Summary
Dette manuskript beskriver en grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager (CRISPR) CRISPR-Cas9-baseret metode for enkel og hurtig undersøgelse af flere kandidat gener i akut Myeloid leukæmi (AML) celledelingen i rolle parallel. Denne teknik er skalerbar og kan anvendes i andre kræft cellelinjer så godt.
Abstract
Gen undertrykkelse af netbårne undersøgelser har været flittigt brugt til at undersøge rollen af enkelte gener i AML patogenese. For at opnå komplet gen forstyrrelser, mange af disse studier har gjort brug af komplekse gen knockout modeller. Mens disse undersøgelser med knockout mus tilbyder en elegant og tid-testet systemet for at undersøge genotype-fænotype relationer, en hurtig og skalerbar metode til vurdering af kandidat gener, spille en rolle i AML celledelingen eller overlevelse i AML modeller vil medvirke til at fremskynde den parallelle forhør af flere kandidat gener. De seneste fremskridt i genom-redigering teknologier har dramatisk forbedret vores evne til at udføre genetiske forstyrrelser på et hidtil uset omfang. Et sådant system af genom-redigering er den CRISPR-Cas9-baseret metode, der kan bruges til at foretage hurtige og effektive ændringer i target cell genom. Den lethed og skalerbarhed af CRISPR/Cas9-medieret gen-sletning gør det en af de mest attraktive teknikker for afhøring af et stort antal gener i fænotypiske assays. Her præsenterer vi en simpel analyse ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret gen-forstyrrelser kombineret med høj overførselshastighed flow-flowcytometri-baserede konkurrence assays til at undersøge rollen af gener, der kan spille en vigtig rolle i udbredelsen eller overlevelsen af menneskelige og murine AML cellelinjer.
Introduction
De sidste par årtier har set talrige forskningsindsats fokuseret på at identificere centrale molekylære veje i akut myeloid leukæmi (AML) patogenese bidrag. Gen-forstyrrelser i AML celler har traditionelt udført ved hjælp af betingede knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Mens knockout mus tilbyder et sofistikeret system for spatio-temporale kontrol af gen-sletning, er generere gen knockout mus arbejdskrævende, tidskrævende og dyrt. Desuden gen-udskæringer ved hjælp af rekombination strategier er ikke let skalerbare; disse strategier egner ikke sig godt til afhøring af flere gener i parallel. Efter opdagelsen af RNA interferens metoder til knock-down endogene mRNAs ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA, begyndte mange grupper ved hjælp af RNA interferens teknikker til at undersøge rollen af specifikke gener i AML. Da både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskeligt at transfect ved hjælp af traditionelle lipid-baserede Transfektion metoder, de fleste undersøgelser ansat lentivirally eller Retroviralt kodet shRNA for at studere genfunktion i AML celler. Den nylige opdagelse af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og de tilknyttede Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutioneret gen-targeting teknologier1,2,3. Ved hjælp af CRISPR-Cas9, kan specifikke gener eller genomisk regioner slettes, redigeres eller markeret med effektivitet og lethed. CRISPR-Cas9-baseret gen-redigering er nu fremstår som den foretrukne metode til undersøgelse af genotype-fænotype relationer i forskellige celletyper på grund af enkelhed, effektivitet og bred anvendelighed af denne teknik. CRISPR-Cas9-baserede metoder bliver også metoden til valg i AML, ikke kun for spørgekriterierne enkelte gener, men også som en måde til at målrette flere gener i klædt eller poolede genetiske skærme med henblik på at undersøge flere gener parallelt som potentielle AML-afhængigheder4,5,6.
I dette manuskript beskriver vi en simpel konkurrencedygtig vækst assay for måling af virkningen af gen-forstyrrelser på væksten af AML celler, baseret på stabile CRISPR-Cas9-medieret gen-redigering efterfulgt af høj overførselshastighed flowcytometri. Denne metode er enkel, effektiv og skalerbar til medium-overførselshastighed eksperimenter for at undersøge rollen af flere gener parallelt i AML celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generere AML celle linje kloner med højt udtryk af stabile og aktiv Cas9
- Produktion af Cas9 lentivirus
- Dag 0: Plade 4 x 106 293T celler i 10 mL af DMEM med 10% føtal bovint serum (FBS) og penicillin og L-glutamin i en 10 cm vævskultur fad i en biosikkerhed niveau 2 (BSL2) certificeret celle kultur hætte. Placer fadet i et 37 ° C inkubator.
- Dag 1: Forgyldt 293T celler bør være 70 – 80% sammenflydende på dag 1. Udføre Transfektion ved hjælp af følgende protokol om eftermiddagen.
- Varm Transfektion medium, dyrkningsmedier og Transfektion reagens til stuetemperatur. Tø alle nødvendige plasmider for Transfektion.
- Mix 9 µg for psPAX2, 0,9 µg for pMD2.G og 9 µg for pLenti-Cas9 plasmider med 500 µL af Transfektion medium på en 5 mL tube.
- Der tilsættes 1,7 mL Transfektion medium til en 14 mL rund bund tube. Tilføje 57 µL Transfektion reagens direkte til Transfektion medie i røret for at undgå at berøre mur af røret.
- Forsigtigt tilføje hele plasmid mix til Transfektion reagens løsning og bland ved forsigtigt at trykke røret på siden. Inkuber blanding ved stuetemperatur i 20-30 min. I mellemtiden, ændre mediet fra seedede 293T plade.
- Tilføje Transfektion mix dråbevis til pladen og forsigtigt rock plade sidelæns for effektiv blanding. Pladen anbringes i et 37 ° C inkubator.
- Dag 2: Aspirér supernatanten fra Transfektion plade forsigtigt at cellerne ikke er forstyrret eller fortrængt fra pladen. Supernatanten. Der tilsættes 10 mL af frisk 10% DMEM medium ved forsigtigt at skyde ned fra siderne af pladen at undgå løs cellerne.
- Dag 3: Indsamle virus indeholdende supernatanten fra Transfektion plade langsomt ved at trække det ind i en 10 cm steril sprøjte. Efter supernatanten er indsamlet ind i sprøjten, fastgør et sterilt 0,45 µM filter til sprøjten og hold sprøjten og filter over et frisk, sterile 15 mL polypropylen koniske rør. Forsigtigt styrte i sprøjten for at filtrere de virus, der indeholder supernatanten gennem et 0,45 µM filter ind i 15 mL polypropylen koniske rør.
- Gemme den virale konditioneret medium i delprøver af 2 mL i 2 mL cryovials ved-80 ° C.
- Transduktion af AML cellelinjer
- Dag -1: Fortyndes 1 mg/mL rekombinant humant fibronektin fragment materiel til 10 µg/mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Coat en ikke-vævskultur behandlet 6 godt plade med 2 mL af 10 µg/mL rekombinant humant fibronektin fragment brugsopløsning i et BSL2 godkendt celle kultur hætte. Wrap pladen i klamrer wrap til at undgå tab ved fordampning og opbevares ved rumtemperatur natten over.
- Dag 0: Tø viral supernatanten indeholdende Cas9. Opsug den Rekombinante humane fibronektin fragment løsning helt fra belagt pladen lige før spinfection. Der tilsættes 2 mL af viral konditioneret medium med Cas9 til pladen og spinde det på 1.300 x g i 90 min. ved 35 ° C. Dette hjælper viruspartikler tillægger spinfected godt.
- I mellemtiden, tælle celler til at være transduced og spin-ned 2 x 106 celler i en 15 mL polypropylen koniske rør. Opsug supernatanten og resuspenderes i 2 mL frisk dyrkningsmedier.
- Efter spinfection, fjerne alle de viral supernatanten fra spinfected godt og kassér. Retroviral partikler fra supernatanten er knyttet til bunden af spinfected godt. Dette godt, tilsæt 2 x 106 celler genopslemmes i 2 mL medium af skridt ovenfor.
- Spin plade igen på 1.300 x g meget kortvarigt (1-2 min) tilstrækkelige til, at cellerne til at slå sig ned i bunden. Læg pladen tilbage i inkubatoren og lad natten til transduktion med spinfected viruspartikler knyttet til brønden.
- Dag 1: Afhængigt af celle tæthed, tilføje flere medium til de transduced celler til at undgå tilgroning.
- Dag 2: Da pLenti-Cas9 plasmid har en Blasticidin modstand markør, tilføje Blasticidin på en 10 µg/mL dosis til transduced og untransduced (kontrol) MOLM13 eller musen MLL AF9 leukæmiceller for udvælgelse af Cas9 udtrykker celler.
Bemærk: Blasticidin udvalg af de Cas9-transduced MOLM13 eller MLL AF9 leukæmiceller er betragtes som komplet, når alle untransduced kontrol celler er blevet elimineret. For cellelinjer end MOLM13 og MLL AF9 leukæmi, skal en dosis responskurve foretages forud for dette eksperiment således at en optimal dosis kan være ansat. Titrering af viral supernatanten kan også udføres i tilfælde af lav-transduktion priser.
- Klon udvalg af high-Cas9 udtrykker celler.
Bemærk: Vi har bemærket, at i nogle AML cellelinjer, klon udvalg ikke kan være nødvendigt: bulk Cas9-Blasticidin vælges befolkning allerede har høj genom-redigering effektivitet. I dette tilfælde er det muligt at springe trin 1.3 og gå videre til trin 1.4 at vurdere Cas9 udtryk i bulk Cas9-blasticidin AML celler af western blotting. Det ville stadig være vigtigt at evaluere gen-redigering effektivitet i disse bulk Cas9-AML celler (trin 1,5), før du fortsætter til konkurrence-assays. Vi formode, at udvælgelsen af enkelt high-Cas9 kloner reducerer genom-redigering variabilitet, hvilket er særligt vigtigt, når du tester en række forskellige enkelt guide RNA'er (sgRNAs).- Udføre en enkelt celle slags Cas9-Blasticidin vælges MOLM13 og MLL AF9 leukæmiceller fremover kaldet MOLM13-Cas9 og MLL AF9 Cas9 celler, henholdsvis ved hjælp af en FACS sorteringsanlæg indeholdt i et BSL2 godkendt hætte. Sorteringen kan udføres i 5-10 rund bund væv kultur behandlede 96 godt plader.
- Endnu en enkelt MOLM13-Cas9 og MLL AF9 Cas9 kloner er blevet plukket og individuelt opkaldt, udvide 10 – 20 kloner med 10 µg/mL af Blasticidin i kultur medier at sikre opretholdelsen af Cas9 udtryk.
- Udtrykket check af stabile Cas9 protein af immunoblotting.
- Gøre nukleare ekstrakter af alle Blasticidin udvalgte kloner i MOLM13 og MLL AF9 leukæmi bruger nukleare udvinding Kit som pr fabrikantens protokol. Check Cas9 protein udtryk ved hjælp af anti-Flag M2 antistof siden Cas9 i pLenti-Cas9 plasmid er knyttet til en N-terminale Flag epitop.
- Indlæse 50 µg af total protein fra hver nukleare ekstrakt på 10% Bis-Tris gel og Kør gelen på 120 V indtil øverste bands er godt adskilt.
- Blokere membran med 5% mælk løsning i TBST buffer for 1 h.
- Inkuber membran med 1:1,000 fortynding af anti-Flag M2 antistof i en endelig koncentration på 1 µg/mL ved 4 ° C natten over.
- Næste dag, vaske membran med TBST buffer og inkuberes med HRP konjugerede anti-mus sekundær antistof på en fortynding af 1:5,000 (endelig koncentration af 0.16 µg/mL) ved stuetemperatur i 1 time.
- Vaske membran grundigt med TBST og udvikle den skamplet, ved hjælp af ECL substrat.
- Pick 3 – 4 kloner med den højeste protein udtryk for Cas9, som ses ved Western blotting for yderligere funktionel analyse (figur 1).
- At sikre høj Cas9 aktivitet i udvalgte kloner
- Forberede lentiviral supernatanten fra en sgRNA kodning vektor med sgRNAs rettet mod menneskelige eller mus AAVS1 safe-harbor locus, som beskrevet i trin 1.1.
- Transduce top Cas9-udtrykker MOLM13 eller MLL AF9 leukæmi kloner med anti-AAVS1 sgRNA lentiviral supernatanten ved hjælp af metoden spinfection beskrevet ovenfor. Vælg med 2,5 µg/mL Puromycin i 4 dage.
- Rense genomisk DNA fra MOLM13-Cas9 eller MLL AF9 Cas9 leukæmi klonerne efter Puromycin udvalg sammen med respektive wild-type kontrolelementer ved hjælp af genomisk DNA udvinding kit ifølge producentens anvisninger. Brug 50 ng af DNA som en skabelon til at udføre en PCR med AAVS1_test_primers ved hjælp af 2 x master mix af Taq-Polymerase og PCR plan listet i tabel 1.
- Køre PCR produkt på en 2%-agarosegel og gel-rense 268 basepar bandet ved hjælp af en gel udvinding kit som pr fabrikantens protokol. Sanger sekvens gelen renset PCR produkt ved hjælp af AAVS1_target-frag_F-primer.
- Vurdere redigering effektiviteten ved sammenligning af AAVS1 redigeret og vildtype sekvenser ved hjælp af online web-baseret værktøjer (figur 2).
2. kloning og transduktion af sgRNAs i AML-Cas9 celler
-
Medium-overførselshastighed kloning af sgRNAs
- Design 4 – 6 sgRNAs for gen af interesse ved hjælp af en web-baseret CRISPR design software. Der findes en række CRISPR designværktøjer online såsom http://crispr.mit.edu/ som genererer sgRNA sekvenser baseret på en input DNA-sekvens.
- Angiv en passende oplysninger i felter med stjerner. Klik på target genom for sgRNA design. Indsæt target sekvens i boksen rækkefølge og klik på Send -knappen.
- For kloning i pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA udtryk plasmid, prepend nukleotider "CACC" forstand oligo og "AAAC" til den omvendte suppleret antisense oligo før du bestiller. Ordre forblandet følelse og antisense oligos i en 96-brønd plade mærket Oligo-Mix fra en oligonukleotid syntese selskab.
Bemærk: Vi har gjort brug af pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmidet, som har BbsI begrænsning websted for sgRNA kloning. I tilfælde af andre sgRNA udtryk plasmider er brugt, skal udhæng anvendes til sgRNA oligonukleotider ændres i overensstemmelse hermed. - Tage en separat U 96-brønd bundplade mærket Udglødning plade. Gøre en master mix af 1 µL T4 PNK, 1 µL af 10 x T4 DNA ligatur buffer og 6 µL vand pr. udglødning reaktion.
- Tilføje 8 µL af den master mix til hvert hul i den udglødning plade. Tilføj 1 µL af 100 µM, følelse og antisense oligo (eller 2 µL af blandet følelse-anti-sense oligos) til master mix. Der afpipetteres 2 – 3 gange forsigtigt for at blande godt, spin plade kort for at få blandinger til bunden af brøndene.
- Brug følgende udgloedning program på en PCR-maskine: 30 minutter ved 37 ° C, 2 min 30 s ved 95 ° C efterfulgt af langsom afkøling til 22 ° C med en hastighed på 0,1 ° C/s. Efter glødning, tage en frisk 96-brønd plade mærket Fortyndet OligoMix. I denne plade, fortyndes den fosforyleres og udglødet oligos fra ovenstående reaktion med vand (1:200) ved hjælp af en multikanalpipette.
- Digest 5 µg for pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektor med 1,5 µL af BbsI begrænsning enzym (10.000 enheder/mL) ved hjælp af en passende buffer ved 37 ° C i 2 timer til at linearize det for ligatur senere.
- Tag en frisk 96 godt plade mærket Ligatur plade og tilføje 20 ng af BbsI fordøjet pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektor til en brønd pr. ønskede sgRNA ligatur. Til dette, skal du tilføje 2 µL af fosforyleres, udglødet oligos fra den Fortyndede OligoMix plade.
- Tilføj 1 µL af 10 x T4 ligase buffer og 1 µL af T4 DNA Ligase enzym. Forsigtigt afpipetteres med en multikanalpipette og inkuberes ligatur mix ved stuetemperatur i 2 timer.
Bemærk: Ligatur blander kan opbevares ved-20 ° C for transformation trin senere. - I mellemtiden, tø 90 µL af kemisk kompetente E. coli celler på is 10 min før slutningen af trinnet ligatur.
- Ved hjælp af en multikanalpipette gøre 10 µL delprøver af de kompetente celler i hver brønd med en separat 96 godt plade.
- Tilføje ligatur blanding fra trin 2.1.8 til den godt med de kompetente celler, pipetteres op og ned forsigtigt og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
- Pipette 5 µL af bakterier-DNA mix direkte fra ovenstående reaktion i en 6 godt plade der indeholder LB-agar med 100 µg/mL Ampicillin. Gentag for hver af transformation reaktionerne.
- Plade hver transformation reaktion i en særskilt mærket godt af en 6-godt plade. Tilføje ca 5-8 glasperler til hver godt og ryste hele 6-godt plade 8 – 10 gange i en cirkulær bevægelse.
- Vælge 1 – 2 enkelt kolonier fra hver brønd med en steril 20 µL pipette spids og streak det ind i en nøje mærket spot på en steril 10 cm petriskål med LB agar og 100 mg/mL Ampicillin. Efter striber i LB-tallerkenen, blot skubbe spidsen bruges til klon striber i 3 mL af LB-Ampicillin indeholdende medium i en 14 mL rund bund tube markeret med det tilsvarende bakterielle klon nummer.
- Send den bakterielle plade direkte til Sanger sekventering med menneskelige U6 promotor fremad primer.
- Efter sekvens bekræftelse af klonede sgRNAs, rense DNA fra den tilsvarende 14 mL rør ved hjælp af en mini prep kit ifølge producentens anvisninger.
- Måle koncentrationen og kvaliteten af hver af mini-preps med et spektrofotometer. Normalisere hver mini prep til en koncentration på 15 ng/µL og pipette til en 96 godt plade mærket sgRNA kloner plade.
Bemærk: Denne plade kan opbevares ved-20 ° C eller bruges direkte til virus forberedelse.
- Design 4 – 6 sgRNAs for gen af interesse ved hjælp af en web-baseret CRISPR design software. Der findes en række CRISPR designværktøjer online såsom http://crispr.mit.edu/ som genererer sgRNA sekvenser baseret på en input DNA-sekvens.
-
Viral produktion af sgRNA konstruktioner og transduktion
- Produktion af sgRNA lentiviral partikler i 96-brønds format, ved at følge den "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput Viral produktion (96 godt)" protokol fra den genetiske undertrykkelse af netbårne Platform (GPP web Portal) af instituttets brede (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/Gpp/Public/Resources/Protocols).
- Overføre 200 µL af viral supernatanten til sterile rør og fryse ved-80 ° C umiddelbart.
- Dag -1: Coat en flad bund ikke-væv kultur behandlet 96 godt plade med 100 µL af rekombinant humant fibronektin fragment ved en koncentration på 10 µg/mL i et BSL2 celle kultur hætte. Wrap pladen ved hjælp af klamrer wrap at undgå fordampning tab og lad det på bænken natten over.
- Dag 0: Fjern rekombinant humant fibronektin fragment fra hver brønd. Tø viral supernatanten af hver sgRNA ved stuetemperatur. Tilføje 50 µL af viral supernatanten fra hver tube til hver belagt godt af transduktion plade. Spin transduktion pladen på 1.300 x g i 90 min. ved 35 ° C.
- I slutningen af spinfection, tælle MOLM13-Cas9 (klon B3) celler fra kultur kolben. Bruge 10.000 celler pr. brønd i 100 µL volumen. Tælle celler for alle transduktion wells, tager hensyn til dødvolumen.
- Efter 90 min spinfection, Fjern supernatanten fra alle brønde med en multikanalpipette justeres til 50 µL langsomt ved at vippe pladen. Tilføje 100 µL af MOLM13-Cas9 klon B3 celler kultur til hver godt langsomt glide ned fra randen.
- Spin plade på 1.300 x g i 2 min. ved 35 ° C og lad cellerne bosætte sig på bunden. Overføre pladen til 37 ° C vævskultur grade inkubator.
- Dag 1: Tilføje 100 µL af frisk medium til hver godt indeholdende sgRNA transduced Cas9-MOLM13 eller Cas9 MLL AF9 leukæmi celler således, at den endelige medium volumen er 200 µL.
3. konkurrencedygtige vækst Assay
- Dag 3: 72 h (dag 3) post transduktion, kontrollere procentdelen af sgRNA indeholdende BFP positive celler i hver brønd ved flowcytometri (FACS). Brug en celle levedygtighed farvestof til at markere og udelukke døde celler fra analysen.
- Fortsætte igen plettering en andel af cellerne i nye brønde med friske medium efter hver FACS-analyse til at undgå tilgroning under analysen.
-
Gentag FACS-analyse hver 2-3 dage for at kontrollere den relative andel af BFP positive (BFP + ve) celler i forhold til BFP negativ (BFP-ve) modparter (figur 3). Analysere procentdelen af BFP positive celler for hvert tidspunkt (ved hjælp af FlowJo eller lignende FACS analyse software).
- Træk Fcs filer for hver prøve til FlowJo software. Dobbeltklik på enhver én prøve fil og plot en dot skamplet af forward scatter (FSC) vs Side scatter (SSC) med FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen. Gate alle celler.
- Dobbeltklik på de indhegnede celler og plot dem på levedygtighed pletten (på Y-aksen) vs FSC højde (H) eller område (A) dot skamplet. Gate levedygtighed pletten negative (live) celler.
- Dobbeltklik på gated levende celler og plot BFP (på Y-aksen) vs FSC (A) på X-akse. Gate BFP + ve celler. Gælde alle disse porte for alle prøver ved at trække den valgte stikprøve til Alle prøver under gruppen under fanen.
- Klik på Tabel Editor til at foretage en analyse tabel over alle prøver. Træk BFP + ve tæller fra én prøve til tabellen og klikke på knappen Display i Tabel Editor til at oprette en batch af alle prøver med et bord, der viser procentdelen af BFP + ve celler. Gem skemaet som en xls.
- Beregne den proportionelle stigning eller fald i % BFP positive celler i den levende celle befolkning over tid og sammenligne dette forhold til forholdet mellem BFP positive celler i kontrol sgRNAs (såsom luciferase, røræg eller normal god landbrugspraksis sgRNA).
- Afbilde forholdet mellem BFP positive celler for de forskellige sgRNAs herunder molekylærgenetisk interesse samt kontrol bruge dag 3 som oprindeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores undersøgelse transduced vi først MOLM13 menneskelige AML cellelinje, der bærer MLL AF9 omplantning med høj titer virus kodning Cas9-blasticidin lentiviral plasmid. I vores hænder beskrevet bulk usorteret MOLM13-Cas9 celler ikke vise højt niveau Cas9 udtryk af Western blotting og også ikke udføre godt når analyseres for effektiv gen redigering-ved hjælp af metoden tidligere7. Derfor, vi fortsatte med at etablere enkelt celle kloner og kun vælge kloner med høje niveauer af Cas9, som ses ved Western blotting (figur 1). Vi tog 2 forskellige kloner og transduced dem med sgRNAs rettet mod et websted i AAVS1 safe-harbor locus som beskrevet tidligere7. Ved hjælp af genomisk DNA ekstraheret fra Puromycin-udvalgte MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA kloner, vi udførte en PCR ved hjælp af primere spænder AAVS1 sgRNA skære websted og sanger sekventeret et bestemt 268 bp PCR produkt fra 10 isolerede kolonier for hver MOLM13 klon. Efter justering med forældrenes sekvensen fandt vi, at MOLM13-Cas9 klon B3 og MLL AF9 Cas9 klon 8 havde en effektivitet på 100% (data ikke vist). Vi valgte derefter disse kloner viser høj Cas9-medieret genom-redigering kapacitet for vores sgRNA konkurrence assays. Mens disse undersøgelser blev gennemføres, blev web-baseret værktøjer for hurtigt test genom-redigering effektivitet fra Sanger sekvenser udviklet af forskellige grupper som TIDEVANDET8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) eller is (https://ice.synthego.com/#/). Disse værktøjer gør det ekstremt nemt og omkostningseffektivt at vurdere genom-redigering effektivitet uden at klone enkelte fragmenter og udføre sekvenseringen af flere kloner. Bulk Cas9-udtrykker celler bør derfor først testes for genom-redigering effektivitet ved hjælp af disse metoder. Genom-redigering effektivitet er høj, er så enkelt celle kloning ikke nødvendig. Også, i tilfælde af at enkelt celle kloning er nødvendigt set i vores studier, disse web-baseret mutationsmønstre frekvens skøn værktøjer tilbyder en meget hurtigere metode til at teste flere kloner parallelt.
For sgRNA kloning, vi gjorde brug af sgRNA kloning plasmidet pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, som havne en blå fluorescerende proteiner (BFP) til at spore sgRNA transduced celler og et RNA-Polymerase III-drevet menneskelige U6 promotor der driver udtryk for de klonede sgRNAs sammen med sporstof RNA (tracRNA) stillads. Vi brugte dette system til at klone 2 sgRNAs rettet mod DOT1L, et protein kendt for at spille en vigtig rolle i den epigenetiske regulering af genekspression. DOT1L er en Histon methyltransferase, at indskud mono-, di- og tri-methylering på target gener9,10. Undersøgelser har vist, at DOT1L spiller en vigtig rolle i AML drevet af MLL-fusion onkogener. Derfor forventes DOT1L knockout ved hjælp af CRISPR-Cas9 at medføre væsentligt forringer mus MLL AF9 leukæmi celledelingen i overensstemmelse med tidligere undersøgelser11,12,13,14. Vi brugte to sgRNAs rettet mod AAVS1 safe harbor locus, som er i intronnet af PPP1R12C-genet. sgRNAs producerer genomisk ændringer i dette websted er ikke kan have nogen indvirkning på den proliferative kapacitet af MLL-leukæmi cellelinjer. Som positiv kontrol klonet vi sgRNAs målretning DNA replikation-associerede gen RPA3. RPA3 er en pan-væsentlige gen, der har vist sig at være vigtig for spredningen af flere AML celle linjer4,15,16 . Anti-RPA3 sgRNAs derfor vise stærke anti-proliferativ effekter i AML celler og anvendes typisk som positiv kontrol. Efter transduktion med anti-AAVS1 og anti-RPA3 sgRNA plasmider, vi målte den relative andel af BFP + ve sgRNA transduced celler i forhold til deres BFP-ve kolleger hver 2-3 dage i kultur (figur 3). Med den protokol, der er beskrevet ovenfor, resulterede transduktion af MOLM13 eller MLL AF9 AML celler i en 60-70% transduktion effektivitet med vores viral præparater, forlader de resterende 30 – 40% celler untransduced eller BFP-ve i hver brønd. Dette giver mulighed for undersøgelse af relative spredning af genom-redigeret celler med wild-type celler i samme godt. Proportional stigning eller fald i andelen af sgRNA transduced celler blev brugt som en foranstaltning til at afspejle den funktionelle effekt af sgRNA medieret gen-sletning i MOLM13-Cas9 celler. Hvis din gen af interesse er vigtigt for udbredelsen af test AML celler, vil så sgRNA-medieret afbrydelse af dette gen føre til den relative svækkelse af sgRNA-udtrykker BFP + ve celler i forhold til BFP-ve celler i løbet af analysen, sgRNAs rettet mod luciferase, normal god landbrugspraksis eller ikke-væsentlige gener vil bevare BFP + ve /-ve forhold over tid.
Bruger 2 separate anti-RPA3 sgRNAs, vi observeret en gradvis og betydelig nedgang i andelen af BFP + ve celler i forhold til BFP-ve untransduced modstykker. Derimod forblev procentdelen af anti-AAVS1 sgRNA udtryk for BFP celler relativt konstant over tid, viser at AAVS1 målretning har ingen effekt på udbredelsen af MOLM13 celler (figur 4a). På samme måde i mus MLL AF9 Cas9 celler testede vi virkningerne af sgRNAs rettet mod Rhodopsin (Rho1), øjet pigmentering genet som negativ kontrol og Dot1l, en epigenetisk regulator kendt for at være nødvendige for spredning af MLL AF9 leukæmiceller over tid . I denne undersøgelse, BFP + ve mus MLL AF9 Cas9 celler transduced med 2 separate anti-DOT1L sgRNAs viste en dramatisk og progressive tab over tid i forhold til BFP-ve sgRNA ikke-transduced celler (figur 4b). I modsætning hertil er forblev forholdet mellem anti-Rho1 sgRNA relativt uændret over tid. Disse resultater viser svagheden i den MLL AF9 udtrykker mus leukæmiceller til Dot1l udtynding, bekræfter tidligere offentliggjorte resultater.
Figur 1: repræsentant Western skamplet resultater viser forskellige Cas9 niveauer. Enkelt celle kloner af linjen MOLM13 AML celle transduced med CAS9 var probed for flag-Cas9 udtryk niveauer ved hjælp af anti-Flag antistoffer. Kloner viser det højeste udtryk for Cas9 blev udvalgt til yderligere undersøgelser. HEK293-T-celler transfekteret med et Cas9 udtryk plasmid blev anvendt som positiv kontrol og Cas9 ikke-transduced MOLM13 celler som negative kontroller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative analyse af genom-redigering på Dot1l locus vurderet af ICE analyse. En PCR-amplikon centreret omkring Dot1l sgRNA mål-webstedet blev Sanger sekventeret og analyseret ved hjælp af is analyse. En sammenligning af sgDot1l sekvens (orange linie) til ikke-øremærket DNA sekvens (grøn linje) viser det høje niveau af redigering effektivitet i sgDot1l målrettede celler omkring sgRNA mål-webstedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk arbejdsgang for de foreslåede metoder. sgRNAs er klonet i sgRNA udtryk vektor Co udtrykker en fluorescerende proteiner som BFP. Target-cellerne er transduced til 30-60% transduktion priser og efterfulgt af flowcytometri hver 2-3 dage. sgRNAs rettet mod gener kræves for AML celleproliferation vil vise relative udtynding over tid, som vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant resultat af konkurrencen assays i mennesker og mus AML celler. (en) resultaterne viser en statistisk meget betydelige progressiv tilbagegang i RPA3 transduced MOLM13-Cas9 klon B3 celler. Derimod har sgRNAs rettet mod webstedet AAVS1 ingen effekt. (b) sgRNAs rettet mod Dot1l vise en bemærkelsesværdig og progressive forfald i konkurrencedygtige spredning, i modsætning til sgRNAs målretning Rhodopsin (Rho). p > 0,05. p < 0,05. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af gennemsnit (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: generel beskrivelse af protokollen. (en) tid til hvert enkelt trin i produktionen af Cas9 virus og sgRNA kloning beskrevet. Design og kloning af sgRNAs kan udføres samtidig med at generere enkelt kloner af AML cellelinjer med stabile Cas9 udtryk. (b) generel protokol for transduktion af AML cellelinjer med sgRNAs og konkurrencedygtig vækst analyse ved hjælp af FACS er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Cykler | Varighed af cyklus | Temperatur |
| 1 | 2 min | 95 ºC |
| 35 | 30 s | 95 ºC |
| 30 s | 55 ºC | |
| 30 s | 72 ºC | |
| 1 | 5 min | 72 ºC |
| Hold | uendelig | 4 ºC |
Tabel 1: PCR program til AAVS1 locus forstærkning fra genomisk DNA. PCR program anvendes til forstærkning af AAVS1 locus fra genomisk DNA test skæring effektivitet af Cas9 i Cas9 at udtrykke kloner.
Supplerende fil: sgRNA oligo sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage en CRISPR-Cas9-baserede konkurrencedygtig vækst analyse for at undersøge rollen af kandidat gener i AML cellelinjer hjælp flowcytometri fra human/murine AML celler (figur 5). Målet med analysen er at identificere effekten af gen sletning på vedligeholdelse af AML celleproliferation over to til tre uger på en medium-overførselshastighed skala. Nogle kritiske trin skal følges nøje for at lette optrapning af den beskrevne protokol. I produktionen af Cas9 lentivirus er det nødvendigt at filtrere virus aircondition medium gennem et 0,45 µM filter for at undgå overførsel af 293T celler til virus indeholdende supernatanten. Under spinfection, indpakning spinfection plade med klamrer wrap eller parafilm hjælper undgå potentiel forurening under centrifugering. Wrap skal dog fjernes før du placerer spinfected plade tilbage i vævskultur inkubator. Det er meget vigtigt at vurdere Cas9-udtrykker kloner til redigering effektivitet. Kloner med lav-genom redigering effektivitet afspejler utilstrækkelige Cas9 aktivitet og kan påvirke succesraten for eksperimentet. I vores forsøg, vi først transduced menneskelige AML Cas9 kloner med sgRNAs målretning AAVS1 locus og sekventeret deres genomisk DNAs redigeringsværktøjer effektivitet. Sammenligning af AAVS1 redigeret og vildtype sekvenser kan vurderes ved hjælp af online web-baseret værktøjer som TIDEVANDET8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) eller is (https://ice.synthego.com/#/). Disse programmer sammenligne Sanger sekvens spor af potentielt redigerede PCR fragmentere til den uredigerede vildtype eller reference sekvens og anslå hyppigheden af ændringer. Dette er en hurtig måde at vurdere mutationsmønstre ændringer, der følger af test sgRNA, som er mål for cellulære Cas9 aktivitet. Alternativt, kloning af PCR produkt i en PCR-kloning plasmid som TOPO stump kloning vektor kan udføres, efterfulgt af Sanger sekventering af enkelte kolonier til at vurdere genom-redigering effektivitet af sekvens justering af hver klon til det Wild-type. Vi foretrækker den tidligere metode, givet sin lethed og omkostningseffektivitet i forhold til metoden kloning. Typisk, opdagelsen af basepar ændringer såsom punktmutationer, indels, osv., på eller omkring sgRNA skæring websted i et stort flertal af sekventeret kloner indikerer tilstedeværelsen af en meget aktiv Cas9. Dermed, vi har valgt MOLM13 eller MLL AF9 leukæmi kloner B3 og 8, henholdsvis med de højeste redigering effektivitet for yderligere eksperimenter.
Vi har designet sgRNAs rettet mod forskellige gener nævnt i protokollen ved hjælp af http://crispr.mit.edu/, en web-baseret software, der giver en liste over sgRNAs. Det anbefales at vælge top-scoring sgRNAs på listen for at fjerne dem med forudsagte off target effekter. Den designede sgRNAs kan klones ved hjælp af nogen af de publicerede protokoller som den om (http://www.addgene.org/67974/) hjemmeside. Fornuft og antisensstoffer oligos er først fosforyleret og udglødet pr. trin 2.1.5. Det første skridt ved 37 ° C er vigtigt for phosphorylating oligos med T4 kinase og efterfølgende PCR cyklusser er vigtige for Udglødning af fornuft og antisense oligonukleotider i dsDNA. Det er vigtigt at have en fluorescerende proteiner i sgRNA kloning vektor, som er afgørende for sporing sgRNA transduced celler senere i konkurrence-assays. sgRNA kloning er skaleret med brug af 96 godt plade på alle de skridt, herunder glødning og ligatur. Ligatur, rense PCR microtube strimler kan også bruges, da de er kompatibel med multikanal pipetter. I tilfælde at omdannelsen af et større sæt af sgRNA kloner er nødvendig, en 96-brønd plade i hvilke 10 μL af kompetente celler er præ-aliquoted i hver brønd og frosne ved-80 ° C kan bruges til at fremskynde hele processen. Formålet med plating ligatur reaktioner er at plukke enkelte kolonier, som er vanskelig at udføre i 96-brønds format. Derfor, for bakteriel omdannelse, der er en lille tab i skalerbarhed. Stadig, selv for plating transformation reaktioner fra en hele 96-brønd plade, det kræver kun en alt seksten 6-godt plader for hele projektet. Man må være forsigtig i det næste trin i picking kolonier fra transformation plader. Mens striber en koloni på en mærket spot, sikre, at stedet er klart adskilt fra de andre steder. Mærkning et firkantet gitter i bunden af petriskålen med en mørk permanent markør hjælper med at forhindre krydskontaminering af bakteriel kloner.
Når minipreps af sgRNA konstruktioner er klar, kan virus foretages i 96-brønds format. På dette niveau af overførselshastigheder er det upraktisk at filtrere 200 µL af virus indeholdende supernatanten. Derfor bør viral supernatanten fryses mindst natten til at undgå krydskontaminering fra 293T celler fremført i supernatanten. Det kan også være gemt i 50 µL delprøver i sterile PCR rør strips til at undgå at fryse optøning af supernatanten. Yderligere, disse virus aircondition analysere bruges til transducing AML celler. I tilfælde af at lave titers af viral transduktion overholdes, som vurderet af lav frekvens af BFP + ve celler, så kan det være vigtigt at fastlægge viral titer og test transductions på forskellige mangfoldighed af infektioner (MOI) at sikre 40-60 procent transduktion priser. Viral titer beslutsomhed og MOI beregning er beskrevet i detaljer her17. I konkurrence analyse, som beskrevet i trin 3 i protokol, er det meget vigtigt at udelukke ikke-levedygtige celler for at forhindre falske artefakter fra auto-fluorescens under analyse af BFP til ikke-BFP forholdet. På tidspunktet for FACS, før analysere prøver, anbefales brug af BFP negative og BFP positive kontroller stærkt at præcist indstille spændinger. For hver ny forkromning tidspunkt afhænger mængden af celler til at være re forgyldt koncentration af celler på det givne tidspunkt. Vi typisk forgyldt re 20 μL fra ialt 200 μl på hvert tidspunkt i en frisk brønd med 180 μL af frisk medium. Grundig blanding af celler af pipettering forsigtigt op og ned lige før re plating er stærkt anbefales. Typisk, vi har observeret, at analysen skal udføres over 15-20 dage til varsel stærk ændringer i BFP + ve /-ve nøgletal, selvom dette varierer fra gen til gen.
Denne eksperimentelle set-up er velegnet til at teste flere gener parallelt i flere AML cellelinjer til hurtigt identificere rolle af kandidat gener i overlevelse eller spredning af AML celler. En advarsel af konkurrencedygtige spredning analysen beskrevet her er, at det ikke betragter potentielle celle-ydre faktorer såsom paracrine signalering begivenheder fra gen-målrettede celler, der kan påvirke den ikke-øremærket celle befolkning inden for samme godt. Selv om dette kan være en sjælden begivenhed, bør denne faktor tages i betragtning, når der udføres dette assay. Selv om vi har brugt AML som et eksempel for de CRISPR-Cas9-baserede konkurrence assays beskrevet i dette manuskript, denne metode kan bruges til enhver cancer cellelinie til at identificere rollen af flere gener i parallel. Der er forskellige fordele ved gen-sletning ved hjælp af CRISPR-Cas9 over gen-knockdown ved hjælp af RNA-interferens. For det første, i modsætning til shRNAs, der typisk viser en bred vifte af target mRNA hæmning, sgRNAs kombineret med Cas9 nukleasen effektuere komplet knockout af target gener. Dette kan resultere i mere dramatiske og konsekvent fænotyper med CRISPR-Cas9-baserede metoder, selv om det skal være advaret om at målrette effektiviteten af individuelle sgRNAs samt shRNAs kan variere meget.
Flow-flowcytometri-baserede konkurrence analyse tilbyder flere fordele frem for traditionelle spredning assays hvor et fast antal celler er belagt for at måle den relative proliferative aktivitet af gen-bestyrtet celler. En fordel er, at den relative proliferative aktivitet af celler kan nemt og hurtigt måles ved flowcytometri i flere dage, omgåelse behovet for celle tælle hvert plating trin. Dette er nyttigt, når test et stort antal kandidat sgRNAs rettet mod flere gener, som tæller alle brøndene er besværlig og kan føre til unøjagtigheder. I modsætning til, ATP-baseret måling-undersøgelser for cellevækst, flowcytometri kan udføres på et udsnit af levende celler, hvilket gør denne metode nyttigt for langsigtet analyse. Dette er især gavnligt i studiet af faktorer såsom epigenetiske modulatorer, som kan vise sent virkende effekter på udbredelsen af AML celler og kan kræve langsigtede assays. Tilstedeværelsen af ikke-transduced celler inden for samme tillader andet godt en velkontrollerede celle population, der kan bruges til at angive den oprindelige plan for analysen. For det tredje, når set-up i 96-brønds format, analysen kan næsten helt gennemføres ved hjælp af multi-kanal pipetter, væsentligt fremskynde hele processen fra kloning af sgRNAs virus forberedelse og til sidst flow-cytometric vurdering af fluorescens.
Metoden beskrevet her kan være effektivt skaleres op til undersøgelse af op til 96 sgRNAs parallelt i en klædt skærmen. Forudsat, at 4-6 sgRNAs pr. gen, kan denne metode derfor bruges til hurtig afhøring af mindst 16-24 gener i parallel. I tilfælde af større antal gener, som et hele molekylære vej, der skal være afhørt i AML celler, vil samlet CRISPR-Cas9-baserede skærme være mere nyttigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.J.D er en konsulent til A2A pharmaceuticals (New Jersey) og Salgomed terapi (San Diego). Andre forfattere har ingen konflikter til at erklære.
Acknowledgments
PCW-Cas9 plasmid var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmid fra Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vil gerne takke flowcytometri core på SBP medicinske opdagelse Institute for rettidig hjælp med flow analyse og sortering. Vi vil gerne anerkende støtten af Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi vil gerne også anerkender støtten fra de følgende finansieringskilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsoreret Grant, V-Foundation og San Diego NCI Cancer Centre (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).
