Summary
Wir haben mit eine gold-Nanopartikel-Peptid-Hybrid früher intravenös liefern einen synthetischen Peptid, Protein-Kinase C-Delta-Hemmer, die Ischämie-Reperfusion-induzierten akuten Lungenversagen reduziert. Hier zeigen wir das ausführliche Protokoll der Arzneistoff-Formulierung. Anderen intrazellulären Peptide können in ähnlicher Weise formuliert werden.
Abstract
Protein C-Delta-Kinase-Inhibitor (PKCδi) ist ein vielversprechendes Medikament, Ischämie-Reperfusion-induzierte Orgel Verletzungen zu vermeiden. Es ist in der Regel an eine Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Allerdings hat TAT unspezifische biologische Aktivitäten gezeigt. Gold-Nanopartikel (festzulegenden) kann als Droge Anlieferung Träger ohne anerkannte Toxizität verwendet werden. Daher haben wir eine GNP/Peptid-Hybrid verwendet, um PKCδi zu liefern. Zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW), in einem 95:5 Verhältnis, wurden verwendet, um die Oberflächeneigenschaften des BSP zu ändern. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) sind stabil in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bovine Serum Albumin oder fötalen Rinderserum enthalten. Intravenöser Injektion von GNP-PKCi zeigte zuvor Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur GNP/PKCi zu formulieren und bewerten die physiochemischen Eigenschaften des GNP/PKCi. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente mit BSP zu formulieren. Dieser Artikel wird hoffentlich mehr Aufmerksamkeit auf dieses neuartige intrazellulären Drug-Delivery-Technologie und ihre Anwendungen in-vivo ziehen.
Introduction
Lungen-Transplantation erspart Patienten mit terminaler Lunge Krankheit1. Schwere Komplikationen nach Lungentransplantation bleiben jedoch ein Hindernis. In den frühen Stadien nach Lungentransplantation, primäre Graft Dysfunktion ist die schädlichste Komplikation1und seine Hauptursache ist Ischämie-Reperfusion (IR)-induzierten akuten Lungen-Verletzungen2.
Unter kalten Erhaltung ist Stoffwechsel in einem Spender Lunge beschränkt sich auf einem sehr niedrigen Niveau. Jedoch werden reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid-Synthese aufgrund der Einstellung der Blut fließen3aktiviert. Nach der Transplantation Durchblutung der Haut wird wiederhergestellt und reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid erzeugt während der kalten Ischämie verbessern Entzündung und Zelle Tod, was zu Gewebeschäden.
Zur Vermeidung von Verletzungen IR wurde ein Protein Kinase Cδ Inhibitor (PKCδi) in das Herz, Gehirn und Lunge4,5,6,7,8verwendet. Diese Studien zeigten, dass PKCδi Entzündung und Apoptose während Reperfusion abgenommen. Es hat auch pulmonale IR Verletzung bei Ratten und in eine Lungen-Transplantation Modell6verhindert. PKCδi ist in der Regel mit einer Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Jedoch hat gezeigt, dass die TAT Peptid allein nicht spezifische biologische Wirkungen, einschließlich der Förderung der Angiogenese, Apoptose und Hemmung der mehrere Zytokine9,10,11hat. Nanopartikel, kleine Partikel von 1 bis 100 nm im Durchmesser12, als Kandidaten bei der Erleichterung der Droge Lieferung13erkundet worden. Insbesondere gelten goldene-Nanopartikeln (festzulegenden) als nicht-invasive und ungiftig. Daher haben wir als Medikament Anlieferung Träger für Peptid-basierte Medikamente14,15festzulegenden entwickelt.
Die Oberfläche des festzulegenden kann für spezielle Anwendungen wie molekulare Erkennung16,17, chemische Sensor18, bildgebenden19und Drug-Delivery manipuliert werden. GNP/Peptid-Hybrid-System entwickelt wurde, mit 20 nm festzulegenden und zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW) in einem 95:5 Verhältnis, die Oberflächeneigenschaften der festzulegenden ändern. Das P2-Peptid mit der negativ geladenen Glutaminsäure (E) am Ende, stabilisiert festzulegenden in einer wässrigen Lösung, und das P4-Peptid mit der hydrophoben Tryptophan (W) am Ende hilft festzulegenden Eingang in Zellen14. Cystein (C) Rückstände am N-Terminus dieser Peptide enthält eine Thiol-Gruppe, die in den Goldflächen14konjugieren kann. Dieses Peptid/GNP-Hybrid wurde weiter verwendet, um PKCδi (CSFNSYELGSL) zu liefern. Das optimierte molare Verhältnis von P2:P4 zu PKCδi ist 47.5:2.5:50. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) werden in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und PBS mit bovinen Albumin oder fötalen Rinderserum14stabil. Intravenöser Injektion von GNP/PKCi hat sich gezeigt, Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge15zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um GNP/PKCi formulieren und beschreibt, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften des GNP/PKCi zu bewerten. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente zu GNP20,21,22konjugiert zu formulieren. Wir hoffen, dass dieser Artikel mehr Aufmerksamkeit auf diese neuartige Formulierung zur intrazellulären Wirkstoffabgabe ziehen wird.
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Protocol
1. Vorbereitung der Peptid-Lösungen
- Abrufen der Peptide (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) aus dem Gefrierschrank-20 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur (RT).
Hinweis: Halten Sie die Flasche geschlossen, um verhindern, dass Feuchtigkeit kondensiert auf der Peptide. - Ein Microscale belasten Sie 0,01 g jedes Peptid. Genommen Sie jedes Peptid in eine separate 50 mL konische Rohr.
- Die P2-Röhre 18,74 mL entionisiertem Wasser (DI) hinzufügen.
- Der P4-Tube 16,93 mL DI Wasser hinzufügen.
- Zugeben Sie 8,21 mL 50 % Acetonitril in VE-Wasser, das PKCδi Rohr verdünnt.
- Wirbel der Peptid-Lösungen kurz. Legen Sie die 50 mL konische Röhrchen in einem Sonikator (40 MHz) für 5 min.
- Eine biologische Kabinett bringen Sie die Peptid-Lösungen. Alle Peptid-Lösungen vorbereitet sollte 1 mM betragen.
- Übertragen Sie 1 mL jedes Peptidlösung auf eine neue 50 mL konische Rohr. Die Rohre der P2 und P4 19 mL VE-Wasser hinzu und das PKCδi Rohr fügen Sie 19 mL 50 % Acetonitril hinzu, so, dass jede Lösung bis 50 µM verdünnt und in eine eigene Röhre gespeichert.
2. Formulierung von BSP/PKCi
- Peptide sollte die GNP-Lösung noch in der BSC hinzugefügt werden
- Fügen Sie 475 μL von P2, 25μL P4 und 500 μL δPKCi Lösung in einem 15 mL-Tube. Der gleiche 15 mL Tube 9 mL 20 nm GNP-Lösung (7.0x1011 Partikel/mL) hinzufügen.
- Beenden Sie das Biosafety-Kabinett. Wickeln Sie die 15 mL-Tube mit Alu-Folie. Lassen Sie es über Nacht auf einem Schüttler bei RT.
- Zurück die Proben der Biosicherheits Kabinett. Aliquoten 1 mL der GNP/PKCi in jeder 1,5 mL Mikroröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Rohre in einer Mikro-Zentrifuge für 30 min bei 15.294 x g bei 4 ° C.
- Jedes Rohr unter einen Schrank Biosafety entfernen Sie überstand.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, den Überstand zu entfernen, gleichzeitig sicherzustellen, dass die GNP Pellet erhalten bleibt und wird nicht abgesaugt. - Wieder aussetzen Sie, das Pellet in dem gewünschten Lösungsmittel entsprechend der Konzentration erforderlich. Anwendbaren Lösungsmitteln kann DI-Wasser, PBS und 0,9 % NaCl.
Hinweis: Ab 1 mL der GNP/PKCi, enthält die GNP Pellet 6,3 x 1011 Partikel, basierend auf der GNP-Konzentration des Herstellers. Verwalten von 1,3 x 1012 Partikel in 500 µL von 0,9 % NaCl, fügen wir 232 µL von 0,9 % NaCl zu jedem der drei Pellets. Nach der Zusammenlegung, können wir dann 500 µL GNP/PKCi Lösung sammeln.
Hinweis: Mischen Sie die gewünschte Lösungsmittel vor Verdünnung der GNP/PKCi Pellet, ansonsten GNP/PKCi aggregiert werden.
3. Bewertung der BSP/PKCi Hybrid Löslichkeit
- Gießen Sie 0,5 mL der GNP/PKCi Lösung in einer Küvette Acryl. Legen Sie die Acryl-Küvette auf einem UV-Vis Spektralphotometer und testen Sie die Spitze Absorption15.
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Representative Results
Sollte darauf geachtet werden, die biophysikalischen Eigenschaften des GNP/PKCi Hybrid, zu bewerten wie GNP tendenziell Aggregat in Lösungsmittel. Wenn GNP aggregiert wird, ändert sich die Farbe der Lösung von rosa bis violett (Abbildung 1a). UV-Vis Spektralphotometer ist in der Lage, die Veränderungen empfindlicher zu erkennen. Wenn die GNP/PKCi nicht aggregiert ist der Höhepunkt der Aufnahme sollte bei 525 nm (Abbildung 1 b). Wenn das BSP aggregiert wird, wird die Spitze der Absorption nach rechts verschoben. Als Alternative Methode der Analyse, wenn Aggregate, die ΔOptical Dichte gebildet haben (ΔOD = OD bei 525 nm - OD bei 440 nm) verringert.
Abbildung 1 : Qualität der BSP/PKCi. (A) richtig vorbereitet GNP/PKCi ist rosa in der Farbe (links). Aggregierte GNP/PKCi scheint Licht lila (rechts). (B) gute GNP/PKCi Vorbereitung ist stabil im Wasser, PBS, oder in 0,9 % NaCl-Lösung. Lesungen auf einem UV-Vis-Spektrometer darauf hingewiesen, dass die Spitze der Absorption bei 525 nm in allen Lösungen. (C) ein Beispiel für gute und schlechte GNP/PKCi-Vorbereitungen. Wenn das BSP zusammengefasst wurde, war der Höhepunkt der Absorption nach rechts verschoben. Darüber hinaus verringerte ΔOD. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Um die richtige Formulierung zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass die δPKCi Lösung den Beschallung Schritt in 1.6 beschrieben erfährt. ΔPKCi Peptidsequenz enthält hydrophoben Moieties, so dass ein Sonikator hilft bei der Auflösung von PKCi in der 50 % Acetonitril-Lösung. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, um das Lösungsmittel akribisch, wie in Schritt 2.7 beschrieben mischen. Die GNP/PKCi-Hybrid wird nicht gut formuliert werden, wenn diese Schritte nicht richtig durch die Aggregation der δPKCi Peptid23durchgeführt werden.
GNP-basierte Arzneistoff-Formulierung bietet mehrere Vorteile. Erstens festzulegenden in gut kontrollierte Größen von wenigen Nanometern bis ~ 100 leicht synthetisiert werden können nm. In der Regel liefern die kleinere Größe festzulegenden Medikamente in Zellen effizienter als die größeren wie die kleineren leicht in ihre Ziel-Region24diffundieren können. Zweitens sind festzulegenden ungiftig in vitro und in vivo25, so dass sie sicheres Medikament Träger. Dritte, hydrophobe Medikamente können auf die veränderten festzulegenden26geladen werden. Her, wird die Oberflächenchemie festzulegenden für spezifische Anwendungen leicht modifiziert. In unseren Studien werden zwei kurze Peptide zum Ändern der GNP-Oberfläche, um unter physiologischen Bedingungen zu stabilisieren und neue Bioactivities zu vermitteln. Die Peptide wurden mit drei Regionen einschließlich gold Bindung, Abstand und funktionale Regionen durchdacht. Insbesondere hat der N-Terminus des Peptids Cystein (C) Rückstände mit Thiol-Gruppe, die mit Gold binden können. Der mittlere Teil hat vier hydrophobe Alanin Rückstände, Peptid-Montage in einem dicht gepackten monomolekularen Film auf die festzulegenden zu fördern. Die Aminosäure am C-Terminus ist eine funktionelle Aminosäure zeigen nach außen, die verwendet werden können, um die Oberflächeneigenschaften der festzulegenden zu manipulieren. Das 95:5-Verhältnis dieser beiden Peptide wurde in einer früheren Studie14systemisch ausgewählt. Das Verhältnis zwischen PKCi und P2/P4 Peptide wurde auch systemisch getestet und15ausgewählt.
Auf der anderen Seite hat die GNP Drug-Delivery-System Einschränkungen. Festzulegenden sind nicht Zelltyp oder bestimmte Gewebe. Festzulegenden sind vor allem in der Lunge, Leber und Milz nach intravenöser Gabe27,28,29angesammelt. Bisher wurde diese Formel nur in Zellkultur und kleines Tier getestet Modelle. Um es zu übersetzen, klinische Anwendung, weitere Studien über große Tiermodelle und seine Pharmakokinetik, Verteilung und Potenzial Toxizität Gewebe müssen bestimmt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts, an diesem Projekt offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit stützt sich auf Forschungsstipendien von Canadian Institutes of Health Research (PJT-148847), Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario (RE-08-029) und Kanada erste Forschung der Excellence Program, Medizin von Design an der University of Toronto. Dr. Mingyao Liu ist James und Mary Davie Stuhl Lungenschädigung, Reparatur und Regeneration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
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| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
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