Summary
Detta manuskript beskriver en klustrad regelbundet mellanliggande kort Palindromic upprepas (CRISPR) CRISPR-Cas9-baserade metod för enkel och snabb undersökning av flera kandidatgener i akut myeloisk leukemi (AML) cellproliferation i roll parallellt. Denna teknik är skalbar och kan appliceras i andra cancer cellinjer samt.
Abstract
Gen störning studier har använts i stor utsträckning att undersöka betydelsen av enskilda gener i AML patogenes. För att uppnå fullständig gen störningar, många av dessa studier har gjort användningen av komplexa gen knockout modeller. Medan dessa studier med knockoutmöss erbjuder ett elegant och beprövade system för att undersöka genotyp-till-fenotyp relationer, en snabb och skalbar metod för att bedöma kandidatgener som spelar en roll i AML cellproliferation eller överlevnad i AML modeller hjälper påskynda parallell förhör av flera kandidatgener. Senaste framstegen inom editering teknik har dramatiskt förbättrat vår förmåga att utföra genetiska störningar på en aldrig tidigare skådad omfattning. Ett sådant system av gen editering är metoden CRISPR-Cas9-baserad som kan användas för att göra snabba och effektiva förändringar i målet cellen genomet. Den lätthet och skalbarhet av CRISPR/Cas9-medierad gen-strykningen gör det en av de mest attraktiva teknikerna för förhör av ett stort antal gener i fenotypisk analyser. Här presenterar vi en enkel test som använder CRISPR/Cas9 medierad gen-störningar i kombination med hög genomströmning flöde-flödescytometri-baserade konkurrens-analyser för att undersöka rollen av gener som kan spela en viktig roll i spridningen eller överlevnad av mänskliga och murina AML cellinjer.
Introduction
De senaste decennierna har sett många forskningsinsatser inriktad på att identifiera viktiga molekylära vägar i akut myeloisk leukemi (AML) patogenes bidrag. Traditionellt, har gen-störningar i AML celler utförts med villkorlig knockoutmöss eller kort-hårnål RNA (shRNA). Medan knockoutmöss erbjuder ett sofistikerat system för plats och tid kontroll av gen-strykningen, är generera gen knockoutmöss arbetsintensiva, tidskrävande och dyrt. Dessutom gen-knockouts använda rekombination strategier är inte enkelt skalbar; dessa strategier lämpar inte sig väl till förhör av flera gener parallellt. Efter upptäckten av RNA interferens metoder att knock-down endogena mRNA med små störande RNA (siRNA) eller shRNA, började många grupper använder RNA interferens tekniker för att undersöka betydelsen av specifika gener i AML. Eftersom både murina och mänskliga AML celler är notoriskt svårt att transfect med traditionella lipid-baserade transfection metoder, de flesta studier anställd lentivirally eller retrovirally-kodade shRNA för att studera geners funktion i AML celler. Den senaste upptäckten av klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) och de associerade Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutionerat gen-inriktning teknik1,2,3. Använda CRISPR-Cas9, specifika gener eller genomisk regioner kan tas bort, redigeras eller märkta med effektivitet och lätthet. CRISPR-Cas9-baserade genredigering växer nu fram som metod för val för att utreda genotyp-till-fenotyp relationer i olika celltyper på grund av den enkelhet, effektivitet och bred tillämpligheten av denna teknik. CRISPR-Cas9-baserade metoder blir också metoden för val i AML, inte bara för förhör enskilda gener, men också som ett sätt att rikta flera gener i klädd eller poolade genetiska skärmar som syftar till att undersöka flera gener parallellt som potentiell AML-beroenden4,5,6.
I detta manuskript beskriver vi en enkel konkurrenskraftig tillväxt test för att mäta effekterna av gen-störningar på tillväxten av AML-celler, baserat på stabil CRISPR-Cas9-medierad genredigering följt av hög genomströmning flödescytometri. Denna metod är enkel, effektiv och skalbar till medium-genomströmning experiment för att undersöka rollen av flera gener parallellt i AML celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generera AML Cell linje kloner med hög uttryck för stabil och aktiv Cas9
- Produktion av Cas9 lentivirus
- Dag 0: Plåt 4 x 106 293T celler i 10 mL DMEM med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin och L-glutamin i ett 10 cm vävnadsodling skålen i en biosäkerhet nivå 2 (BSL2) certifierade cell kultur huva. Placera skålen i en 37 ° C inkubator.
- Dag 1: Förkromad 293T cellerna ska vara 70 – 80% konfluenta på dag 1. Utföra den transfection använder följande protokoll på eftermiddagen.
- Varma transfection medium, kultur media och transfection reagens till rumstemperatur. Tina alla krävs plasmidsna för transfection.
- Mix 9 µg psPAX2, 0.9 µg av pMD2.G och 9 µg pLenti-Cas9 plasmider med 500 µL för transfection medium i en 5 mL tub.
- Lägga till 1,7 mL transfection medium en 14 mL rund botten röret. Tillsätt 57 µL transfection reagens direkt till transfection medium i röret för att undvika att röra väggen i röret.
- Försiktigt lägga hela plasmid mixen till transfection reagenslösningen och blanda genom att knacka på röret på sida. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 20 – 30 min. Under tiden ändra mediet från seedade 293T plattan.
- Lägg till transfection mixen droppvis till plattan och skaka försiktigt plattan i sidled för effektiv blandning. Placera plattan i en 37 ° C inkubator.
- Dag 2: Aspirera supernatanten från transfection plattan försiktigt så att cellerna inte störs eller lossnat från plattan. Kassera supernatanten. Tillsätt 10 mL av färsk 10% DMEM medium genom att skjuta ner försiktigt från sidorna av plattan att undvika lossnar celler.
- Dag 3: Samla in viruset som innehåller supernatanten från transfection plattan långsamt genom att dra det i en 10 cm steril spruta. Efter supernatanten samlas i sprutan, fäst ett sterilt 0,45 µM filter på sprutan och håll sprutan och filter över en fräsch, steril 15 mL polypropylen koniska rör. Försiktigt Kasta sprutan för att filtrera viruset som innehåller supernatanten genom 0.45 µM filter i 15 mL polypropylen koniska röret.
- Lagra viral luftkonditionerade mediet i alikvoter av 2 mL varje i 2 mL cryovials vid-80 ° C.
- Transduktion AML cellinjer
- Dag -1: Späd 1 mg/mL rekombinant humant Fibronektin fragment lager till 10 µg/mL med steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Coat en icke-vävnadskultur behandlades 6 väl platta med 2 mL arbetslösning 10 µg/mL rekombinant humant Fibronektin fragment i BSL2 godkända cell kultur huva. Linda in plattan i cling wrap att undvika förlust på avdunstning och förvara i rumstemperatur över natten.
- Dag 0: Tina viral supernatanten innehållande Cas9. Aspirera rekombinant humant Fibronektin fragment lösningen fullständigt från belagda plattan strax före spinfection. Tillsätt 2 mL av viral luftkonditionerade medium med Cas9 till plattan och spinna vid 1300 x g i 90 min vid 35 ° C. Detta hjälper viruspartiklarna som tillmäter spinfected väl.
- Samtidigt räkna cellerna att vara Sensorik och snurra ner 2 x 106 celler i en 15 mL polypropylen koniska rör. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 mL färsk kultur media.
- Efter spinfection, avlägsna alla viral supernatanten från spinfected väl och kassera. Retrovirala partiklar från supernatanten är kopplade till botten av spinfected väl. Till detta väl, tillsätt 2 x 106 cellerna resuspended i 2 mL medium från ovanstående steg.
- Snurra på plattan igen vid 1 300 x g mycket kortfattat (1 – 2 min) tillräcklig för att cellerna att bosätta sig på botten. Placera plattan tillbaka i inkubatorn och lämna över natten för transduktion med de spinfected viruspartiklar kopplad till brunnen.
- Dag 1: Beroende på cell densiteten, lägga till fler medium transduced cellerna att undvika överväxt.
- Dag 2: Eftersom pLenti-Cas9 plasmiden har en Blasticidin motstånd markör, lägga Blasticidin på en 10 µg/mL dos Sensorik och untransduced (kontroll) MOLM13 eller musen MLL-AF9 leukemiceller för val av Cas9 uttrycker celler.
Obs: Blasticidin urval av Cas9-sensorik MOLM13 eller MLL-AF9 leukemiceller anses slutförd när alla untransduced kontroll celler har avskaffats. För cell linjer än MOLM13 och MLL-AF9 leukemi, måste en dos-responskurva utföras före detta experiment så att en optimal dos kan användas. Titrering av viral supernatanten kan också utföras vid låg-transduktion priser.
- Klona urval av hög-Cas9 uttrycker celler.
Obs: Vi har märkt att i vissa AML cellinjer, klon val inte kanske är nödvändigt: huvuddelen Cas9-Blasticidin valt befolkningen redan har hög editering effektivitet. I det här fallet är det möjligt att hoppa över steg 1.3 och gå vidare till steg 1.4 att bedöma Cas9 uttryck i bulk Cas9-blasticidin AML cellerna av western blotting. Det skulle fortfarande vara viktigt att utvärdera genredigering effektivitet i bulk Cas9-AML cellerna (steg 1,5) innan du fortsätter till konkurrens analyserna. Vi förmoda att valet av enda high-Cas9 kloner minskar editering variationer, vilket är särskilt viktigt när du testar ett antal olika enda guide RNAs (sgRNAs).- Utföra en encellig typ av den Cas9-Blasticidin valt MOLM13 och MLL-AF9 leukemiceller som hädanefter kallas MOLM13-Cas9 och MLL-AF9-Cas9 celler, respektive, med hjälp av en FACS sorterare som ingår i en BSL2 godkända huva. Sortering kan utföras i 5 – 10 rund botten icke-vävnadskultur behandlade 96 väl plattor.
- En gång singel MOLM13-Cas9 och MLL-AF9-Cas9 kloner har plockats och individuellt heter, expandera 10 – 20 kloner med 10 µg/mL Blasticidin i kultur media att säkerställa upprätthållandet av Cas9 uttryck.
- Uttryck kontrollera stabil Cas9 protein genom immunoblotting.
- Gör kärnkraft extrakt av alla Blasticidin utvalda kloner av MOLM13 och MLL-AF9 leukemi med nukleära Extraction Kit enligt tillverkarens protokoll. Kontrollera Cas9 proteinuttryck med anti-Flag M2 antikropp sedan Cas9 i pLenti-Cas9 plasmiden är kopplad till en N-terminal flagga epitop.
- Ladda 50 µg totalt protein från varje nukleära utdrag på 10% Bis-Tris gel och kör gelen vid 120 V tills övre band är väl separerade.
- Blockera membranet med 5% mjölk lösning i TBST buffert för 1 h.
- Inkubera membranet med 1:1,000 utspädning av anti-Flag M2 antikropp med en slutlig koncentration på 1 µg/mL vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, tvätta membranet med TBST buffert och inkubera med HRP konjugerad antimus sekundär antikropp vid en spädning på 1:5,000 (slutliga koncentration på 0,16 µg/mL) i rumstemperatur i 1 h.
- Tvätta membranet grundligt med TBST och utveckla blot använder ECL substrat.
- Plocka 3 – 4 kloner med högsta proteinuttryck för Cas9 som ses av Western blotting för ytterligare funktionell analys (figur 1).
- Att säkerställa hög Cas9 aktivitet i utvalda kloner
- Förbereda lentiviral supernatanten från en sgRNA kodning vektor med sgRNAs inriktning människan eller mus AAVS1 integritetsskydds locus som beskrivs i steg 1.1.
- Transduce toppen Cas9-uttryckande MOLM13 eller MLL-AF9 leukemi kloner med anti-AAVS1 sgRNA lentiviral supernatanten med spinfection metoden som beskrivs ovan. Välj med 2,5 µg/mL Puromycin för 4 dagar.
- Rena genomiskt DNA från MOLM13-Cas9 eller MLL-AF9-Cas9 leukemi klonerna efter Puromycin urval tillsammans med respektive vildtyps-kontroller med hjälp av genomisk DNA extraktion kit enligt tillverkarens instruktioner. Använd 50 ng av DNA som mall för att utföra en PCR med AAVS1_test_primers med 2 x master mix av Taq polymeras och PCR-program listade i tabell 1.
- Köra PCR-produkten på en 2% agarosgel och gel-rena 268 baspar bandet med en gel utvinning kit enligt tillverkarens protokoll. Sanger sekvens gelen renat PCR-produkt med AAVS1_target-frag_F primer.
- Bedöma redigering effektivitet genom jämförelse av de AAVS1 som redigeras och vildtyp sekvenser med online web-baserade verktyg (figur 2).
2. kloning och transduktion av sgRNAs i AML-Cas9 celler
-
Medium-genomströmning kloning av sgRNAs
- Design 4 – 6 sgRNAs för gen av intresse med hjälp av en webbaserad CRISPR design mjukvara. Det finns ett antal CRISPR designverktyg online som http://crispr.mit.edu/ som genererar sgRNA sekvenser baserat på en ingående DNA-sekvens.
- Fylla i en lämplig information i fälten med asterisker. Klicka på mål genomet för sgRNA design. Klistra in målet sekvensen i rutan sekvens och klicka på Skicka .
- För kloning i den pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA uttryck plasmid, prepend nukleotiderna ”CACC” känsla oligo och ”AAAC” till den omvända kompletteras antisense oligo innan du beställer. Beställa färdigblandad känsla och anti känsla oligos i en plattan med 96 brunnar märkta Oligo-Mix från en oligonukleotid syntes företag.
Obs: Vi har gjort användningen av de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmid, som har webbplatsen BbsI begränsning för sgRNA kloning. Andra sgRNA uttryck plasmider används, behöver överhäng används för de sgRNA oligonukleotider ändras. - Ta en separat U 96 brunnar bottenplatta märkt Glödgning plattan. Gör en master mix av 1 µL T4 PNK, 1 µL 10 x T4 DNA ligering buffert och 6 µL vatten per glödgning reaktion.
- Tillsätt 8 µL av huvudmixen till varje brunn av glödgning plattan. Lägg 1 µL av varje 100 µM, känsla och antisense oligo (eller 2 µL av blandade sense-anti-sense oligos) till huvudmixen. Pipettera 2 – 3 gånger försiktigt för att blanda väl, snurra plattan kort för att få blandar till botten av brunnarna.
- Använda följande glödgning programmet på en PCR-maskin: 30 minuter vid 37 ° C, 2 min 30 s vid 95 ° C följt av långsam nedkylning till 22 ° C i en takt av 0,1 ° C/s. Efter glödgning, ta en färsk plattan med 96 brunnar märkt Utspädd OligoMix. I denna platta, späd den fosforylerade och glödgad oligos från ovanstående reaktionen med vatten (1: 200) med hjälp av en flerkanalspipett.
- Digest 5 µg av pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vector med 1,5 µL av BbsI restriktionsenzym (10.000 enheter/mL) med en lämplig buffert vid 37 ° C för 2 h till linjär det för ligering senare.
- Ta en färsk 96 väl skylt märkt Ligation plattan och tillsätt 20 ng av BbsI rötas pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vector till en brunn per önskad sgRNA ligatur. Till detta, tillsätt 2 µL av fosforylerade, glödgad oligos från Utspädd OligoMix plattan.
- Lägga till 1 µL 10 x T4 ligase buffert och 1 µL av enzymet T4 DNA-Ligase. Försiktigt pipett med en flerkanalspipett och inkubera ligering mixen i rumstemperatur i 2 h.
Obs: Ligatur mixar kan förvaras vid-20 ° C för omvandling steg senare. - Under tiden, Tina 90 µL av kemiskt behöriga E. coli celler på is 10 min före slutet av steget ligering.
- Med hjälp av en flerkanalspipett, göra 10 µL portioner av behöriga cellerna i varje brunn av en separat 96 väl plåt.
- Lägg till ligatur blandningen från steg 2.1.8 till den brunn innehållande de behöriga cellerna, pipett upp och ner försiktigt och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Pipettera 5 µL av bakterier-DNA mixen direkt från ovanstående reaktionen till en 6 väl plåt innehållande LB-agar med 100 µg/mL Ampicillin. Upprepa för varje omvandling reaktioner.
- Tallrik varje omvandling reaktion i en separat märkta väl av en 6-bra platta. Lägg till ca 5 – 8 glaspärlor till varje brunn och skaka hela 6-väl plattan 8 – 10 gånger i en cirkelrörelse.
- Plocka 1 – 2 enstaka kolonier från varje brunn med en steril 20 µL pipettspetsen och streak det till en noggrant märkta plats på en steril 10 cm petriskål med LB agar och 100 mg/mL Ampicillin. Efter strimmor i LB plattan, helt enkelt mata ut spetsen används för klon strimmor i 3 mL LB-Ampicillin innehållande medium i en 14 mL rund botten tube märkts med numret för motsvarande bakteriell klon.
- Skicka bakteriell plattan direkt för Sanger sekvensering med mänskliga U6 arrangören framåt primer.
- Efter sekvensen bekräftelse av klonade sgRNAs, rena DNA från motsvarande 14 mL röret med en mini prep kit enligt tillverkarens anvisningar.
- Mät koncentration och kvalitet av varje av de mini-preps med en spektrofotometer. Normalisera varje mini prep till en koncentration av 15 ng/µL och pipetten till en 96 väl platta märkta sgRNA kloner plattan.
Obs: Denna platta kan lagras vid-20 ° C eller användas direkt för virus beredning.
- Design 4 – 6 sgRNAs för gen av intresse med hjälp av en webbaserad CRISPR design mjukvara. Det finns ett antal CRISPR designverktyg online som http://crispr.mit.edu/ som genererar sgRNA sekvenser baserat på en ingående DNA-sekvens.
-
Viral produktion av sgRNA konstruktioner och transduktion
- För produktion av sgRNA lentiviral partiklar i formatet 96 brunnar, följ den ”shRNA/sgRNA/ORF hög genomströmning Viral produktion (96 väl)” protokoll från genetisk störning plattformen (GPP web Portal) Broad Institute (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
- Över 200 µL av viral supernatanten till sterila tuber och frysa vid-80 ° C omedelbart.
- Dag -1: Coat en platt botten icke-vävnad kultur behandlas 96 väl platta med 100 µL av rekombinant human Fibronektin fragment med en koncentration på 10 µg/mL i en BSL2 cell kultur huva. Wrap plattan med cling wrap för att undvika avdunstning förlust och lämna den på bänken under natten.
- Dag 0: Ta bort rekombinant humant Fibronektin fragmentet från varje brunn. Tina viral supernatanten av varje sgRNA vid rumstemperatur. Tillsätt 50 µL av viral supernatanten från varje rör till varje belagd väl Skyltens transduktion. Snurra transduktion plattan vid 1300 x g i 90 min vid 35 ° C.
- Mot slutet av spinfection, räkna MOLM13-Cas9 (klon B3) celler från kultur kolven. Använd 10 000 celler per brunn i 100 µL volym. Räkna cellerna för alla transduktion brunnar, med beaktande av dödvolym.
- Efter de 90 min spinfection, avlägsna supernatanten från alla de brunnar som med hjälp av en flerkanalspipett anpassas till 50 µL långsamt genom att luta plattan. Tillsätt 100 µL av kulturen av MOLM13-Cas9 klon B3 celler till varje väl sakta glida ner från rim.
- Snurra på plattan vid 1300 x g under 2 minuter vid 35 ° C att låta cellerna bosätta sig på botten. Överföra plattan till 37 ° C vävnadsodling grade inkubatorn.
- Dag 1: Tillsätt 100 µL av färskt medium till varje brunn innehållande sgRNA sensorik Cas9-MOLM13 eller Cas9-MLL-AF9 leukemi celler så att den slutliga medium volymen är 200 µL.
3. konkurrenskraftiga tillväxt Assay
- Dag 3: 72 h (dag 3) post transduktion, Kontrollera procentandelen av sgRNA som innehåller BFP positiva celler i varje brunn av flödescytometri (FACS). Använd en cell livskraft färg att markera och utesluta döda celler från analysen.
- Fortsätt åter plätering en andel av cellerna i nya brunnar med färska medium efter varje FACS analys att undvika överväxt under analysen.
-
Upprepa analysen FACS varje 2-3 dagar för att kontrollera den relativa andelen BFP positiva (BFP + ve) celler jämfört med de BFP negativa (BFP-ve) motsvarigheterna (figur 3). Analysera andelen BFP positiva celler för varje tidpunkt (med FlowJo eller liknande FACS analys programvara).
- Dra Fcs filer för varje prov till FlowJo programvara. Dubbel klick på någon en exempelfil och rita en prick skamfläck av framåt scatter (FSC) vs. Side scatter (SSC) med FSC på X-axeln och SSC på Y-axeln. Utfärda utegångsförbud för alla celler.
- Dubbelklicka på gated cellerna och rita dem på livskraft fläck (på Y-axeln) vs FSC höjd (H) eller området (A) dot blot. Gate livskraft fläcken negativa (live) celler.
- Dubbelklicka på gated levande celler och rita BFP (på Y-axeln) vs. FSC (A) på X-axeln. Gate BFP + ve celler. Gälla alla prover alla dessa portar genom att dra det Markera provet till Alla prover under gruppen fliken.
- Klicka på Tabellen Editor för att göra en analys tabell över alla prover. Dra BFP + ve räkna från ett prov till tabellen och klicka på knappen Display i Tabellen Editor för att skapa en batchrapport av alla prover med en tabell som visar procentandelen av BFP + ve celler. Spara tabellen som en xls.
- Beräkna den proportionell ökningen eller minskning i % BFP positiva celler inom levande cell befolkningen över tid och jämför detta förhållande till förhållandet mellan BFP positiva celler i den kontroll sgRNAs (såsom luciferas, äggröra eller GFP sgRNA).
- Rita förhållandet mellan BFP positiva celler för de olika sgRNAs inklusive gene(s) intresse samt kontroller med dag 3 som baslinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår studie sensorik vi först de MOLM13 mänskliga AML cellinje som bär på MLL-AF9 flyttning med hög-titer virus kodning Cas9-blasticidin lentiviral Plasmiden. I våra händer beskrivs bulk osorterade MOLM13-Cas9 celler visade ingen hög nivå Cas9 uttryck av Western blotting och också inte utföra väl när analyseras för effektiv gen redigering-metoden tidigare7. Därför fortsatte vi att upprätta enda cell kloner och bara välja klonerna med höga nivåer av Cas9 som ses av Western blotting (figur 1). Vi plockade 2 distinkta kloner och sensorik dem med sgRNAs inriktning en plats i det AAVS1 integritetsskydds locus som beskrivs tidigare7. Med genomiskt DNA extraheras från den Puromycin-valt MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA kloner, vi utfört en PCR med primers som spänner över de AAVS1 sgRNA skär webbplats och sanger sekvenserade en viss 268 bp PCR-produkt från 10 isolerade kolonier för varje MOLM13 klon. Efter justering med föräldrarnas sekvensen fann vi att MOLM13-Cas9 klon B3 och MLL-AF9-Cas9 klon 8 hade en verkningsgrad på 100% (inga data anges). Vi valde sedan dessa kloner som visar höga Cas9-medierad editering kapacitet för våra sgRNA konkurrens analyser. Medan dessa studier sköttes, utvecklades webbaserade verktyg för att snabbt testa editering effektivitet från Sanger sekvenser av olika grupper som is (https://ice.synthego.com/#/) eller TIDE8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html). Dessa verktyg gör det extremt enkelt och kostnadseffektivt att bedöma editering effektivitet utan att behöva klona enskilda fragment och utföra sekvensering av flera kloner. Bulk Cas9-uttryckande celler bör därför först testas för genomet redigering effektivitet med dessa metoder. Editering effektiviteten är hög, sedan behövs encelliga kloning inte. Dessutom om att enstaka cell kloning behövs som kan ses i våra studier, erbjuder dessa web-baserad mutationsanalys frekvens uppskattning verktyg en mycket snabbare metod för att testa flera kloner parallellt.
För sgRNA kloning, gjorde vi utnyttja den sgRNA som kloning plasmiden pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, som hyser en blå fluorescerande protein (BFP) för att spåra sgRNA sensorik celler och en RNA-polymeras III-driven mänskliga U6 arrangören som driver ett uttryck för den klonade sgRNAs tillsammans med tracer RNA (tracRNA) ställningen. Vi använde detta system för att klona 2 sgRNAs inriktning DOT1L, ett protein som känd för att spela en viktig roll för epigenetisk reglering av genuttryck. DOT1L är en Histon-methyltransferase som deponerar mono-, di- och tri-metylering mål gener9,10. Studier har visat att DOT1L spelar en viktig roll i AML drivs av MLL-fusion onkogener. Därför förväntas DOT1L knockout med CRISPR-Cas9 leda till avsevärt försämra mus MLL-AF9 leukemi cellproliferation i linje med tidigare studier11,12,13,14. Vi använde två sgRNAs inriktning det AAVS1 safe harbor locus, som är i intron av PPP1R12C-genen. sgRNAs producerar genomiska förändringar i denna webbplats sannolikt inte har några effekter på MLL-leukemi cellinjer proliferativ kapacitet. Som positiv kontroll klonade vi sgRNAs inriktning den DNA-replikering-associerad gen RPA3. RPA3 är en pan-väsentliga gen som har visat sig vara viktigt för spridningen av flera AML cell linjer4,15,16 . Anti-RPA3 sgRNAs därför Visa starka anti-proliferativ effekter i AML celler och används vanligtvis som en positiv kontroll. Efter transduktion med anti-AAVS1 och anti-RPA3 sgRNA plasmider, Vi mätte den relativa andelen BFP + ve sgRNA sensorik celler i jämförelse med motsvarigheterna BFP-ve var 2 – 3 dagar i kultur (figur 3). Med protokollet som beskrivs ovan, resulterade transduktion MOLM13 eller MLL-AF9 AML celler i en 60 – 70% transduktion effektivitet med våra viral förberedelser, lämnar de resterande 30 – 40% celler untransduced eller BFP-ve i varje brunn. Detta möjliggör studiet av relativa spridningen av genomet-redigeras celler med vildtyp celler i samma väl. Den proportionell ökning eller minskning av andelen sgRNA sensorik celler användes som en åtgärd för att återspegla funktionella effekten av sgRNA medierad gen-borttagning i MOLM13-Cas9 cellerna. Om din gen av intresse är viktigt för spridningen av de test AML-cellerna, kommer att då sgRNA-medierad störningar av denna gen leda till en relativ minskning av sgRNA-uttryckande BFP + ve celler i jämförelse med BFP-ve cellerna under analysen, sgRNAs inriktning luciferas, GFP eller icke väsentliga gener kommer att behålla den BFP + ve /-ve förhållandet över tid.
Med 2 separata anti-RPA3 sgRNAs, vi observerade en progressiv och betydande nedgång i andelen BFP + ve celler jämfört med BFP-ve untransduced motsvarigheter. Däremot legat procentandelen av anti-AAVS1 sgRNA uttrycka BFP celler relativt konstant över tid, visar att AAVS1 inriktning har ingen effekt på spridningen av MOLM13 celler (figur 4a). Likaså i mus MLL-AF9-Cas9 cellerna testade vi effekterna av sgRNAs inriktning Rhodopsin (Rho1), ögat pigmentering genen som negativ kontroll och Dot1l, en epigenetisk regulator känd krävs för spridningen av MLL-AF9 leukemiceller över tiden . I denna studie, BFP + ve mus MLL-AF9-Cas9 celler sensorik med 2 separata anti-DOT1L sgRNAs visade en dramatisk och progressiv förlust över tid jämfört med BFP-ve sgRNA icke-sensorik celler (figur 4b). Däremot förblev förhållandet mellan anti-Rho1 sgRNA relativt oförändrat över tid. Dessa resultat visar den MLL-AF9 uttrycker mus leukemiceller till Dot1l utarmning, bekräftar tidigare publicerade resultat sårbarhet.
Figur 1: representant Western blot resultat visar olika Cas9 nivåer. Enstaka cell kloner av den MOLM13 AML-cellinje sensorik med CAS9 var utforskad för flagg-Cas9 uttryck nivåer med hjälp av anti-Flag antikroppar. Kloner som visar det högsta uttrycket för Cas9 valdes ut för vidare studier. HEK293-T-celler transfekterade med en Cas9 uttryck plasmid användes som en positiv kontroll och Cas9 icke-sensorik MOLM13 celler som negativa kontroller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ analys av gen editering på det Dot1l locus bedömas av ICE analys. En PCR-amplikon centrerad kring webbplatsen Dot1l sgRNA mål var Sanger sekvenserade och analyseras med hjälp av ICE analys. En jämförelse av sgDot1l sekvensen (orange linje) till icke-riktad DNA-sekvens (gröna linjen) visar höga redigering effektivitet i sgDot1l riktade celler runt sgRNA målwebbplatsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk arbetsflöde för de föreslagna metoderna. sgRNAs klonade i sgRNA uttryck vector tillsammans uttrycker en fluorescerande protein såsom BFP. Målceller är sensorik på 30 – 60% transduktion priser och följt av flödescytometri varje 2 – 3 dagar. sgRNAs inriktning gener krävs för AML cellproliferation visar relativ utarmning över tiden som visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat från konkurrens analyser i mänskliga och mus AML celler. (en) resultat visar en statistiskt betydande progressiv nedgång i RPA3 sensorik MOLM13-Cas9 klon B3 celler. SgRNAs inriktning webbplatsen AAVS1 har däremot ingen effekt. (b) sgRNAs inriktning Dot1l visar en anmärkningsvärd och progressiv nedgång i konkurrenskraftiga spridning, i motsats till sgRNAs inriktning Rhodopsin (Rho). p > 0,05. p < 0,05. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: disponeras protokollet. (en) tid för varje steg i produktionen av Cas9 virus och sgRNA kloning beskrivs. Design och kloning av sgRNAs kan utföras medan genererar enda kloner av AML cellinjer med stabil Cas9 uttryck. (b) allmänna protokoll för transduktion av AML cellinjer med sgRNAs och konkurrenskraftig tillväxt assay använder FACS visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cykler | Varaktigheten av cykeln | Temperatur |
| 1 | 2 min | 95 ° C |
| 35 | 30 s | 95 ° C |
| 30 s | 55 ° C | |
| 30 s | 72 ° C | |
| 1 | 5 min | 72 ° C |
| Håll | oändlig | 4 ° C |
Tabell 1: PCR-program för AAVS1 locus förstärkning från genomiskt DNA. PCR-program som används för förstärkning av AAVS1 locus från genomiskt DNA för testning bearbetningens effektivitet av Cas9 i Cas9 uttrycker kloner.
Kompletterande fil: sgRNA oligo sekvenser. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi ett detaljerat protokoll för att bedriva en CRISPR-Cas9-baserade konkurrenskraftiga tillväxt analys för att undersöka betydelsen av kandidatgener i AML cellinjer med flödescytometri i mänskliga/murin AML celler (figur 5). Målet med analysen är att identifiera effekten av genen radering på underhåll av AML cell spridning över två till tre veckor på en medium-genomströmning skala. Vissa kritiska steg måste följas noggrant för att underlätta upptrappningen av protokollet beskrivs. I produktionen av Cas9 lentivirus är det nödvändigt att filtrera virus luftkonditionerade medium genom ett 0,45 µM filter att undvika återlösen av 293T celler till virus som innehåller supernatanten. Under spinfection, inslagning spinfection plattan med cling wrap eller parafilm hjälper till att undvika potentiella föroreningen under centrifugering. Wrap bör dock tas bort innan du placerar spinfected plattan tillbaka i vävnadsodling inkubator. Det är mycket viktigt att bedöma Cas9-uttryckande kloner för redigering effektivitet. Kloner med låg-genomet redigering effektivitet avspeglar otillräckliga Cas9 aktivitet och kan påverka andelen framgångsrika experimentet. I vårt experiment, vi först sensorik mänskliga AML Cas9 kloner med sgRNAs inriktning det AAVS1 locus och sekvenserade deras genomisk DNAs för redigering effektivitet. Jämförelse av den AAVS1 som redigeras och vildtyp sekvenser kan bedömas med online web-baserade verktyg som TIDE8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) eller is (https://ice.synthego.com/#/). Dessa program jämför Sanger sekvens spår av potentiellt redigerade PCR fragment till oredigerad vildtyp eller referens sekvensen och uppskatta frekvensen av förändringar. Detta är ett snabbt sätt att utvärdera mutationsanalys förändringar som den test-sgRNA, som är ett mått på cellulär Cas9 aktivitet. Alternativt, kloning av PCR produkten i en PCR-kloning plasmid som TOPO trubbiga kloning vektor kan utföras, följt av Sanger sekvensering av enskilda kolonier att bedöma editering effektivitet vid sekvens justering av varje klon till den vildtyp. Vi föredrar den tidigare metoden, dess enkelhet och kostnadseffektivitet jämfört med metoden kloning. Typiskt, upptäckten av baspar förändringar såsom punktmutationer, indels osv., på eller runt webbplatsen sgRNA styckning i en stor majoritet av sekvenserade kloner indikera närvaron av en mycket aktiv Cas9. Vi valde därför, MOLM13 eller MLL-AF9 leukemi kloner B3 och 8, respektive, med den högsta redigering effektiviteten för ytterligare experiment.
Vi har utformat sgRNAs inriktning olika gener nämns i protokollet med hjälp av http://crispr.mit.edu/, en web-baserad programvara som ger en lista över sgRNAs. Det rekommenderas att välja topp-scoring sgRNAs från listan för att eliminera de förutspådda off-target effekter. De designade sgRNAs kan klonas med någon av de publicera protokoll såsom en på (http://www.addgene.org/67974/) hemsida. Förnuft och antisense oligos är först fosforyleras och glödgas enligt steget 2.1.5. Det första steget vid 37 ° C är viktigt för phosphorylating oligos med den T4-Kinas och efterföljande PCR cykler är viktiga för glödgning av känsla och anti känsla oligonukleotider till dsDNA. Det är viktigt att ha ett fluorescerande protein i sgRNA kloning vektorn som är avgörande för att spåra sgRNA sensorik celler senare i konkurrens analyserna. sgRNA kloning skalas med användning av 96 väl plattan vid alla steg inklusive glödgning och ligatur. För ligering, ren PCR mikrorör remsor kan också användas eftersom de är kompatibla med multikanal. I fall att omvandlingen av en större uppsättning av sgRNA kloner behövs, en plattan med 96 brunnar i vilken 10 μL av behöriga cellerna är pre-aliquoted i varje brunn och fryst vid-80 ° C kan användas för att påskynda hela processen. Syftet med plätering ligering reaktionerna är att plocka enskilda kolonier, vilket är svårt att utföra i formatet 96 brunnar. Därför för bakteriell omvandling finns det en liten förlust i skalbarhet. Fortfarande, även för plätering av omvandling reaktioner från en hela plattan med 96 brunnar, det kommer bara kräva sammanlagt sexton 6-väl plattor för hela projektet. Man måste vara försiktig i nästa steg av plocka kolonier från omvandling plattorna. Medan strimmor en koloni på en märkta plats, se till att platsen tydligt isolerat från de andra platserna. Markera ett rutnät på undersidan av petriskål med en mörk permanent spritpenna hjälper till att förhindra korskontaminering av bakteriell kloner.
När minipreps sgRNA konstruktioner är redo, kan viruset göras i formatet 96 brunnar. På denna nivå av genomströmning är det opraktiskt att filtrera 200 µL av virus som innehåller supernatanten. Därav, viral supernatanten bör frysas minst över natten för att undvika korskontaminering från 293T celler till supernatanten. Det kan också lagras i 50 µL alikvoter i sterila PCR-röret remsor att undvika frysa upptining av supernatanten. Ytterligare, dessa virus luftkonditionerade supernatanterna används för transducing AML celler. I fall som låga titrar av viral transduktion observeras, mätt med låg frekvens av BFP + ve celler, då kan det vara viktigt att fastställa viral titer och testa transductions på olika multiplicity av infektioner (MOI) för att säkerställa att 40-60 procent transduktion priser. Viral titerbestämning och MOI beräkningen beskrivs i detalj här17. I konkurrens-analysen, som beskrivs i steg 3 i protokollet, är det mycket viktigt att utesluta icke-viabla celler för att förhindra falska konstföremål från auto-fluorescens samtidigt analysera BFP icke-BFP förhållande till. Vid tidpunkten för FACS, innan analysera prover, rekommenderas användning av BFP negativa och BFP positiva kontroller att noggrant ange spänningar. Vid varje nytt bordläggningen tidpunkt beror volymen av cellerna vara åter guldpläterade på koncentrationen av celler vid en given tidpunkt. Vi vanligtvis klädd åter 20 μL från totalt 200 μL vid varje tidpunkt i en färsk bra med 180 μL av färskt medium. Omsorgsfull blandning av celler genom att försiktigt upp och ner precis innan åter plätering med rekommenderas. Vanligtvis har vi observerat att analysen måste utföras under 15 – 20 dagar till varsel starka förändringar i BFP + ve /-ve nyckeltal, även om detta varierar från gen till genen.
Detta experimentella set-up är väl lämpad att testa flera gener parallellt i flera AML cellinjer att snabbt identifiera kandidatgener i överlevnad roll eller spridning av AML celler. En varning av den konkurrenskraftiga spridning-analysen som beskrivs här är att det inte anser potentiella cell-exogena faktorer såsom parakrin signalering händelser från gen-riktade celler som kan påverka den icke-riktade cell befolkningen inom samma väl. Även om detta kan vara en sällsynt företeelse, bör denna faktor bäras i åtanke när de utför denna analys. Även om vi har använt AML som ett exempel för CRISPR-Cas9-baserade konkurrens analyserna beskrivs i detta manuskript, kan denna metod användas för någon cancer cellinje för att identifiera rollen av flera gener parallellt. Det finns olika fördelar med gen-strykningen med CRISPR-Cas9 över gene-knockdown använder RNA-interferens. För det första, i motsats till shRNAs, som vanligen visar ett brett spektrum av mål mRNA hämning, sgRNAs tillsammans med den Cas9 nuclease verkställa komplett knockout av målgener. Detta kan resultera i mer dramatiska och konsekvent fenotyper med CRISPR-Cas9-baserade metoder, även om det måste varnas att inriktning effektiviteten av enskilda sgRNAs samt shRNAs kan variera kraftigt.
Flöde-flödescytometri-baserade konkurrens analysen erbjuder flera fördelar jämfört med traditionella spridning analyser där ett fast antal celler är guldpläterade för att mäta den relativa proliferativa aktiviteten av gen-oroade celler. En fördel är att den relativa proliferativa aktiviteten av celler kan snabbt och enkelt mätas med flödescytometri i flera dagar, förbi behovet av cell räknar varje plätering steg. Detta är användbart när testa ett stort antal kandidat sgRNAs inriktning flera gener, som räknar alla brunnarna är besvärligt och kan leda till felaktigheter. Till skillnad från ATP-baserad mätning analyser för celltillväxt, flödescytometri kan utföras på ett urval av levande celler, vilket gör denna metod till hjälp för långsiktig analys. Detta är speciellt fördelaktigt i studien av faktorer såsom epigenetiska modulatorer, som kan visa sen verkande effekter på spridningen av AML celler och kan kräva långsiktiga analyser. För det andra är förekomsten av icke-sensorik celler inom samma väl möjliggör en väl kontrollerad cell befolkning som kan användas för att ange originalplan för analysen. För det tredje, när set-up i 96 brunnar format, analysen kan nästan helt utföras med flerkanaligt pipetter, avsevärt påskynda hela processen från kloning av sgRNAs till virus förberedelse och så småningom flöde-flödescytometrisk bedömning av fluorescens.
Den metod som beskrivs här kan vara effektivt skalas upp för utredning av upp till 96 sgRNAs parallellt i en klädd skärm. Denna metod förutsatt att 4 – 6 sgRNAs per genen, och kan därför användas för snabba förhör av minst 16 – 24 gener parallellt. Vid större antal gener, såsom ett hela molekylär väg som behöver att förhöras i AML-celler, kommer att poolade CRISPR-Cas9-baserade skärmar vara mer användbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.J.D är en konsult till A2A läkemedel (New Jersey) och Salgomed Therapeutics (San Diego). Andra författare har inga konflikter att deklarera.
Acknowledgments
PCW-Cas9 plasmiden var en present från Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) och den pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W plasmid från Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vill tacka flödescytometri kärnan på SBP medicinsk Discovery Institute för snabb hjälp med Flödesanalys och sortering. Vi skulle vilja erkänna stöd av stiftelsen Lady Tata Memorial till e.Kr. Vi vill också erkänner stöd av de följande finansieringskällorna: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsrade Grant, V-stiftelsen och San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).
