Summary

Undersøgelse af genetiske afhængigheder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede konkurrence Assays

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Dette manuskript beskriver en grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager (CRISPR) CRISPR-Cas9-baseret metode for enkel og hurtig undersøgelse af flere kandidat gener i akut Myeloid leukæmi (AML) celledelingen i rolle parallel. Denne teknik er skalerbar og kan anvendes i andre kræft cellelinjer så godt.

Abstract

Gen undertrykkelse af netbårne undersøgelser har været flittigt brugt til at undersøge rollen af enkelte gener i AML patogenese. For at opnå komplet gen forstyrrelser, mange af disse studier har gjort brug af komplekse gen knockout modeller. Mens disse undersøgelser med knockout mus tilbyder en elegant og tid-testet systemet for at undersøge genotype-fænotype relationer, en hurtig og skalerbar metode til vurdering af kandidat gener, spille en rolle i AML celledelingen eller overlevelse i AML modeller vil medvirke til at fremskynde den parallelle forhør af flere kandidat gener. De seneste fremskridt i genom-redigering teknologier har dramatisk forbedret vores evne til at udføre genetiske forstyrrelser på et hidtil uset omfang. Et sådant system af genom-redigering er den CRISPR-Cas9-baseret metode, der kan bruges til at foretage hurtige og effektive ændringer i target cell genom. Den lethed og skalerbarhed af CRISPR/Cas9-medieret gen-sletning gør det en af de mest attraktive teknikker for afhøring af et stort antal gener i fænotypiske assays. Her præsenterer vi en simpel analyse ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret gen-forstyrrelser kombineret med høj overførselshastighed flow-flowcytometri-baserede konkurrence assays til at undersøge rollen af gener, der kan spille en vigtig rolle i udbredelsen eller overlevelsen af menneskelige og murine AML cellelinjer.

Introduction

De sidste par årtier har set talrige forskningsindsats fokuseret på at identificere centrale molekylære veje i akut myeloid leukæmi (AML) patogenese bidrag. Gen-forstyrrelser i AML celler har traditionelt udført ved hjælp af betingede knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Mens knockout mus tilbyder et sofistikeret system for spatio-temporale kontrol af gen-sletning, er generere gen knockout mus arbejdskrævende, tidskrævende og dyrt. Desuden gen-udskæringer ved hjælp af rekombination strategier er ikke let skalerbare; disse strategier egner ikke sig godt til afhøring af flere gener i parallel. Efter opdagelsen af RNA interferens metoder til knock-down endogene mRNAs ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA, begyndte mange grupper ved hjælp af RNA interferens teknikker til at undersøge rollen af specifikke gener i AML. Da både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskeligt at transfect ved hjælp af traditionelle lipid-baserede Transfektion metoder, de fleste undersøgelser ansat lentivirally eller Retroviralt kodet shRNA for at studere genfunktion i AML celler. Den nylige opdagelse af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og de tilknyttede Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutioneret gen-targeting teknologier1,2,3. Ved hjælp af CRISPR-Cas9, kan specifikke gener eller genomisk regioner slettes, redigeres eller markeret med effektivitet og lethed. CRISPR-Cas9-baseret gen-redigering er nu fremstår som den foretrukne metode til undersøgelse af genotype-fænotype relationer i forskellige celletyper på grund af enkelhed, effektivitet og bred anvendelighed af denne teknik. CRISPR-Cas9-baserede metoder bliver også metoden til valg i AML, ikke kun for spørgekriterierne enkelte gener, men også som en måde til at målrette flere gener i klædt eller poolede genetiske skærme med henblik på at undersøge flere gener parallelt som potentielle AML-afhængigheder4,5,6.

I dette manuskript beskriver vi en simpel konkurrencedygtig vækst assay for måling af virkningen af gen-forstyrrelser på væksten af AML celler, baseret på stabile CRISPR-Cas9-medieret gen-redigering efterfulgt af høj overførselshastighed flowcytometri. Denne metode er enkel, effektiv og skalerbar til medium-overførselshastighed eksperimenter for at undersøge rollen af flere gener parallelt i AML celler.

Protocol

1. generere AML celle linje kloner med højt udtryk af stabile og aktiv Cas9 Produktion af Cas9 lentivirus Dag 0: Plade 4 x 106 293T celler i 10 mL af DMEM med 10% føtal bovint serum (FBS) og penicillin og L-glutamin i en 10 cm vævskultur fad i en biosikkerhed niveau 2 (BSL2) certificeret celle kultur hætte. Placer fadet i et 37 ° C inkubator. Dag 1: Forgyldt 293T celler bør være 70 – 80% sammenflydende på dag 1. Udføre Transfektion ved hjælp af følge…

Representative Results

I vores undersøgelse transduced vi først MOLM13 menneskelige AML cellelinje, der bærer MLL AF9 omplantning med høj titer virus kodning Cas9-blasticidin lentiviral plasmid. I vores hænder beskrevet bulk usorteret MOLM13-Cas9 celler ikke vise højt niveau Cas9 udtryk af Western blotting og også ikke udføre godt når analyseres for effektiv gen redigering-ved hjælp af metoden tidligere7. Derfor, vi fortsatte med at etablere enkelt celle kloner og kun vælge kl…

Discussion

I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage en CRISPR-Cas9-baserede konkurrencedygtig vækst analyse for at undersøge rollen af kandidat gener i AML cellelinjer hjælp flowcytometri fra human/murine AML celler (figur 5). Målet med analysen er at identificere effekten af gen sletning på vedligeholdelse af AML celleproliferation over to til tre uger på en medium-overførselshastighed skala. Nogle kritiske trin skal følges nøje for at lette optrapning af den bes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PCW-Cas9 plasmid var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W plasmid fra Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vil gerne takke flowcytometri core på SBP medicinske opdagelse Institute for rettidig hjælp med flow analyse og sortering. Vi vil gerne anerkende støtten af Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi vil gerne også anerkender støtten fra de følgende finansieringskilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsoreret Grant, V-Foundation og San Diego NCI Cancer Centre (C3) #PTC2017to A.J.D.

Materials

FLAG-M2 Antibody sigma-aldrich F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody Invitrogen 31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher 34095
ChemiDoc Imaging System BIO RAD 17001401
Sorvall Legend RT centrifuge Thermo Scientific
Blasticidin Thermo Fisher R21001
SYTOX Red Thermo Fisher S34859
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
DMEM Thermo Fisher 11965-092
RPMI Thermo Fisher 11875-093
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030081
Fetal Bovine Serum (FBS) SAFC 12303C
single gRNA vector Addgene #67974 pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit sigma-alorich NXTRACT
XtremeGENE 9 sigma-alorich 6365787001
Retronectin Takara T100B
Flow cytometer BD Biosciences
T4 PNK NEBioLabs M0201S
T4 DNA ligation buffer NEBioLabs B0202S
T4 DNA Ligase enzyme NEBioLabs M0202S
Ampicillin Fisher scientific BP1760-25
LB agar Fisher scientific BP9724-500
LB Broth Fisher scientific BP9731-500
Qiagen mini-prep kit Qiagen 27104
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant Murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant Murine M-CSF Peprotech 315-02
Stable competent cells NEBiolabs C3040I
10 cm Tissue Culture dishes Fisher Scientific 353003
Cell lysis solution Qiagen 158906
Protein precipitation solution Qiagen 158910
DNA hydration solution Qiagen 158914
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BbSI New England BioLabs R0539S
APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit Genessee Scientific 42-138
Puromycin Fisher scientific BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495949A
15 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495970C

References

  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).

Play Video

Cite This Article
Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao, L., Saddoris, K., Kerr, M., Zhu, N., Mali, P., Deshpande, A. J. Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays. J. Vis. Exp. (143), e58710, doi:10.3791/58710 (2019).

View Video