Summary
Dit manuscript wordt een geclusterde regelmatig Interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) CRISPR-Cas9-gebaseerde methode voor eenvoudige en snelle onderzoek van de rol van meerdere kandidaat-genen in Acute myeloïde leukemie (AML) celproliferatie in beschreven parallel. Deze techniek is schaalbaar en kan worden toegepast in andere kanker cel beeldlijnen.
Abstract
Gene perturbation studies zijn uitvoerig gebruikt om de rol van afzonderlijke genen in AML pathogenese te onderzoeken. Voor het bereiken van volledige gene verstoring, hebben veel van deze studies gebruik van complexe gene knock-out modellen. Deze studies met knock-out muizen bieden een elegante en beproefde systeem voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties, een snelle en schaalbare methode voor de beoordeling van kandidaat-genen die spelen een rol in AML celproliferatie of overleven in AML modellen zal helpen versnellen de parallelle ondervraging van meerdere kandidaat-genen. Recente vooruitgang in de genoom-bewerken technologieën hebben ons vermogen tot het uitvoeren van genetische verstoringen op een ongekende schaal dramatisch verbeterd. Een dergelijk systeem voor het bewerken van het genoom is de CRISPR-Cas9-gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het maken van snelle en effectieve wijzigingen in het genoom van de cel doelgroep. Het gemak en de schaalbaarheid van CRISPR/Cas9-gemedieerde gen-verwijdering maakt het een van de meest aantrekkelijke technieken voor de ondervraging van een groot aantal genen in fenotypische testen. Hier presenteren we een eenvoudige test met behulp van CRISPR/Cas9 gemedieerde gen-verstoring gecombineerd met hoge gegevensdoorvoer stroom cytometry-gebaseerde mededinging testen te onderzoeken van de rol van genen die een belangrijke rol in de verspreiding spelen kan of overleving van mens en lymfkliertest AML cellijnen.
Introduction
De afgelopen decennia hebben gezien tal van onderzoeksinspanningen gericht op het identificeren van de bijdrage van belangrijke moleculaire pathways in acute myeloïde leukemie (AML) pathogenese. Traditioneel, is gen-verstoring van AML cellen uitgevoerd met behulp van voorwaardelijke knock-out muizen of korte-haarspeld RNA (shRNA). Terwijl de knock-out muizen bieden een geavanceerde systeem voor spatio-temporele controle van gen-verwijdering, is het genereren van gene knock-out muizen arbeidsintensief, tijdrovend en duur. Bovendien, gen-uitsparingen met behulp van recombinatie strategieën is niet gemakkelijk schaalbare; deze strategieën doen niet lenen zich goed voor de ondervraging van meerdere genen in parallel. Na de ontdekking van RNA interferentie methoden om endogene mRNAs knock-down met Klein Mengend RNA (siRNA) of shRNA, vele groepen gestart met behulp van RNA interferentie technieken te onderzoeken van de rol van specifieke genen in AML. Aangezien zowel menselijke als lymfkliertest AML cellen zijn notoir moeilijk te transfect met behulp van traditionele lipide gebaseerde transfectie methoden, bestudeert de meeste werknemers lentivirally of retrovirally-gecodeerde shRNA voor het bestuderen van de genfunctie in AML cellen. De recente ontdekking van geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) en de bijbehorende Cas nucleasen (CRISPR-Cas9) heeft een revolutie teweeggebracht in gentargeting technologieën1,2,3. Met behulp van CRISPR-Cas9, specifieke genen of genomic regio's kunnen worden verwijderd, bewerkt of gelabeld met efficiëntie en gemak. CRISPR-Cas9-gebaseerde gen-bewerken is nu in opkomst als de methode van keuze voor het onderzoeken van genotype-naar-fenotype relaties in diverse celtypen te wijten aan de eenvoud, doeltreffendheid en brede toepasbaarheid van deze techniek. CRISPR Cas9-gebaseerde methoden zijn ook steeds de methode van keuze in AML, niet alleen voor afzonderlijke genen ondervragen, maar ook als een manier om zich te richten op meerdere genen in gekleed of gegroepeerde genetische schermen gericht onderzoekt verschillende genen parallel als potentieel AML-dependencies4,5,6.
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige concurrerende groei assay voor het meten van de impact van gen-verstoringen op de groei van AML cellen, gebaseerd op stabiele CRISPR-Cas9-gemedieerde gene bewerken gevolgd door high-throughput stroom cytometry. Deze methode is eenvoudig, efficiënt en schaalbaar tot middellange-doorvoer experimenten om de rol van meerdere genen parallel in AML cellen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. genereren AML cel lijn klonen met hoge uitdrukking van stabiele en actieve Cas9
- Productie van Cas9 lentivirus
- Dag 0: Plaat 4 x 106 293T cellen in 10 mL DMEM met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline en L-glutamine in een 10 cm weefselkweek schotel in een biosafety Level 2 (BSL2) gecertificeerd cel cultuur kap. Plaats de schotel in een 37 ° C incubator.
- Dag 1: De vergulde 293T cellen moet 70 – 80% heuvels op dag 1. Het uitvoeren van de transfectie met behulp van het volgende protocol in de middag.
- Warm de transfectie medium, cultuurmedia en transfectiereagens tot kamertemperatuur. Ontdooi de vereiste plasmiden voor Transfectie.
- Mix 9 µg psPAX2, 0.9 µg van pMD2.G en 9 µg lolploeg-Cas9 plasmiden met 500 µL van transfectie medium in een tube van 5 mL.
- Voeg 1,7 mL van transfectie medium een 14 ml ronde onderkant buis. Voeg 57 µL van transfectiereagens direct in het medium van de transfectie in de buis om te voorkomen dat de wand van de buis aan te raken.
- Zachtjes de hele plasmide mix Voeg tot oplossing van de reagens van de transfectie en meng door zachtjes te tikken op de buis aan de kant. Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 minuten inwerken. Ondertussen, verandert het medium van de geplaatste 293T plaat.
- De transfectie mix ontkleuring toevoegen aan de plaat en zachtjes rock de plaat zijwaarts voor het efficiënt mengen. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator.
- Dag 2: Gecombineerd het supernatant van de transfectie plaat voorzichtig zodat de cellen niet worden verstoord of van de plaat verdreven. Verwijder het supernatant. Voeg 10 mL van vers 10% DMEM medium door te schuiven naar beneden voorzichtig van de zijden van de plaat om te voorkomen dat loskomt van de cellen.
- Dag 3: Verzamelen het virus supernatans van de transfectie plaat langzaam bevattende voor het tekenen in een steriele injectiespuit van 10 cm. Na het verzamelen van de bovendrijvende vloeistof in de spuit, een steriele 0,45 µM filter koppelen aan de spuit en de spuit en de filter op een vers, steriele 15 mL polypropyleen conische buis houdt. Zachtjes duik de spuit om te filteren van het virus met bovendrijvende vloeistof door het 0,45 µM filter in de polypropyleen conische buis 15 mL.
- Het virale geconditioneerde medium opslaan in porties van 2 mL in 2 mL cryovials bij-80 ° C.
- Transductie van AML cellijnen
- Dag -1: Verdun 1 mg/mL recombinante menselijke fibronectine fragment voorraad tot 10 µg/mL met steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Jas een niet-Weefselkweek behandeld 6 goed plaat met 2 mL van de werkoplossing voor recombinante menselijke fibronectine fragment van 10 µg/mL in een BSL2 goedgekeurd kap voor de cultuur van de cel. Wikkel de plaat in zelfklevende wrap om verlies te vermijden op de verdamping en winkel bij kamertemperatuur 's nachts.
- Dag 0: Ontdooien het virale supernatant met Cas9. De recombinante menselijke fibronectine fragment oplossing volledig van de beklede plaat vlak voor spinfection gecombineerd. Voeg 2 mL virale geconditioneerde medium met Cas9 aan de plaat en draai het bij 1300 x g gedurende 90 min bij 35 ° C. Dit helpt de virale deeltjes hechten aan de spinfected goed.
- Ondertussen rekenen de cellen die moeten worden getransduceerde en spin down 2 x 106 cellen in een polypropyleen conische tube van 15 mL. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver vers voedingsbodems.
- Na spinfection, alle van de virale bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de spinfected goed en gooi deze weg. Retrovirale deeltjes uit het supernatant zijn gekoppeld aan de onderkant van de spinfected goed. Daartoe moet u goed, de 2 x 106 cellen geresuspendeerde in 2 mL zuiver medium uit de stap hierboven toevoegen.
- Draai de plaat weer bij 1300 x g kort (1-2 min) toereikend is om de cellen te settelen onderaan. Plaats de plaat terug in de incubator en laat 's nachts voor signaaltransductie met de spinfected virale deeltjes aangesloten op de put.
- Dag 1: Afhankelijk van de celdichtheid; toevoegen meer medium aan de getransduceerde cellen te vermijden van begroeiing.
- Dag 2: Aangezien de plasmide lolploeg-Cas9 een Blasticidin weerstand marker heeft, voeg Blasticidin bij een dosis van 10 µg/mL getransduceerde en untransduced (control) MOLM13 of muis MLL-AF9 leukemie cellen voor de selectie van Cas9 cellen uiten.
Opmerking: Blasticidin selectie van de Cas9-getransduceerde MOLM13 of MLL-AF9 leukemie cellen wordt als voltooid beschouwd wanneer alle untransduced controle cellen zijn afgeschaft. Voor cellijnen dan MOLM13 en MLL-AF9 leukemie, moet een dosis-responscurve worden uitgevoerd vóór dit experiment, zodat een optimale dosis kan worden ingezet. Titratie van het supernatans dat virale kan ook worden uitgevoerd in geval van laag-transductie tarieven.
- Clone selectie van hoge-Cas9 waarin cellen.
Opmerking: We hebben gemerkt dat in sommige AML cellijnen, kloon selectie niet noodzakelijk zitten macht: de bulk Cas9-Blasticidin geselecteerd bevolking reeds heeft hoogrenderende genoom-bewerken. In dit geval is het mogelijk om stap 1.3 overslaan en verdergaan met stap 1.4 te beoordelen van Cas9 expressie in de bulk Cas9-blasticidin AML cellen door het westelijke bevlekken. Het zou nog steeds belangrijk om bewerken van gene doeltreffendheid in die cellen (stap 1.5) van de bulk Cas9-AML alvorens tot het testen van de concurrentie te beoordelen. We vermoeden dat de selectie van klonen van één hoge-Cas9 de variabiliteit genoom-bewerken, die vooral van belang vermindert is bij het testen van een aantal verschillende één gids RNAs (sgRNAs).- Een soort van de Cas9-Blasticidin gekozen MOLM13 en MLL-AF9 leukemie cellen voortaan genaamd MOLM13-Cas9 en MLL-AF9-Cas9 cellen, die respectievelijk met behulp van een FACS sorter opgenomen in een BSL2 goedgekeurd kap eencellige uitvoeren Sorteren kan worden uitgevoerd in 5-10 ronde onder niet-Weefselkweek behandeld 96 goed platen.
- Eenmaal enkele MOLM13-Cas9 en MLL-AF9-Cas9 klonen zijn gepickt en individueel genoemd, 10 – 20 klonen met 10 µg/mL Blasticidin in voedingsbodems voor de handhaving van Cas9 expressie uit te breiden.
- Expressie controleren van stabiele Cas9 proteïne door immunoblotting.
- Maken van nucleaire extracten van alle klonen van de Blasticidin geselecteerd van MOLM13 en MLL-AF9 leukemie met behulp van nucleaire extractie Kit volgens protocol van de fabrikant. Controleer Cas9 eiwit expressie met behulp van Dizzee Rascal M2 antilichaam sinds de Cas9 in het plasmide lolploeg-Cas9 is gekoppeld aan een N-terminal vlag epitoop.
- Laden 50 µg totaal eiwit uit elk nucleaire uittreksel op 10% Bis-Tris gel en draaien van de gel op 120 V tot hogere banden zijn goed gescheiden.
- Het blokkeren van het membraan met 5%-oplossing van de melk in de buffer TBST gedurende 1 uur.
- Incubeer het membraan met 1:1,000 verdunning van Dizzee Rascal M2 antilichaam aan een eindconcentratie van 1 µg/mL bij 4 ° C's nachts.
- Volgende dag, het membraan met buffer TBST wassen en incubeer met HRP geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam bij een verdunning 1:5,000 (eindconcentratie van 0.16 µg/mL) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Het membraan grondig met TBST wassen en de vlek met behulp van ECL substraat te ontwikkelen.
- Kies 3-4 klonen met de hoogste eiwituitdrukking van Cas9 zoals gezien door het westelijke bevlekken voor verdere functionele analyse (Figuur 1).
- Zorgen voor hoge Cas9 activiteit in geselecteerde klonen
- Lentivirale supernatant van een sgRNA coderen vector bereid met sgRNAs gericht op de mens of muis AAVS1 veilige-haven locus zoals beschreven in stap 1.1.
- Transduce van de top MOLM13 Cas9-uiten of MLL-AF9 leukemie klonen met het anti-AAVS1 sgRNA-lentivirale-supernatant met behulp van de hierboven beschreven methode van spinfection. Selecteer met 2,5 µg Mo/mL Puromycin voor 4 dagen.
- Zuiveren genomic DNA van de MOLM13-Cas9 of MLL-AF9-Cas9 leukemie klonen na Puromycin selectie samen met de respectieve wild-type besturingselementen met de kit voor Genomic DNA-extractie volgens instructies van de fabrikant. Gebruik 50 ng van DNA als een sjabloon voor het uitvoeren van een PCR met de AAVS1_test_primers met 2 x master mix van Taq Polymerase en het programma van de PCR vermeld in tabel 1.
- Uitvoeren van het PCR-product op een 2% agarose gel en gel-zuiveren van de 268 basenpaar band met een gel-kit voor extractie volgens protocol van de fabrikant. Sanger volgorde de gel gezuiverd PCR product met behulp van de AAVS1_target-frag_F-primer.
- Beoordelen bewerken efficiëntie door de vergelijking van de AAVS1 bewerkt en wildtype sequenties met behulp van online web-gebaseerde tools (Figuur 2).
2. klonen en transductie van sgRNAs in cellen van de AML-Cas9
-
Medium-doorvoer klonen van sgRNAs
- Het ontwerp van 4 – 6 sgRNAs voor het gen van belang met behulp van een web-based CRISPR ontwerpsoftware. Er zijn een aantal tools voor het ontwerpen van CRISPR online beschikbaar, zoals http://crispr.mit.edu/ die sgRNA sequenties genereren op basis van een DNA-sequentie van input.
- Vul een juiste gegevens in de velden met een sterretje. Klik op het genoom van de doelgroep voor sgRNA ontwerp. De doel-volgorde plakken in het vak volgorde en klik op de verzendknop .
- Voor het klonen in de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA expressie plasmide, prepend de nucleotiden "CACC" aan de zin oligo en "AAAC" om de omgekeerde aangevuld antisense oligo alvorens te bestellen. Bestelling vooraf gemengd gevoel en anti-gevoel oligos in een 96-wells-plaat geëtiketteerd Oligo-Mix van een oligonucleotide synthese bedrijf.
Opmerking: Hebben wij gebruik van de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmide, die de beperkingsplaats BbsI voor het klonen van de sgRNA heeft. In het geval dat andere sgRNA expressie plasmiden worden gebruikt, moeten de overhangen gebruikt voor de sgRNA oligonucleotides dienovereenkomstig worden gewijzigd. - Neem een aparte U 96-Wells bodemplaat geëtiketteerd Gloeien plaat. Maken van een master mix van 1 µL T4 PNK, 1 µL van 10 x T4 DNA afbinding buffer en 6 µL water per reactie gloeien.
- 8 µL van de master mix toevoegen aan elk putje van de onthardende plaat. Voeg 1 µL van elke 100 µM, betekenis en antisense oligo (of 2 µL van gemengd gevoel-anti-sense oligos) aan de master mix. Pipetteer 2 tot 3 keer voorzichtig te mengen goed, draai de plaat kort om het mixen op de bodem van putten.
- Gebruik de volgende onthardende programma op de machine van een PCR: 30 minuten bij 37 ° C, 2 min 30 s bij 95 ° C gevolgd door langzame afkoeling tot 22 ° C naar rato van 0,1 ° C/s. Na het gloeien, neem een vers 96-wells-plaat geëtiketteerd Verdund OligoMix. In deze plaat, Verdun de gefosforyleerd en ontharde oligos uit de bovenstaande reactie met water (1:200) met behulp van een meerkanaalspipet.
- PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - Digest 5 µg vector van de W met 1,5 µL van het restrictie-enzym BbsI (10.000 eenheden/mL) met behulp van een geschikte buffer bij 37 ° C gedurende 2 uur aan het linearize voor afbinding later.
- Neem een vers 96 goed plaat geëtiketteerd Afbinding plaat en toevoegen van 20 ng van de BbsI verteerd pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vector aan één putje per gewenste sgRNA afbinding. Daartoe, voeg 2 µL van gefosforyleerd, ontharde oligos van de plaat Verdund OligoMix .
- Voeg 1 µL van 10 x T4 ligase buffer en 1 µL van het T4 DNA Ligase-enzym. Pipetteer met een meerkanaalspipet en Incubeer de afbinding mix bij kamertemperatuur gedurende 2 uur zachtjes.
Opmerking: Afbinding mixen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor de transformatie stap later. - Ondertussen, dooi 90 µL van chemisch bevoegde E. coli cellen op ijs 10 minuten vóór het einde van de afbinding stap.
- Maak met een meerkanaalspipet 10 µL aliquots van de bevoegde cellen in elk putje van een afzonderlijke 96 goed plaat.
- Voeg het mengsel Afbinding van stap 2.1.8 in het putje met de bevoegde cellen, pipet op en neer zachtjes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipetteer 5 µL van de bacteriën-DNA mix rechtstreeks uit de bovenstaande reactie in een 6 goed plaat met LB-agar with 100 µg/mL ampicilline. Herhaal dit voor elk van de reacties van de transformatie.
- Elke reactie van de transformatie in een afzonderlijk etiket goed van een 6-well plaat plaat. Voeg ongeveer 5 – 8 glazen kralen aan elk goed en schud de gehele 6-well-plaat 8-10 keer in een cirkelvormige beweging.
- Kies 1 – 2 enkele kolonies van elk putje met een steriele 20 µL pipette uiteinde en strijk het in een zorgvuldig gelabelde spot op een steriele 10 cm petrischaal met LB agar en 100 mg/mL ampicilline. Na de strepen in de LB-plaat, uitwerpen gewoon de tip gebruikt voor kloon strepen in 3 mL LB-ampicilline met medium in een 14 mL ronde onderkant buis gemarkeerd met het bijbehorende nummer van de bacteriële kloon.
- Stuur de bacteriële plaat direct voor Sanger sequencing met de menselijke U6 promotor voorwaartse primer.
- Na de bevestiging van de opeenvolging van gekloonde sgRNAs, zuiveren het DNA uit de overeenkomstige 14 mL-buis met behulp van een mini prep kit volgens de instructies van de fabrikant.
- De concentratie en de kwaliteit van elk van de mini-preps meten met een spectrofotometer. Elke mini prep tot een concentratie van 15 ng/µL en Pipetteer in een 96 goed plaat geëtiketteerd sgRNA klonen plaatte normaliseren.
Opmerking: Deze plaat kan worden opgeslagen bij-20 ° C of gebruikt direct voor virus voorbereiding.
- Het ontwerp van 4 – 6 sgRNAs voor het gen van belang met behulp van een web-based CRISPR ontwerpsoftware. Er zijn een aantal tools voor het ontwerpen van CRISPR online beschikbaar, zoals http://crispr.mit.edu/ die sgRNA sequenties genereren op basis van een DNA-sequentie van input.
-
Virale productie van sgRNA constructies en transductie
- Voor de productie van sgRNA lentivirale deeltjes in de 96-Wells-indeling, volg de "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput virale productie (96 goed)" protocol van de genetische Perturbation Platform (GPP web Portal) van het Instituut van de brede (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/Protocols).
- Breng 200 µL van virale supernatans steriele buizen en bevriezen bij-80 ° C onmiddellijk.
- Dag -1: Jas een platte Non-weefsel cultuur behandeld 96 goed bodemplaat met 100 µL van recombinante menselijke fibronectine fragment bij een concentratie van 10 µg/mL in een BSL2 kap voor de cultuur van de cel. Wikkel de plaat gebruiken om zelfklevende wrap laten overnachten bij Bank te voorkomen dat het verlies van de verdamping.
- Dag 0: Verwijder de recombinante menselijke fibronectine fragment uit elk putje. Het virale supernatant van elke sgRNA op kamertemperatuur ontdooien. 50 µL van virale supernatans uit elke buis toevoegen aan elk gecoat goed van de transductie plaat. Draai de plaat van de signaaltransductie bij 1300 x g gedurende 90 min bij 35 ° C.
- Tegen het einde van spinfection, MOLM13-Cas9 (kloon B3) cellen uit de kolf cultuur te tellen. 10.000 cellen per putje in 100 µL volume worden gebruikt. De cellen voor alle de signaaltransductie putjes, dood volume rekening houdend met tellen.
- Na de spinfection van 90 min, het supernatant van alle putjes met behulp van een meerkanaalspipet aangepast aan 50 µL langzaam door het kantelen van de plaat te verwijderen. Voeg 100 µL van de cultuur van MOLM13-Cas9 kloon B3 cellen aan elke goed langzaam glijdend van uit de velg.
- Draai de plaat bij 1300 x g gedurende 2 min bij 35 ° C te laten de cellen regelen op de bodem. De plaat overbrengen in de 37 ° C weefselkweek rang incubator.
- Dag 1: Voeg 100 µL van verse middellange tot elke goed met sgRNA getransduceerde Cas9-MOLM13 of Cas9-MLL-AF9 leukemie cellen zodanig dat de definitieve Mediuminhoud 200 µL.
3. concurrerende groei Assay
- Dag 3: 72 h (dag 3) post signaaltransductie, controleren van het percentage van sgRNA BFP positieve cellen in elk putje bevattende stroom cytometry (FACS). Een cel levensvatbaarheid kleurstof gebruiken om te markeren en dode cellen uitsluiten van de analyse.
- Blijven plating opnieuw een deel van de cellen in de nieuwe putten met verse medium na elke FACS analyse te voorkomen overmatige groei tijdens de test.
-
Herhaal de FACS analyse elke 2-3 dagen om te controleren van het relatieve aandeel van BFP positief (BFP + ve) cellen ten opzichte van de BFP negatieve (BFP-ve) tegenhangers (Figuur 3). Het percentage positieve cellen van de BFP voor elk punt van de tijd (met behulp van de FlowJo of soortgelijke FACS analysesoftware) analyseren.
- Sleep Fcs bestanden voor elk monster naar de FlowJo software. Tweevoudig tikken voort ieder een voorbeeldbestand en een dot vlek van voorwaartse spreiding (FSC) vs. kant (SSC) spreidingsdiagrammen met gegevenspunten verbonden FSC op X-as en WS op Y-as uitgezet. Poort van alle cellen.
- Tweevoudig tikken voort naar de gated cellen en plot ze op levensvatbaarheid vlek (op de Y-as) vs. FSC hoogte (H) of gebied (A) stip vlek. Poort de levensvatbaarheid vlek negatieve (live) cellen.
- Tweevoudig tikken voort gated levende cellen en plot BFP (op Y-as) vs. FSC (A) op X-as. Poort BFP + ve-cellen. Alle deze poorten van toepassing op alle monsters door het geselecteerde monster naar Alle monsters onder tabblad groep te slepen.
- Klik op Tabel Editor om een tabel van de analyse van alle monsters. Sleep van BFP + ve graaf van één monster naar de tabel en klik op de knop weergave in de Tabel Editor een batch-rapport van alle monsters maken met een tabel weergeven van het percentage van de BFP + ve -cellen. Sla de tabel als een xls.
- Berekenen van de evenredige toename of afname % BFP positieve cellen binnen de bevolking van de levende cel na verloop van tijd en vergelijken deze verhouding aan de verhouding van BFP positieve cellen in de sgRNAs van de controle (zoals luciferase, vervormd of sgRNA van GFP).
- Uitzetten van de verhouding van BFP positieve cellen voor de verschillende sgRNAs, met inbegrip van de gene(s) van belang, alsook de controles met behulp van dag 3 als de basislijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze studie transduced we eerst de MOLM13 menselijke AML cellijn die draagt de translocatie MLL-AF9 met hoge-titer virus codering van de Cas9-blasticidin lentivirale plasmide. In onze handen beschreven bulk ongesorteerde MOLM13-Cas9 cellen ging niet hoog niveau Cas9 expressie weergeven door het westelijke bevlekken en ook presteerde niet goed wanneer vehiculumcontrolegroep efficiënte gene bewerken-met behulp van de methode eerder7. Dus overgegaan we tot het stellen van eencellige klonen en selecteer alleen de klonen met een hoge mate van Cas9, zoals gezien door Westelijke Bevlekkende (Figuur 1). We pakte 2 verschillende klonen en transduced hen met sgRNAs gericht op een site in de meetkundige plaats van AAVS1, veilige-haven als beschreven eerdere7. Met behulp van genomic DNA geëxtraheerd uit het geselecteerde Puromycin MOLM13-Cas9-AAVS1-sgRNA klonen, we uitgevoerd gebruikend inleidingen die verspreid over de sgRNA van de AAVS1 site snijden PCR en sanger sequenced een specifiek 268 bp PCR product uit 10 geïsoleerde kolonies voor elke MOLM13 kloon. Na de uitlijning met de ouderlijke opeenvolging vonden we dat de MOLM13-Cas9 kloon B3 en MLL-AF9-Cas9 kloon 8 had een rendement van 100% (gegevens niet worden weergegeven). Wij hebben gekozen dan deze klonen hoge Cas9-gemedieerde genoom-editing mogelijkheden voor onze sgRNA competitie testen weer te geven. Terwijl deze studies werden gevoerd, werden web-gebaseerde tools voor het snel bewerken van genoom-efficiëntie uit Sanger sequenties testen ontwikkeld door verschillende groepen zoals TIDE8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) of ICE (https://ice.synthego.com/#/). Deze tools maken het uiterst gemakkelijk en kosteneffectief genoom-bewerken om efficiëntie te beoordelen zonder te klonen van afzonderlijke fragmenten en rangschikken van meerdere klonen uitvoeren. Bulk Cas9-uiten cellen moeten daarom eerst worden getest voor genoom bewerken van efficiëntie met behulp van deze methoden. In het geval dat het bewerken van genoom-efficiëntie hoog is, is vervolgens eencellige klonen niet nodig. Ook in het geval dat het klonen van eencellige nodig is zoals te zien in onze studies, bieden deze web gebaseerde vogelgriepvirus frequentie schatting tools een veel snellere methode voor het testen van verschillende klonen in parallel.
Voor sgRNA klonen, maakten we gebruik van de sgRNA klonen van de plasmide pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, die havens een blauwe TL proteïne (BFP) voor het bijhouden van sgRNA getransduceerde cellen en een RNA Polymerase III-gedreven menselijke U6 promotor die de uitdrukking van drijft de gekloonde sgRNAs samen met de steiger tracer RNA (tracRNA). We gebruikten dit systeem om klonen van 2 sgRNAs gericht op DOT1L, een eiwit bekend dat een belangrijke rol spelen in de Epigenetische regulatie van de genexpressie. DOT1L is een Histon-methyltransferase die deposito's van mono-, di- en tri-methylering op doel genen9,10. Studies hebben aangetoond dat DOT1L een belangrijke rol in de AML gedreven door MLL-fusion oncogenen speelt. Daarom, DOT1L knock-out met behulp van CRISPR-Cas9 naar verwachting leiden tot aanzienlijk afbreuk doen aan de muis MLL-AF9 leukemie celproliferatie in overeenstemming met eerdere studies11,12,13,14. We gebruikten twee sgRNAs gericht op de locus AAVS1 veilige haven, die in de intron van het PPP1R12C-gen. sgRNAs productie van genomische veranderingen op deze site zijn niet waarschijnlijk geen invloed hebben op de proliferatieve capaciteit van MLL-leukemie cellijnen. Als positieve controle gekloond we sgRNAs dat targeting van het gen in het DNA replicatie-geassocieerde RPA3. RPA3 is een pan-essentiële-gen dat is aangetoond dat het belangrijk voor de verspreiding van verschillende AML cel lijnen4,15,16 . Anti-RPA3 sgRNAs daarom sterke anti-proliferatieve effecten in AML cellen weer te geven en worden meestal gebruikt als positieve controle. Na de signaaltransductie met anti-AAVS1 en anti-RPA3 sgRNA-plasmiden, gemeten we het relatieve aandeel van BFP + ve sgRNA getransduceerde cellen in vergelijking met hun tegenhangers van de BFP-ve elke 2-3 dagen in cultuur (Figuur 3). Met het protocol zoals hierboven beschreven, resulteerde de signaaltransductie van cellen van de MOLM13 of MLL-AF9 AML in een 60-70% transductie efficiëntie met onze virale voorbereidingen, waardoor de resterende cellen van 30 – 40% untransduced of BFP-ve in elke goed. Dit zorgt goed voor de studie van de relatieve proliferatie van genoom-bewerkt met wild-type cellen in dezelfde cellen. De proportionele verhoging of de verlaging van het percentage sgRNA getransduceerde cellen werd gebruikt als een maatregel om na te denken van de functioneel effect van sgRNA gen-schrapping in de cellen van de MOLM13-Cas9 gemedieerde. Als uw gen van belang belangrijk voor de verspreiding van de cellen van de AML test is, dan leidt sgRNA-gemedieerde verstoring van dit gen tot de relatieve afname van de sgRNA-uiten BFP + ve cellen ten opzichte van de BFP-ve-cellen in de loop van de test, Overwegende dat de sgRNAs gericht op luciferase, GFP of niet-essentiële genen de BFP + ve behouden zal /-ve verhouding na verloop van tijd.
Met behulp van 2 afzonderlijke anti-RPA3-sgRNAs, we een geleidelijke en aanzienlijke daling van het percentage van de BFP waargenomen + ve cellen ten opzichte van de BFP-ve untransduced tegenhangers. In tegenstelling, het percentage van de anti-AAVS1 sgRNA uiten van BFP cellen relatief constant gebleven na verloop van tijd aan te tonen dat AAVS1 gericht op geen effect op de proliferatie van MOLM13 cellen (figuur 4a heeft). Ook in de muis MLL-AF9-Cas9 cellen, we de effecten van sgRNAs gericht op monochroom (Rho1), het oog pigmentatie gen als negatieve controle en Dot1l, een epigenetische regulator bekend te verplichten voor de verspreiding van MLL-AF9 leukemie cellen na verloop van tijd getest . In deze studie, BFP + ve muis MLL-AF9-Cas9 cellen met 2 afzonderlijke anti-DOT1L sgRNAs getransduceerde toonde een dramatische en progressieve verlies na verloop van tijd ten opzichte van BFP-ve sgRNA niet-getransduceerde cellen (figuur 4b). De verhouding van de anti-Rho1 sgRNA bleef daarentegen relatief onveranderd na verloop van tijd. Deze resultaten tonen aan dat de kwetsbaarheid van de MLL-AF9 uiten muis leukemie cellen Dot1l uitputting, bevestiging van de eerder gepubliceerde resultaten.
Figuur 1: vertegenwoordiger Western blot resultaten weergegeven: verschillende niveaus van Cas9. Eencellige klonen van de cellijn van getransduceerde met CAS9 MOLM13 AML waren gesondeerd voor vlag-Cas9 expressie niveaus met behulp van Dizzee Rascal antilichamen. Klonen met de hoogste uitdrukking van Cas9 werden geselecteerd voor verdere studies. HEK293-T-cellen transfected met een Cas9 meningsuiting plasmide werden gebruikt als positieve controle en Cas9 niet-getransduceerde MOLM13 cellen als negatieve controles. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve analyse van het genoom bewerken op het Dot1l locus beoordeeld door ICE analyse. Een PCR amplicon gecentreerd rond de Dot1l sgRNA doelsite was Sanger sequenced en geanalyseerd met behulp van ICE analyse. Een vergelijking van de sgDot1l-reeks (oranje lijn) aan niet-doelgerichte DNA-sequentie (groene lijn) toont de hoge mate van efficiëntie in de cellen van de sgDot1l gericht rond de doelsite sgRNA bewerken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische workflow van de voorgestelde methoden. sgRNAs zijn gekloond in sgRNA expressie vector mede uiting van een fluorescente proteïne zoals BFP. Doelcellen zijn getransduceerde op 30 – 60% transductie tarieven en gevolgd door stroom cytometry elke 2-3 dagen. sgRNAs gericht op genen nodig voor AML celproliferatie toont relatieve uitputting na verloop van tijd komt te staan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger resultaten uit competitie testen in mens en muis AML cellen. (een) resultaten tonen een statistisch betekenisvolle progressieve daling van de RPA3 getransduceerde MOLM13-Cas9 kloon B3 cellen. In tegenstelling, is sgRNAs gericht op de AAVS1 site hebben geen effect. (b) sgRNAs gericht op Dot1l weergeven een opmerkelijke en progressieve achteruitgang in concurrerende proliferatie, in tegenstelling tot sgRNAs dat targeting van rodopsine (Rho). p > 0,05. p < 0.05. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie van het gemiddelde (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Afbeelding 5: algemene schets van het protocol. (een) tijd voor elke stap in de productie van Cas9 virus en sgRNA klonen beschreven. Ontwerp en klonen van sgRNAs kunnen worden uitgevoerd tijdens het genereren van één klonen van AML cellijnen met stabiele Cas9 expressie. (b) algemeen protocol voor de transductie van AML cellijnen met sgRNAs en concurrerende groei assay met behulp van FACS wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Cycli | Duur van de cyclus | Temperatuur |
| 1 | 2 min | 95 ºC |
| 35 | 30 s | 95 ºC |
| 30 s | 55 ºC | |
| 30 s | 72 ° C | |
| 1 | 5 min | 72 ° C |
| Houd | oneindige | 4 ° C |
Tabel 1: PCR programma voor AAVS1 locus versterking van Genomic DNA. PCR wordt gebruikt voor de versterking van het AAVS1 locus van genomic DNA voor testen snijden efficiëntie van Cas9 in Cas9 uitdrukken van klonen.
Aanvullende bestand: sgRNA oligo sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een concurrerende groei op basis van CRISPR-Cas9-assay voor het onderzoek naar de rol van kandidaat-genen in AML cellijnen stroom cytometry, waarbij in menselijk/RattenUitrustingen AML cellen (Figuur 5). Het doel van de test is het identificeren van het effect van verwijdering van het gen op onderhoud van AML celproliferatie meer dan twee tot drie weken op de schaal van een middellange-doorvoer. Sommige kritische stappen moeten zorgvuldig worden gevolgd om te vergemakkelijken de schaalvergroting van de beschreven protocol. In de productie van Cas9 lentivirus is het noodzakelijk het medium virus geconditioneerd door een 0,45 µM filter om te voorkomen dat de overdracht van 293T cellen aan het virus met bovendrijvende vloeistof filteren. Tijdens spinfection, inwikkeling van de spinfection plaat met zelfklevende wrap of parafilm helpt voorkomen dat mogelijke besmetting tijdens het centrifugeren. Echter, moet de omslag worden verwijderd alvorens de spinfected plaat terug in weefselkweek incubator. Het is zeer belangrijk om te beoordelen uiting van Cas9 klonen voor bewerken-efficiëntie. Klonen met lage-genoom bewerken efficiëntie weerspiegelen ontoereikende Cas9-activiteit en het slagingspercentage van het experiment kunnen beïnvloeden. In onze experimenten, we eerst getransduceerde menselijke AML Cas9 klonen met sgRNAs gericht op de AAVS1 locus en sequenced hun genomic DNAs-systeem voor het bewerken van efficiëntie. Vergelijking van de AAVS1 bewerkt en wildtype sequenties kunnen worden beoordeeld met behulp van de online web gebaseerde hulpmiddelen zoals TIDE8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) of ICE (https://ice.synthego.com/#/). Deze programma's vergelijken Sanger reeks sporen van potentieel bewerkte PCR fragment in de onbewerkte wildtype of verwijzing-reeks en de raming van de frequentie van wijzigingen. Dit is een snelle manier voor de beoordeling van vogelgriepvirus veranderingen als gevolg van de sgRNA van de test, dat is de maatregel van cellulaire Cas9 activiteit. U kunt ook klonen van de PCR product in een plasmide PCR het klonen zoals de TOPO botte klonen vector kan worden uitgevoerd, gevolgd door Sanger sequencing van afzonderlijke kolonies genoom-bewerken om efficiëntie te beoordelen door sequentie alignering van elke kloon de wild-type. Wij verkiezen de eerste methode, gezien haar gemak en de rentabiliteit in vergelijking met het klonen methode. Typisch, de ontdekking van basenpaar verandert zoals puntmutaties microdeleties, enz., op of rond de sgRNA snijden site in een overgrote meerderheid van gesequenceerd klonen wijzen op de aanwezigheid van een zeer actieve Cas9. Dus kozen we voor MOLM13 of MLL-AF9 leukemie klonen B3 en 8, respectievelijk met de hoogste bewerken efficiëntie voor verdere experimenten.
We ontwierpen sgRNAs dat targeting verschillende genen die zijn vermeld in het protocol met behulp van http://crispr.mit.edu/, een web-gebaseerde software die een lijst van sgRNAs geeft. Het is aanbevolen om de lijst top-scoren sgRNAs selecteren om te elimineren die met voorspelde af-target effecten. De ontworpen sgRNAs kunnen worden gekloond met behulp van de gepubliceerde protocollen zoals die over de website (http://www.addgene.org/67974/). Betekenis en antisense oligos zijn eerste phosphorylated en gegloeid volgens de stap 2.1.5. De eerste stap bij 37 ° C is belangrijk voor de oligos met de T4 kinase phosphorylating en latere cycli van PCR zijn belangrijk voor het ontharden van het gevoel en de anti-zin oligonucleotides in dsDNA. Het is belangrijk dat er een TL proteïne in de sgRNA klonen vector die is van cruciaal belang voor het bijhouden van sgRNA getransduceerde cellen verderop in het testen van de concurrentie. sgRNA klonen is met het gebruik van 96 goed plaat bij alle stappen met inbegrip van gloeien en Afbinding opgeschaald. Voor afbinding, kunnen schone PCR microtube strips ook worden gebruikt aangezien zij verenigbaar met meerkanaals pipetten zijn. In het geval dat de transformatie van een grotere set sgRNA klonen nodig is, een 96-wells-plaat in welke 10 μL van de bevoegde cellen zijn pre-aliquoted in elk putje en bevroren bij-80 ° C kan worden gebruikt om het hele proces te versnellen. Het doel van de afbinding reacties plating is te halen van afzonderlijke kolonies, die moeilijk uit te voeren in de 96-Wells-indeling. Vandaar, voor bacteriële transformatie is er een lichte verlies in schaalbaarheid. Nog steeds, zelfs voor de beplating van reacties van de transformatie van een hele 96-wells-plaat, het zal alleen vereisen een totaal van zestien 6-Wells-platen voor het hele project. Men moet voorzichtig zijn met de volgende stap in het plukken van de kolonies van de transformatie-platen. Terwijl strepen een kolonie op een gelabelde plekje, zorgen ervoor dat de vlek duidelijk geïsoleerd van de andere plekken. Markering van een vierkante raster op de bodem van de petrischaal met een donkere permanent marker voorkomt kruisbesmetting van bacteriële klonen.
Zodra de minipreps van sgRNA constructies bereid bent, kan het virus worden gemaakt in de 96-Wells-indeling. Op dit niveau van doorvoer is het onpraktisch 200 µL van het virus met bovendrijvende vloeistof filteren. Vandaar, het virale supernatant bevroren dienen te worden ten minste overnachting te voorkomen van kruisbesmetting van 293T cellen in het supernatant overgedragen. Het kan ook worden opgeslagen in 50 µL aliquots in steriele PCR buis strips te vermijden bevriezen ontdooien van de bovendrijvende substantie. Verder worden deze virus geconditioneerd supernatant gebruikt voor transducing AML cellen. In het geval dat lage titers van virale transductie worden waargenomen, zoals beoordeeld door de lage frequentie van BFP + ve cellen, dan kan het zijn belangrijk om te bepalen van de virale titer en testen transductions op verschillende multipliciteit van infecties (MOI) om 40-60% transductie tarieven. Virale titer vastberadenheid en MOI berekening wordt beschreven in detail hier17. In de competitie assay, zoals beschreven in stap 3 van het protocol, is het zeer belangrijk om uit te sluiten van niet-levensvatbare cellen om te voorkomen dat valse artefacten uit auto-fluorescentie bij het analyseren van de BFP naar verhouding van de niet-BFP. Op het moment van FACS, vóór het analyseren van monsters, is het gebruik van BFP negatieve en positieve controles van de BFP sterk aanbevolen om het nauwkeurig instellen van spanningen. Op elke opnieuw identificatietekens tijdstip, is het volume van de cellen worden opnieuw vergulde afhankelijk van de concentratie van cellen op het bepaalde tijdstip. We meestal vergulde opnieuw 20 μL van een totaal van 200 μl op elk tijdstip in een verse putje met 180 μL van verse medium. Homogenisatie van het mengsel van de cellen door zachtjes op en neer net voor opnieuw plating pipetteren wordt sterk aanbevolen. Meestal hebben we kunnen vaststellen dat de test moet worden uitgevoerd met meer dan 15-20 dagen tot kennisgeving sterke veranderingen in de BFP + ve /-ve ratio's, hoewel dit van gene te gen varieert.
Deze experimentele opstelling is zeer geschikt voor het testen van meerdere genen gelijktijdig in meerdere AML cellijnen aan de rol van kandidaat-genen in het voortbestaan of verspreiding van AML cellen snel te identificeren. Een waarschuwing voor de bepaling van de concurrerende proliferatie hier beschreven is dat zij niet acht potentiële cel-extrinsieke factoren zoals paracrine signalering gebeurtenissen uit gen-gerichte cellen die invloed op de niet-doelgerichte celpopulatie binnen hetzelfde hebben kunnen goed. Hoewel dit zelden voorkomt wellicht, moet deze factor niet vergeten bij het uitvoeren van deze test. Hoewel we AML als voorbeeld gebruikt hebben voor de CRISPR-Cas9-concurrentie op basis van tests die worden beschreven in dit manuscript, deze methode kan worden gebruikt voor alle kanker cel regels vast te stellen van de rol van meerdere genen in parallel. Er zijn verschillende voordelen van gen-verwijdering met behulp van CRISPR-Cas9 over gene-knockdown met behulp van RNA-interferentie. Ten eerste, in tegenstelling tot shRNAs, die meestal een breed scala van doel mRNA inhibitie tonen, sgRNAs in combinatie met de Cas9 nuclease effectueren volledig knockout van doelgenen. Dit kan resulteren in meer dramatische en consequente fenotypen met CRISPR Cas9-gebaseerde methoden, hoewel het moet worden gewaarschuwd dat de targeting efficiëntie van individuele sgRNAs evenals shRNAs sterk uiteen lopen kan.
De stroom cytometry-gebaseerde mededinging assay biedt diverse voordelen ten opzichte van traditionele proliferatie testen waarin een vast aantal cellen zijn verguld voor het meten van de relatieve proliferatieve activiteit van cellen gen-verstoord. Een voordeel is dat de relatieve proliferatieve activiteit van cellen worden gemakkelijk en snel aan stroom cytometry voor meerdere dagen afgemeten kan, het omzeilen van de noodzaak voor cel tellen bij elke stap van de beplating. Dit is handig bij het testen van een groot aantal kandidaat-sgRNAs gericht op meerdere genen, als het tellen van alle van de putten is omslachtig en kan leiden tot onvolkomenheden. In tegenstelling tot, ATP gebaseerde meting testen voor celgroei, stroom cytometry kan worden uitgevoerd op een steekproef van levende cellen, waardoor deze methode handig voor lange termijn analyse. Dit is vooral nuttig in de studie van de factoren zoals epigenetische modulatoren, die laat-acteren effecten inzake verspreiding van AML cellen kunnen weergeven en kunnen op lange termijn tests vereisen. Ten tweede, de aanwezigheid van niet-getransduceerde cellen binnen hetzelfde goed zorgt voor een goed gecontroleerde celpopulatie die kan worden gebruikt om de basislijn voor de assay ingesteld. Ten derde, wanneer set-up in een 96-Wells-formaat, de bepaling kan bijna volledig worden uitgevoerd met behulp van meerkanaals pipetten, aanzienlijk versnellen het hele proces van het klonen van sgRNAs virus voorbereiding en uiteindelijk stroom-cytometrische evaluatie van fluorescentie.
De hier beschreven methode kan worden efficiënt geschaald-up voor het onderzoek van maximaal 96 sgRNAs gelijktijdig in een gekleed scherm. Uitgaande van 4 – 6 sgRNAs per gen, kan deze methode daarom worden gebruikt voor de snelle ondervraging van ten minste 16 – 24 genen in parallel. In geval van een groter aantal genen, zoals een hele moleculaire traject dat moet worden ondervraagd in AML cellen, zal gebundelde CRISPR-Cas9-gebaseerde schermen meer nuttig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.J.D is een adviseur A2A farmaceutische producten (New Jersey) en Salgomed Therapeutics (San Diego). Andere auteurs er geen conflicten optreden te verklaren.
Acknowledgments
Het plasmide pCW-Cas9 was een geschenk van Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide # 50661) en de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmide van de Yusa lab (Addgene plasmide #67974. We bedank de Stroom Cytometry kern bij SBP medische ontdekking Instituut voor tijdige hulp bij flow analyse en sorteren. We willen graag erkentelijk voor de steun van de Lady Tata Memorial Stichting A.D. We willen graag ook erkentelijk voor de steun van de volgende financieringsbronnen: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center gesponsord Grant, de V-Stichting en de San Diego NCI kanker centra (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).
