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Chemistry

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die Kosten und die notwendige Ausrüstung für E. Colizu generieren-basierte Zellextrakte und in-vitro- Protein Synthesereaktionen innerhalb von 4 Tagen oder weniger zu implementieren. Um die flexiblen Charakter dieser Plattform für breite Anwendungen nutzen zu können, diskutieren wir Reaktionsbedingungen, die angepasst und optimiert werden können.

Abstract

In den letzten 50 Jahren entstanden zellfreien Protein Synthese (GFP) als eine leistungsstarke Technologie, die transkriptionelle und translationale Kapazität von Zellen in einem Reagenzglas nutzbar zu machen. Durch die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit der Zelle vermieden und durch den Wegfall der zellulären Barriere wurde GFP grundlegend für neue Anwendungen in Biomanufacturing traditionell anspruchsvolle Proteine sowie Anwendungen im rapid Prototyping für Metabolic Engineering und funktionelle Genomik. Unsere Methoden für die Umsetzung einer E. Coli-basierten GFP-Plattform ermöglichen neue viele dieser Anwendungen Zugriff auf. Hier beschreiben wir Methoden um Extrakt durch angereicherte Medien, verblüfft Fläschchen und eine reproduzierbare Methode der einstellbaren Ultraschall-basierte Zelle Lysis vorzubereiten. Dieser Extrakt kann dann für Protein-Expression in der Lage 900 µg/mL oder mehr super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP) in nur 5 h vom Versuchsaufbau zur Datenanalyse, verwendet werden, angesichts der Tatsache, dass entsprechende Reagenz Bestände im Voraus vorbereitet worden sind. Voraussichtliche Inbetriebnahme kostet Reagenzien zu erhalten $4.500, die Tausende von Reaktionen mit geschätzten Kosten von $0,021 pro µg Protein produziert oder $0,019 pro Mikroliter Reaktion aufrechterhalten wird. Darüber hinaus spiegeln die Protein-Ausdruck-Methoden die Leichtigkeit der Reaktion Installation in marktübliche Systeme durch Optimierung des Reagenz Vormischungen, zu einem Bruchteil der Kosten gesehen. Damit den Benutzer die flexible Art der GFP-Plattform für breite Anwendungen nutzen kann, haben wir eine Vielzahl von Aspekten der Plattform identifiziert, die abgestimmt und je nach den verfügbaren Ressourcen und die Protein Ausdruck Ergebnisse optimiert werden können auf Wunsch.

Introduction

Zellfreien Protein Synthese (GFP) hat eine Technologie entwickelt, die eine Reihe von neuen Möglichkeiten für die Proteinproduktion, funktionelle Genomik, metabolische Technik und mehr innerhalb der letzten 50 Jahre1,2freigeschaltet hat. Im Vergleich zu standard in Vivo Protein Ausdruck Plattformen, GFP bietet drei entscheidende Vorteile: 1) die zellfreie Natur der Plattform ermöglicht die Produktion von Proteinen, die potenziell toxischen oder die Zelle3,4 fremd wäre ,5,6; (2) Inaktivierung von genomischer DNA und die Einführung einer Vorlage DNA Kodierung der DNA des Interesses Kanal aller die systemische Energie in die Reaktion auf die Produktion von der Aktivit‰tderzur von Interesse; und 3) der offene Charakter der Plattform ermöglicht dem Benutzer, ändern und überwachen die Reaktionsbedingungen und Zusammensetzung in Echtzeit7,8. Dieser direkte Zugang zur Reaktion unterstützt die Vermehrung von biologischen Systemen mit erweiterten Chemikalien und Redox-Bedingungen für die Produktion von neuartigen Proteinen und der Abstimmung des metabolischen Prozesse2,9, 10. direkter Zugriff erlaubt auch dem Benutzer, die GFP-Reaktion mit Aktivität Assays in einem Single-Topf-System zu verbinden, für mehr Design-Build-Schnelltest11Zyklen. Die Kapazität die GFP-Reaktion in kleinen Tröpfchen oder auf Papier-basierten Geräten weiter unterstützt Hochdurchsatz-Entdeckung Bemühungen und rapid-Prototyping12,13,14,15 ,16. Durch diese Vorteile und die Plug & Play-Natur des Systems ist GFP hat eindeutig ermöglicht eine Vielzahl von Biotechnologieanwendungen wie die Produktion von Proteinen, die schwer zu Schwermetallspuren express- in Vivo17, 18,19,20, Erkennung der Krankheit21,22,23, auf Nachfrage Biomanufacturing18,24 ,25,26,27und Bildung28,29, die zeigen die Flexibilität und den Nutzen der zellfreien Plattform.

GFP-Systeme können aus einer Vielzahl von Rohöl Lysates von beiden prokaryotischen und eukaryotischen Zelle Linien erzeugt werden. Dies ermöglicht vielfältige Möglichkeiten in das System der Wahl, die jeweils vor- und Nachteile je nach Anwendung von Interesse haben. GFP-Systeme sind sehr unterschiedlich in Vorbereitungszeit, Kosten und Produktivität. Am meisten verwendet häufig Zelle, die Extrakte aus Weizenkeimen, Kaninchen Retikulozytenzahl und Insektenzellen Escherichia coli Zellen, wobei letztere die kostengünstigste bisher beim produzieren höchste volumetrische Erträge des Proteins30 hergestellt werden . Während andere GFP-Systeme für ihre angeborene Post-translationale Modifikation Maschinen vorteilhaft sein können, neue Anwendungen mithilfe der E. Coli-basierte Maschinen sind in der Lage, die Lücke durch die Generierung von ortspezifisch phosphorylierten und glykosylierten Proteinen auf Nachfrage31,32,33,34,35.

GFP-Reaktionen können in entweder Charge, kontinuierlichen Austausch zellfreie (CECF) oder kontinuierlichen Fluss zellfreie (CFCF) Formate ausgeführt werden. Das Batch-Format ist ein geschlossenes System, deren Reaktion Lebensdauer aufgrund der abnehmenden Mengen der Reaktionspartner und die Anhäufung von hemmenden Nebenprodukte der Reaktion beschränkt. CECF und CFCF Methoden erhöhen die Lebensdauer der Reaktion und damit höhere volumetrische Protein Renditen im Vergleich zu den Batch-Reaktion führen. Dies geschieht dadurch, dass die Nebenprodukte der Proteinsynthese den Reaktionsbehälter entfernt werden, während neue Reaktionspartner im Laufe der Reaktion2geliefert werden. Bei CFCF kann das Protein des Interesses auch aus der Reaktionskammer, während in CECF, das Protein des Interesses bleibt in der Reaktionskammer, bestehend aus einer halbdurchlässigen Membran36,37entfernt werden. Diese Methoden sind besonders wertvoll bei der Überwindung der schlechten volumetrische Erträge schwer Express Proteine des Interesses38,39,40,41,42, 43. Die Herausforderungen bei der Umsetzung der CECF und CFCF Ansätze sind, dass (1) während sie eine effizientere Nutzung der Bio-Maschinen verantwortlich für Transkription und Translation führen, benötigen sie vor allem größere Mengen an Reagenzien, die Gesamtkosten und 2 erhöht) Sie erfordern komplexere Reaktion Setups und spezialisierte Ausrüstung im Vergleich zu den Batch-Format-44. Um Barrierefreiheit für neue Benutzer zu gewährleisten, beschriebenen die Protokolle hier Fokus auf dem Batch-Format bei Reaktion Volumen von 15 µL mit konkreten Empfehlungen für die Erhöhung des Volumens der Reaktion auf die Milliliter-Skala.

Die hier vorgestellten Methoden ermöglichen Laien mit grundlegenden Labor Fähigkeiten (z. B. Studenten) implementieren Zellwachstum, Vorbereitung zu extrahieren und batch-Format Reaktion Setup für eine E. Coli-basiertes GFP-System. Dieser Ansatz ist kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Kits ohne Einbußen bei der Einfachheit der Installation Kit-basierte Reaktion. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz Anwendungen im Labor und im Feld. Bei der Entscheidung zur Umsetzung der GFP, sollten neue Benutzer die Wirksamkeit der konventionellen Protein Expressionssysteme für Start-up-Investitionen, gründlich auswerten, wie GFP möglicherweise nicht in jedem Fall überlegen. Die hier beschriebenen Methoden GFP ermöglichen dem Benutzer direkt implementieren eine Reihe von Anwendungen, einschließlich der funktionellen Genomik, Hochdurchsatz-Tests, die Produktion von Proteinen, die unlösbar für in Vivo Ausdruck sowie Feld Anwendungen, einschließlich Biosensoren und Bildungs-Kits für synthetische Biologie. Zusätzliche Anwendungen wie z. B. metabolische Technik, Abstimmung von Protein Ausdruck Bedingungen, Krankheit Erkennung, und skalieren mit CECF oder CFCF Methoden sind immer noch möglich, aber erfordern Erfahrung mit der GFP-Plattform für weitere Modifikation der Reaktion Bedingungen. Unsere Methoden kombinieren Wachstum in angereicherten Medien und ratlos Fläschchen mit relativ schnelle und reproduzierbare Methoden der Lyse der Zelle durch Beschallung, gefolgt von einem vereinfachten GFP Reaktion-Setup, das optimierte Vormischungen45nutzt. Während die Zellwachstum Methoden etwas in diesem Bereich standardisiert werden, unterschiedlich Methoden zur Lyse der Zelle. Gemeinsamen Lyse Methoden gehören neben Beschallung Auslastung der französischen Presse, ein Homogenisator, Wulst Schläger, oder Lysozym und anderen Störungen der biochemischen und physikalischen Methoden46,47,48, 49. mit unserer Methode, ca. 2 mL Rohöl Zelle Extrakt pro 1 L Zellen stammen. Diese Menge von Zelle-Extrakt unterstützen vierhundert 15 µL GFP Reaktionen, jedes produzierenden ~ 900 µg/mL Reporter SfGFP Eiweiß aus der Vorlage Plasmid pJL1-SfGFP. Diese Methode kostet $ 0,021/µg von SfGFP hergestellt ($.019/µL Reaktion), ausgenommen die Kosten für die Arbeit und Ausrüstung (ergänzende Abbildung1). Ausgehend von der Pike auf, diese Methode kann von einer einzelnen Person in 4 Tagen umgesetzt werden und wiederholen Sie GFP Reaktionen innerhalb von Stunden (Abbildung 1) abgeschlossen werden können. Darüber hinaus kann das Protokoll in Volumen für größere Chargen von Reagenz Vorbereitung entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers skaliert. Wichtig ist, kann die hier vorgestellten Protokoll von Labor ausgebildete Laien wie Studenten, implementiert werden, wie es nur grundlegende Labor Fähigkeiten erfordert. Der nachstehend beschriebenen Verfahren und das dazugehörige Video wurden speziell entwickelt, um die Zugänglichkeit der E. Coli -GFP-Plattform für den breiten Einsatz zu verbessern.

Protocol

(1) Media-Vorbereitung und Zellwachstum Tag1 Streifen BL21*(DE3) E. Coli Zellen aus einem Glycerin auf eine LB-Agar-Platte auf Lager und mindestens 18 h bei 37 ° c inkubieren Bereiten Sie 50 mL LB Medien und Autoklaven die Lösung auf einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C. Bei Raumtemperatur lagern. Tag2 Bereiten Sie 750 mL 2 X YTP Medien und 250 mL 0,4 M D-Glucose-Lösung, wie in die ergänzenden Info…

Representative Results

Wir haben ein Ultraschall-basierte E. Coli Extrakt präsentiert Vorbereitung-Protokoll, das über einen Zeitraum von vier Tagen mit Abbildung 1 zeigt die verfahrensrechtliche Aufschlüsselung über jeden Tag abgeschlossen werden kann. Gibt es Formbarkeit zu den Schritten, die jeden Tag mit verschiedenen anhalten Punkten abgeschlossen werden können, aber wir haben festgestellt, dass dieses Workflows, die effektivste ausgeführt werden. Darüber hinau…

Discussion

Zellfreie Proteinsynthese ist eine leistungsfähige und förderlichen Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen von Biomanufacturing bis hin zu rapid Prototyping von biochemischen Systemen entstanden. Die Bandbreite der Anwendungen stützt sich auf die Fähigkeit zu überwachen, zu manipulieren und zellulären Maschinerie in Echtzeit zu erweitern. Trotz der wachsenden Auswirkungen dieser Plattform-Technologie, breiten Anpassung blieb langsam durch technische Feinheiten bei der Umsetzung der Methoden. Durch diese Bem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autoren möchten Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher, und Tony Turretto für den technischen Support, Wesley Kao, Layne Williams und Christopher Hight für hilfreiche Diskussionen anerkennen. Autoren erkennen auch finanzielle Unterstützung von Bill und Linda Frost Fonds, Zentrum für Anwendungen in der Biotechnologie Chevron Biotechnologie angewendet Endowment Forschungsstipendium, Cal Poly Forschung Scholarly und kreative Aktivitäten Grant Program (RSCA 2017), und die National Science Foundation (NSF-1708919). MZL erkennt an der California State University Graduate Grant. MCJ der Army Research Office W911NF-16-1-0372 anerkennt, National Science Foundation gewährt, MCB 1413563 MCB-1716766 und der Luftwaffe Forschung Labor Center of Excellence Grant FA8650-15-2-5518, die Verteidigung Bedrohung Reduktion Agentur Grant HDTRA1-15-10052/P00001, der David and Lucile Packard Foundation, die Camille Dreyfus Lehrer-Scholar Program, die Abteilung von Energie BER Grant DE-SC0018249, die menschliche Frontiers Science Program (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant, und das Chicago biomedizinische Konsortium mit Unterstützung der Searle-Fonds auf der Chicago Community Trust für Unterstützung.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
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Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
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