लोन से निकाले जीनोमिक डीएनए का उपयोग करना, हम एक पीसीआर AAVS1 sgRNA कट साइट फैले और सैंज एक MOLM13 क्लोन के लिए 10 पृथक कालोनियों से एक विशिष्ट २६८ बीपी पीसीआर उत्पाद अनुक्रम का उपयोग कर । पैतृक अनुक्रम के साथ संरेखण के बाद, हमने पाया है कि MOLM13-Cas9 क्लोन B3 और MLL-AF9-Cas9 क्लोन 8 १००% की एक दक्षता था (डेटा नहीं दिखाया गया) । हम तो हमारे sgRNA प्रतियोगिता परख के लिए उच्च Cas9 मध्यस्थता जीनोम-संपादन क्षमता प्रदर्शित इन क्लोनों का चयन किया । हालांकि इन अध्ययनों का आयोजन किया जा रहा था, सैंज अनुक्रम से तेजी से जीनोम संपादन क्षमता का परीक्षण करने के लिए वेब आधारित उपकरणों ज्वार8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) या बर्फ (https://ice.synthego.com/#/) जैसे विभिंन समूहों द्वारा विकसित किया गया । ये उपकरण यह बेहद आसान है और लागत प्रभावी करने के लिए व्यक्तिगत टुकड़े क्लोन और कई क्लोनों के अनुक्रमण प्रदर्शन बिना जीनोम संपादन दक्षता का आकलन करने के लिए करते हैं । इसलिए, बल्क Cas9-एक्सप्रेस कोशिकाओं पहले जीनोम संपादन दक्षता के लिए इन तरीकों का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिए । मामले में जीनोम-संपादन क्षमता अधिक है, तो एकल सेल क्लोनिंग की जरूरत नहीं है । इसके अलावा, मामले में है कि एक सेल क्लोनिंग के रूप में हमारे अध्ययन में देखा की जरूरत है, इन वेब आधारित उत्परिवर्तन आवृत्ति अनुमान उपकरण समानांतर में कई क्लोनों के परीक्षण के लिए एक बहुत तेजी से विधि प्रदान करते हैं ।

sgRNA क्लोनिंग के लिए, हम sgRNA क्लोनिंग प्लाज्मिड pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W, जो एक ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन बंदरगाहों बीएफपी sgRNA कोशिकाओं और एक आरएनए transduced III-मानव पोलीमरेज़ प्रमोटर पर नज़र रखने के लिए बंदरगाह का उपयोग किया है कि ड्राइव की अभिव्यक्ति क्लोन sgRNAs के साथ साथ अनुरेखक आरएनए (tracRNA) पाड़. हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया 2 sgRNAs लक्ष्यीकरण DOT1L, एक प्रोटीन के लिए जीन अभिव्यक्ति के epigenetic विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना क्लोन । DOT1L एक हिस्टोन methyltransferase है जो लक्ष्य जीन9,10पर जमा मोनो, डि और त्रि-मिथाइल । अध्ययनों से पता चला है कि DOT1L MLL-फ्यूजन oncogenes द्वारा संचालित एएमएल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, DOT1L नॉकआउट CRISPR-Cas9 का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण पिछले अध्ययन11,12,13,14के साथ लाइन में माउस MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिका प्रसार के लिए नेतृत्व करने की उंमीद है । हमने AAVS1 सेफ हार्बर लोकस को टारगेट करते हुए दो sgRNAs का इस्तेमाल किया, जो PPP1R12C जीन के intron में है । sgRNAs उत्पादन जीनोमिक परिवर्तन इस साइट में MLL-ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों की प्रफलन क्षमता पर कोई प्रभाव होने की संभावना नहीं कर रहे हैं । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम क्लोन sgRNAs डीएनए प्रतिकृति-संबद्ध जीन RPA3 लक्ष्यीकरण । RPA3 एक पैन जरूरी जीन है जिसे कई एएमएल सेल लाइंस4,15,16 के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है । anti-RPA3 sgRNAs इसलिए एएमएल कोशिकाओं में मजबूत विरोधी प्रफलन प्रभाव प्रदर्शित और आम तौर पर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । विरोधी AAVS1 और विरोधी RPA3 sgRNA plasmids के साथ transduction के बाद, हम बीएफपी के सापेक्ष अनुपात + ve sgRNA transduced कोशिकाओं उनके बीएफपी की तुलना में मापा-ve समकक्षों हर 2-3 संस्कृति में दिन (चित्रा 3) । प्रोटोकॉल के साथ ऊपर वर्णित है, MOLM13 या MLL के transduction-AF9 एएमएल कोशिकाओं के परिणामस्वरूप एक 60-70% transduction हमारी वायरल तैयारी के साथ दक्षता, छोड़ शेष 30-40% कोशिकाओं untransduced या बीएफपी-ve हर अच्छी तरह से । यह एक ही कुआं में जंगली प्रकार की कोशिकाओं के साथ जीनोम-संपादित कोशिकाओं के सापेक्ष प्रसार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । आनुपातिक वृद्धि या sgRNA transduced कोशिकाओं के प्रतिशत में कमी sgRNA मध्यस्थता जीन के कार्यात्मक प्रभाव को प्रतिबिंबित करने के लिए एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था MOLM13-Cas9 कोशिकाओं में हटाने. यदि आपके हित के जीन परीक्षण एएमएल कोशिकाओं के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, तो sgRNA-इस जीन की मध्यस्थता व्यवधान sgRNA के रिश्तेदार diminution करने के लिए नेतृत्व करेंगे बीएफपी + ve कोशिकाओं की तुलना में बीएफपी-ve कोशिकाओं के दौरान परख के दौरान, जबकि sgRNAs लक्ष्यीकरण luciferase, GFP या गैर आवश्यक जीन समय के साथ बीएफपी + ve/-ve अनुपात बरकरार रहेगा ।

2 अलग विरोधी RPA3 sgRNAs का उपयोग कर, हम बीएफपी-ve untransduced समकक्षों की तुलना में बीएफपी + ve कोशिकाओं के प्रतिशत में एक प्रगतिशील और महत्वपूर्ण गिरावट देखी । इसके विपरीत, विरोधी का प्रतिशत AAVS1 sgRNA व्यक्त बीएफपी कोशिकाओं को समय के साथ अपेक्षाकृत स्थिर रहे, प्रदर्शन है कि AAVS1 लक्ष्यीकरण MOLM13 कोशिकाओं के प्रसार पर कोई प्रभाव नहीं है (4a आंकड़ा) । इसी प्रकार, माउस MLL-AF9-Cas9 कोशिकाओं में, हम sgRNAs लक्ष्यीकरण Rhodopsin (Rho1), एक नकारात्मक नियंत्रण और Dot1l के रूप में आंख रंजकता जीन के प्रभाव का परीक्षण किया, एक epigenetic नियामक समय के साथ MLL-AF9 ल्यूकेमिया कोशिकाओं के प्रसार के लिए आवश्यक हो जाना . इस अध्ययन में, बीएफपी + ve माउस MLL-AF9-Cas9 कोशिकाओं 2 अलग विरोधी transduced DOT1L के साथ sgRNAs समय के साथ एक नाटकीय और प्रगतिशील नुकसान बीएफपी-ve sgRNA गैर transduced कोशिकाओं (चित्रा 4b) की तुलना में दिखाया. इसके विपरीत, विरोधी Rho1 sgRNA के अनुपात में समय के साथ अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रहे । ये परिणाम MLL-AF9 एक्सप्रेस माउस ल्यूकेमिया कोशिकाओं की भेद्यता को प्रदर्शित करने के लिए Dot1l कमी, पहले प्रकाशित परिणाम की पुष्टि.

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि पश्चिमी दाग अलग Cas9 स्तर दिखा परिणाम है । CAS9 के साथ MOLM13 एएमएल सेल लाइन transduced के सिंगल सेल क्लोनों फ्लैग-CAS9 अभिव्यक्ति स्तर विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए जांच की गई । Cas9 की सर्वोच्च अभिव्यक्ति दर्शाने वाले क्लोन को आगे की पढ़ाई के लिए चुना गया. HEK293-टी कोशिकाओं transfected एक Cas9 अभिव्यक्ति के साथ प्लाज्मिड एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर Cas9 transduced कोशिकाओं MOLM13 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Dot1l लोकस बर्फ विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन पर जीनोम संपादन के प्रतिनिधि विश्लेषण । एक पीसीआर Dot1l sgRNA लक्ष्य साइट के आसपास केंद्रित amplicon सैंज अनुक्रम और बर्फ विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । गैर-लक्षित डीएनए अनुक्रम (ग्रीन लाइन) के लिए sgDot1l अनुक्रम (नारंगी रेखा) की तुलना sgRNA लक्ष्य साइट के आसपास sgDot1l लक्षित कोशिकाओं में संपादन दक्षता के उच्च स्तर को दर्शाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रस्तावित तरीकों के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह । sgRNAs sgRNA अभिव्यक्ति वेक्टर सह में क्लोन कर रहे है बीएफपी जैसे एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त । लक्ष्य कोशिकाओं पर transduced 30-60% transduction दरों और उसके बाद प्रवाह-cytometry हर 2-3 दिन है । sgRNAs लक्ष्यीकरण एएमएल सेल प्रसार के लिए आवश्यक जीन दिखाया के रूप में समय के साथ सापेक्ष कमी दिखाएगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मानव और माउस एएमएल कोशिकाओं में प्रतियोगिता परख से प्रतिनिधि परिणाम । (क) परिणाम RPA3 transduced MOLM13-Cas9 क्लोन B3 कोशिकाओं में एक सांख्यिकीय अत्यधिक महत्वपूर्ण प्रगतिशील गिरावट दिखा । इसके विपरीत, AAVS1 साइट लक्ष्यीकरण sgRNAs कोई प्रभाव नहीं है । (ख) sgRNAs लक्ष्यीकरण Dot1l प्रतिस्पर्धी प्रसार में एक उल्लेखनीय और प्रगतिशील गिरावट दिखाने के लिए, sgRNAs लक्ष्यीकरण Rhodopsin (Rho) के विपरीत । *p > ०.०५. * *p < ०.०५. त्रुटि पट्टियां माध्य (SD) के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रोटोकॉल की सामांय रूपरेखा । (क) Cas9 वायरस और sgRNA क्लोनिंग के उत्पादन में प्रत्येक चरण के लिए समय वर्णित है. डिजाइन और sgRNAs के क्लोनिंग प्रदर्शन किया जा सकता है, जबकि स्थिर Cas9 अभिव्यक्ति के साथ एएमएल सेल लाइनों के एकल क्लोन पैदा । (ख) sgRNAs और प्रतिस्पर्धी विकास FACS का उपयोग परख के साथ एएमएल सेल लाइनों के transduction के लिए जनरल प्रोटोकॉल दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चक्र चक्र की अवधि तापमान
1 2 min ९५ º ग
३५ 30 एस ९५ º ग
30 एस ५५ º ग
30 एस ७२ º ग
1 5 min ७२ º ग
पकड़ अनंत 4 º c

तालिका 1: जीनोमिक डीएनए से AAVS1 लोकस प्रवर्धन के लिए पीसीआर कार्यक्रम । पीसीआर कार्यक्रम Cas9 एक्सप्रेस क्लोन में Cas9 की क्षमता काटने परीक्षण के लिए जीनोमिक डीएनए से AAVS1 लोकस के प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया ।

अनुपूरक फाईल: sgRNA oligo जुगाड़ । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक CRISPR-Cas9 आधारित प्रतिस्पर्धी विकास परख के लिए एएमएल सेल लाइनों में उंमीदवार जीन की भूमिका की जांच प्रवाह का उपयोग कर मानव में cytometry/murine एएमएल कोशिकाओं (चित्रा 5) । परख के लक्ष्य के लिए एक मध्यम प्रवाह पैमाने पर दो से तीन सप्ताह में एएमएल सेल प्रसार के रखरखाव पर जीन विलोपन के प्रभाव की पहचान है । वर्णित प्रोटोकॉल की स्केलिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरणों का सावधानीपूर्वक पालन करने की आवश्यकता है । Cas9 lentivirus के उत्पादन में 293T युक्त विषाणु को supernatant कोशिकाओं के carryover से बचने के लिए ०.४५ µ मीटर फिल्टर के माध्यम से वायरस वातानुकूलित माध्यम को फिल्टर करना आवश्यक है । spinfection के दौरान, चिपकने वाला लपेटो या parafilm के साथ spinfection प्लेट लपेटन में मदद करता है केंद्रापसारक के दौरान संभावित संदूषण से बचें । हालांकि, लपेट spinfected प्लेट ऊतक संस्कृति मशीन में वापस रखने से पहले हटा दिया जाना चाहिए । यह संपादन दक्षता के लिए Cas9-व्यक्त क्लोन का आकलन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । कम जीनोम संपादन क्षमता के साथ क्लोन अपर्याप्त Cas9 गतिविधि को प्रतिबिंबित और प्रयोग की सफलता दर को प्रभावित कर सकते हैं । हमारे प्रयोगों में, हम पहले AAVS1 लोकस को लक्षित sgRNAs के साथ मानव एएमएल Cas9 क्लोन transduced और संपादन कुशलता के लिए अपने जीनोमिक DNAs अनुक्रम । AAVS1 की तुलना संपादित और wildtype दृश्यों ऑनलाइन वेब आधारित उपकरण जैसे ज्वार8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) या बर्फ (https://ice.synthego.com/#/) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । इन प्रोग्रामों के संभावित संपादित पीसीआर अंश के सैंज अनुक्रम अंश अप्रकाशित wildtype या संदर्भ अनुक्रम के लिए तुलना करें और परिवर्तन की आवृत्ति का अनुमान है । यह परीक्षण sgRNA, जो सेलुलर Cas9 गतिविधि का उपाय है द्वारा लाया के बारे में परिवर्तन का आकलन करने का एक तेजी से रास्ता है । वैकल्पिक रूप से, एक पीसीआर में पीसीआर उत्पाद की क्लोनिंग ऐसे टोपो कुंद क्लोनिंग वेक्टर के रूप में प्लाज्मिड प्रदर्शन किया जा सकता है, व्यक्तिगत कालोनियों के सैंज अनुक्रमण के बाद प्रत्येक क्लोन के अनुक्रम संरेखण द्वारा जीनोम-संपादन क्षमता का आकलन करने के लिए जंगली प्रकार । हम पूर्व विधि पसंद करते हैं, अपनी आसानी और लागत-प्रभावशीलता क्लोनिंग विधि की तुलना में दिया । आमतौर पर, इस तरह के बिंदु उत्परिवर्तनों, indels, आदिके रूप में आधार जोड़ी परिवर्तन की खोज, पर या अनुक्रम क्लोनों के एक विशाल बहुमत में sgRNA काटने साइट के आसपास एक अत्यधिक सक्रिय Cas9 की उपस्थिति का संकेत मिलता है । इस प्रकार, हम आगे प्रयोगों के लिए उच्चतम संपादन दक्षता के साथ क्रमशः MOLM13 या MLL-AF9 लेकिमिया क्लोन B3 और 8, चुना ।

हम http://crispr.mit.edu/, एक वेब आधारित सॉफ्टवेयर है कि sgRNAs की एक सूची देता है का उपयोग कर प्रोटोकॉल में उल्लेख किया अलग जीन लक्ष्यीकरण sgRNAs बनाया । यह सूची में से शीर्ष स्कोरिंग sgRNAs का चयन करने के लिए की भविष्यवाणी की बंद लक्ष्य प्रभाव के साथ उन को खत्म करने के लिए सिफारिश की है. डिजाइन sgRNAs इस तरह के (http://www.addgene.org/67974/) वेबसाइट पर एक के रूप में प्रकाशित प्रोटोकॉल में से किसी का उपयोग कर क्लोन किया जा सकता है । भाव और antisense ओलिगोस्पर्मिया चरण 2.1.5 के अनुसार पहले phosphorylated और annealed हैं. ३७ ° c पर पहला कदम टी-4 कळेनासे के साथ ओलिगोस्पर्मिया phosphorylating के लिए महत्वपूर्ण है और बाद में पीसीआर चक्र oligonucleotides में भावना और विरोधी भावना dsDNA के एनीलिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह महत्वपूर्ण है sgRNA क्लोनिंग वेक्टर में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो बाद में प्रतियोगिता परख में sgRNA transduced कोशिकाओं पर नज़र रखने के लिए महत्वपूर्ण है । sgRNA क्लोनिंग एनीलिंग और बंधाव सहित सभी चरणों में ९६ अच्छी तरह से थाली के उपयोग के साथ बढ़ाया है । बंधाव के लिए, स्वच्छ पीसीआर microtube स्ट्रिप्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से वे मल्टीचैनल पिपेट के साथ संगत कर रहे हैं । मामले में है कि sgRNA क्लोनों का एक बड़ा सेट के परिवर्तन की जरूरत है, एक ९६-अच्छी थाली जिसमें सक्षम कोशिकाओं के 10 μL में एक अच्छी तरह से पूर्व aliquoted और जमे हुए हैं-८० डिग्री सेल्सियस पूरी प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बंधाव प्रतिक्रियाओं को चढ़ाना के प्रयोजन के लिए व्यक्तिगत कालोनियों, जो ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है लेने के लिए है । इसलिए, बैक्टीरियल परिवर्तन के लिए, वहां दरिद्रता में एक मामूली नुकसान है । फिर भी, एक पूरे ९६-अच्छी तरह से थाली से परिवर्तन प्रतिक्रियाओं के चढ़ाना के लिए, यह केवल सोलह 6 की कुल की आवश्यकता होगी पूरी परियोजना के लिए अच्छी तरह से प्लेटें । एक परिवर्तन प्लेटों से उठा कालोनियों के अगले कदम में सावधान रहना होगा । एक बला की जगह पर एक कॉलोनी लकीर, जबकि यह सुनिश्चित करें कि स्पॉट अन्य स्थानों से स्पष्ट रूप से अलग है । एक काले स्थाई मार्कर के साथ पेट्री डिश के तल पर एक वर्ग ग्रिड अंकन में मदद करता है बैक्टीरिया का क्लोन के पार संक्रमण को रोकने के ।

एक बार sgRNA construction के minipreps तैयार हो जाते हैं, वायरस को ९६-well फॉर्मेट में बनाया जा सकता है । प्रवाह के इस स्तर पर, यह फ़िल्टर करने के लिए अव्यावहारिक है २०० µ एल वायरस युक्त supernatant । इसलिए, वायरल supernatant किसी भी 293T supernatant में खत्म किए कोशिकाओं से पार संक्रमण से बचने के लिए कम से रात जम जाना चाहिए । यह भी ५० µ एल aliquots में बाँझ पीसीआर ट्यूब स्ट्रिप्स में संग्रहीत किया जा सकता है supernatant के फ्रीज गल से बचने के लिए । इसके अलावा, इन वायरस वातानुकूलित supernatants transducing एएमएल कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है । मामले में वायरल transduction के कम titers मनाया, के रूप में बीएफपी + ve कोशिकाओं की कम आवृत्ति द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं, तो यह वायरल titer का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और संक्रमण के विभिंन गुणा पर transductions परीक्षण (MOI) 40-60 प्रतिशत सुनिश्चित करने के लिए transduction दरे । वायरल titer निर्धारण और MOI गणना में विस्तार से बताया गया है यहां17. प्रतियोगिता परख में, के रूप में प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित है, यह अत्यधिक गैर को बाहर करने व्यवहार्य कोशिकाओं को ऑटो से नकली कलाकृतियों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है-प्रतिदीप्ति जबकि गैर बीएफपी अनुपात बीएफपी का विश्लेषण । FACS के समय, परीक्षण नमूनों का विश्लेषण करने से पहले, बीएफपी नकारात्मक और बीएफपी सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग अत्यधिक वोल्टेज सेट करने के लिए अनुशंसित है । प्रत्येक पुनः चढ़ाना समय बिंदु पर, कोशिकाओं की मात्रा को पुनः चढ़ाया जा करने के लिए दिए गए समय-बिंदु पर कोशिकाओं की एकाग्रता पर निर्भर करता है । हम आम तौर पर फिर से २०० μL के एक कुल से 20 μL चढ़ाया हर समय-बिंदु में एक ताजा अच्छी तरह से ताजा माध्यम के १८० μL के साथ । पूरी तरह से कोशिकाओं का मिश्रण धीरे से ऊपर और नीचे बस से पहले फिर से चढ़ाना अत्यधिक की सिफारिश की है pipetting । आमतौर पर, हमने देखा है कि परख के लिए 15 से अधिक किए जाने की जरूरत है-20 दिन बीएफपी में मजबूत परिवर्तन की सूचना + ve/-ve अनुपात, हालांकि यह जीन से जीन को बदलता है ।

इस प्रायोगिक सेट अप अच्छी तरह से एकाधिक एएमएल सेल लाइनों में समानांतर में कई जीन परीक्षण के लिए तेजी से अस्तित्व या एएमएल कोशिकाओं के प्रसार में उंमीदवार जीन की भूमिका की पहचान करने के लिए अनुकूल है । प्रतिस्पर्धी प्रसार परख की एक चेतावनी यहां वर्णित है कि यह संभावित सेल-बाह्य कारकों पर विचार नहीं करता है जैसे जीन से घटनाओं संकेत paracrine कोशिकाओं है कि गैर प्रभावित कर सकते है लक्षित सेल जनसंख्या के भीतर ही अच्छी तरह से निशाना बनाया । हालांकि यह एक दुर्लभ घटना हो सकती है, इस कारक मन में वहन किया जाना चाहिए जब इस परख का आयोजन । यद्यपि हम CRISPR-Cas9 आधारित प्रतियोगिता इस पांडुलिपि में वर्णित परख के लिए एक उदाहरण के रूप में एएमएल का इस्तेमाल किया है, इस विधि किसी भी कैंसर सेल लाइन के लिए समानांतर में कई जीन की भूमिका की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वहां जीन के विभिंन लाभ-हटाने का उपयोग कर रहे है CRISPR-जीन पर Cas9-आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग पछाड़ना । सबसे पहले, shRNAs, जो आम तौर पर लक्ष्य mRNA अवरोध की एक व्यापक रेंज दिखाने के विपरीत, Cas9 nuclease effectuate लक्ष्य जीन की पूरी तरह से नॉकआउट के साथ युग्मित sgRNAs । यह CRISPR-Cas9-आधारित विधियों के साथ और अधिक नाटकीय और सुसंगत phenotypes में परिणाम हो सकता है, भले ही यह चेताया जाना चाहिए कि व्यक्तिगत sgRNAs के साथ ही shRNAs की लक्ष्यीकरण दक्षता व्यापक रूप से भिन्न हो सकती है.

प्रवाह-cytometry-प्रतियोगिता परख आधारित पारंपरिक प्रसार परख जिसमें कोशिकाओं की एक निश्चित संख्या में जीन-परेशान कोशिकाओं के सापेक्ष प्रफलन गतिविधि को मापने के लिए चढ़ाया जाता है पर कई लाभ प्रदान करता है । एक लाभ यह है कि कोशिकाओं के सापेक्ष प्रफलन गतिविधि आसानी से किया जा सकता है और तेजी से कई दिनों के लिए प्रवाह-cytometry द्वारा मापा, सेल हर चढ़ाना कदम पर गिनती के लिए की जरूरत को दरकिनार । यह उपयोगी है जब कई जीन लक्ष्यीकरण sgRNAs उंमीदवार की एक बड़ी संख्या में परीक्षण, के रूप में कुओं के सभी गिनती बोझिल है और अशुद्धियों को जंम दे सकता है । के विपरीत, एटीपी सेल विकास के लिए माप परख आधारित, प्रवाह-cytometry जीवित कोशिकाओं का एक नमूना है, जो इस विधि लंबी अवधि के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है पर किया जा सकता है । यह epigenetic मॉडुलन के रूप में कारकों के अध्ययन में विशेष रूप से लाभप्रद है, जो देर से एएमएल कोशिकाओं के प्रसार पर अभिनय प्रभाव दिखा सकते हैं और लंबे समय तक परख की आवश्यकता हो सकती है. दूसरे, एक ही अच्छी तरह के भीतर गैर transduced कोशिकाओं की उपस्थिति एक अच्छी तरह से नियंत्रित सेल जनसंख्या कि परख के लिए आधार रेखा निर्धारित किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है । तीसरे, जब सेट अप में एक ९६-अच्छी तरह से प्रारूप, परख लगभग पूरी तरह से मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है, काफी हद तक sgRNAs के क्लोनिंग से वायरस की तैयारी और अंततः प्रवाह-cytometric आकलन के लिए पूरी प्रक्रिया तेज प्रतिदीप्ति.

यहां वर्णित विधि कुशलतापूर्वक स्केल-अप करने के लिए एक सरणी स्क्रीन में समानांतर में ९६ sgRNAs की जांच के लिए किया जा सकता है । मानते हुए 4-6 जीन प्रति sgRNAs, इस विधि इसलिए कम से तेजी से पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16-समानांतर में 24 जीन । इस तरह के एक पूरे आणविक मार्ग है कि एएमएल कोशिकाओं में पूछताछ की जरूरत के रूप में जीन की बड़ी संख्या के मामले में, परित CRISPR-Cas9-आधारित स्क्रीन अधिक उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

ए. जे. डी. A2A फार्मास्यूटिकल्स (ंयू जर्सी) और Salgomed चिकित्सकीय (सैन डिएगो) के लिए एक सलाहकार है । अन्य लेखकों को घोषित करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

pCW-Cas9 प्लाज्मिड ने एरिक लैंडर & डेविड Sabatini (Addgene प्लाज्मिड # ५०६६१) से उपहार और pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-डब्ल्यू प्लाज्मिड लैब (युस Addgene #67974 से प्लाज्मिड । हम प्रवाह विश्लेषण और छंटाई के साथ समय पर मदद के लिए एसबीपी चिकित्सा डिस्कवरी संस्थान में प्रवाह Cytometry कोर धंयवाद देना चाहूंगा । हम लेडी टाटा मेमोरियल फाउंडेशन के सहयोग को स्वीकार करना चाहते है ईसवी हम भी निंनलिखित धन स्रोतों के समर्थन को स्वीकार करना चाहूंगा: NIH/NCI P30 CA030199 कैंसर केंद्र प्रायोजित अनुदान, वी फाउंडेशन और सैन डिएगो NCI कैंसर केंद्रों (C3) #PTC2017to A.J.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FLAG-M2 Antibody sigma-aldrich F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody Invitrogen 31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher 34095
ChemiDoc Imaging System BIO RAD 17001401
Sorvall Legend RT centrifuge Thermo Scientific
Blasticidin Thermo Fisher R21001
SYTOX Red Thermo Fisher S34859
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
DMEM Thermo Fisher 11965-092
RPMI Thermo Fisher 11875-093
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030081
Fetal Bovine Serum (FBS) SAFC 12303C
single gRNA vector Addgene #67974 pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit sigma-alorich NXTRACT
XtremeGENE 9 sigma-alorich 6365787001
Retronectin Takara T100B
Flow cytometer BD Biosciences
T4 PNK NEBioLabs M0201S
T4 DNA ligation buffer NEBioLabs B0202S
T4 DNA Ligase enzyme NEBioLabs M0202S
Ampicillin Fisher scientific BP1760-25
LB agar Fisher scientific BP9724-500
LB Broth Fisher scientific BP9731-500
Qiagen mini-prep kit Qiagen 27104
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant Murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant Murine M-CSF Peprotech 315-02
Stable competent cells NEBiolabs C3040I
10 cm Tissue Culture dishes Fisher Scientific 353003
Cell lysis solution Qiagen 158906
Protein precipitation solution Qiagen 158910
DNA hydration solution Qiagen 158914
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BbSI New England BioLabs R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit Genessee Scientific 42-138
Puromycin Fisher scientific BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495949A
15 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495970C

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कैंसर अनुसंधान अंक १४३ एएमएल CRISPR-Cas9 उच्च प्रवाह परख प्रतिस्पर्धी विकास परख DOT1L ल्यूकेमिया कैंसर
आनुवंशिक निर्भरता की जांच CRISPR-Cas9-आधारित प्रतियोगिता परख का उपयोग
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Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao,… More

Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao, L., Saddoris, K., Kerr, M., Zhu, N., Mali, P., Deshpande, A. J. Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays. J. Vis. Exp. (143), e58710, doi:10.3791/58710 (2019).

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