Summary
Skelettmuskulaturen differentiering är en mycket dynamisk process, som särskilt bygger på nukleära positionering. Här, beskriver vi en metod att spåra atomkärnor rörelser av levande cell imaging under gorgina differentiering och myotube bildning och utföra en kvantitativ karakterisering av atomkärnor dynamik genom att extrahera information från automatisk spårning.
Abstract
Nukleära positionering inom celler är viktigt för flera cellulära processer i utveckling och förnyelse. Det mest spännande exemplet på nukleära positionering sker under skelettmuskulaturen differentiering. Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler bildas genom fusion av föregångare muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering. Korrekt nukleära positionering inom myofibers krävs för korrekt muskel förnyelse och funktion. Det enhetliga förfarandet att bedöma gorgina differentiering och myofiber bildandet är beroende av fasta cellerna analyseras av immunofluorescens, vilken hindrar studiet av kärntekniska rörelsen och cell beteende över tid. Här, beskriver vi en metod för analys av gorgina differentiering och myofiber bildandet av levande cell imaging. Vi erbjuder en programvara för automatiserad nukleära tracking för att få en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende (dvs banan) under differentiering och fusion.
Introduction
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i den mänskliga kroppen, totalt 35-40% av kroppen massa1. Satellit celler är muskelstamceller, anatomiskt kännetecknas av deras position (kontrasteras till plasmamembranet, under den basala lamina av muskelfibrer), som ger upphov till prolifererande myoblasts (myogenic progenitorceller), som så småningom differentiera och integrera i befintliga myofibers eller säkring till formuläret ny myofibers2,3,4. Deras upptäckt och framsteg i studien av deras biologi har lett till betydande insikter i muskelutveckling och förnyelse.
Protokoll att isolera och differentieras myoblasts till myotubes har utvecklats för många år sedan och fortfarande ofta används för att studera skelettmuskulaturen differentiering5,6,7. De flesta av dessa metoder utgör dock statiska procedurer som förlitar sig på en analys av fasta celler och, följaktligen, inte tillåter forskare att fullt utforska högdynamiska processer, såsom gorgina fusion och myofiber mognad. Det mest slående exemplet är kärnkraft positionering, som är hårt reglerad, med kärnor från början i mitten av myofiber och, sedan, ligger på periferin efter myofiber mognad8,9. Levande imaging är den lämpligaste tekniken för att få ytterligare insikter om sådant märkliga fenomen.
Här beskriver vi en metod som gör det möjligt för forskare att registrera gorgina differentiering och myotube bildandet av time-lapse Mikroskopi och utföra kvantitativa analyser från automatisk spårning av gorgina atomkärnor. Denna metod ger en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende under differentiering och fusion. Protokollet är uppdelad i fyra olika delar, nämligen (1) samling av muskler från bakbenen av möss, (2) isolering av primära myoblasts som består i mekaniska och enzymatisk nedbrytning, (3) gorgina proliferation och differentiering och (4) Live imaging att spåra atomkärnor inom de första 16 h gorgina differentiering.
I följande procedur, är myoblasts isolerade från H2B-GFP möss och behandlas med 1 µg/mL av doxycyklin att inducera H2B-GFP uttryck, som tidigare beskrivits10. Alternativt är det möjligt att isolera myoblasts från andra transgena möss som uttrycker ett fluorescerande protein i cellkärnan eller transfect celler isolerade från vildtyp möss att uttrycka ett fluorescerande protein i cellkärnan, som beskrivs av Pimentel et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som berör animaliska ämnen godkändes av San Raffaele institutionella djur vård och användning kommittén.
1. dissektion av mus bakbenet muskler
- Sterilisera pincett och sax (både raka och böjda) i autoklav.
- Förbereda och filtrera (0,22 µm) alla medier (blockerande medel, matsmältningen medium, frodas medium, och differentiera medium) innan experimentet (se Tabell för material).
- Lägg 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i en 35 mm petriskål för muskel samling.
- Offra musen genom cervikal Dislokation eller använda CO2 och sterilisera huden med etanol. Ta bort huden från bakbenen och armar med sax och pincett, för att underlätta isolering av muskler.
Obs: Muskler kan isoleras från neonatal eller vuxna möss. Neonatala möss har ett ökat antal satellit celler jämfört med vuxna möss. Det totala antalet satellit celler som kan isoleras från en enda vuxen mus är dock tillräcklig för att utföra experimentet beskrivs nedan. - Isolera tibialis, soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius, quadriceps och triceps och sätta dem i petriskål som innehåller PBS. Låt skålen på is. Ta försiktigt bort senor och fett med steriliserad sax och pincett.
2. isolering av primära myoblasts
Obs: Alla förfaranden för cellodling görs i sterila förhållanden.
- Ta bort musklerna från PBS. Skär och finhacka musklerna, genom att använda sterila böjd sax, tills en enhetlig massa erhålls. Lägg de muskel bitarna i en 50 mL tub.
- Tillsätt 10 mL av matsmältningen medium till muskel bitar och inkubera vid 37 ° C i 30 min under stark agitation (250 min-1) i vattenbad, enzymatiskt smälta musklerna.
- Tillsätt 10 mL av Dulbecco's modified örnens medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% glutamin, 1% penicillin/streptomycin och 1% gentamicin (blockerande medel) att stoppa matsmältningen.
- Centrifugera vid 40 x g i 5 min och samla supernatanten i en 50 mL tub. Spara pelleten på is.
Obs: Efter centrifugeringen, supernatanten innehåller vissa satellit celler, blodkroppar, endotelceller och fibroblaster, medan pelleten innehåller bitar av osmält muskler och bindväv. För att öka antalet isolerade celler, underkastas pelleten ytterligare steg i matsmältningen som beskrivs nedan. - Centrifugera supernatanten vid 650 x g för 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL DMEM innehållande 10% FBS. Hålla den återsuspenderade pelleten på is.
- Upprepa steg 2,2 – 2,5 2 x för resten av pelleten erhölls i steg 2,4 och Lägg därefter återsuspenderade pelletar till den första återsuspenderade pelleten bevarad på is.
- Passera de återsuspenderade pelletarna genom ett 70 µm filter och sedan genom en 40 µm filter. Tillsätt 15 mL DMEM med 10% FBS och centrifugera vid 650 x g i 5 min.
- Återsuspendera cellpelleten i 3 mL lyseringsbuffert röda blodkroppar att tömma de röda blodkropparna. Inkubera det 5 min i rumstemperatur. Tillsätt 40 mL PBS att stoppa Lys av de röda blodkropparna, och centrifugera 650 x g i 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 mL DMEM med 10% FBS.
- Platta celler i 20 mL spridning medium i en 150 mm obestruket petriskål som preplating steg. Efter 1 h inkubation i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2), samla medium.
Obs: Fibroblaster, fästa på plattan, sedan ignoreras, medan satellit celler kvar i suspension. - Upprepa steg 3 för 2,9 x och, vid sista preplating steg, samla det medium som innehåller satellit celler i suspension.
- Centrifugera vid 650 x g under 5 minuter.
- Medan cellerna centrifugering, coat två 150 mm petriskålar med kollagen (10 mL av en 0,1% lösning i 0,1 M ättiksyra). Att göra detta, sätt kollagen på tallriken, Inkubera i 5 min och ta bort den. Låt plattan torka i 30 min.
- Avlägsna supernatanten erhölls i steg 2.11 och återsuspendera cellpelleten i 40 mL spridning medium (Tabell för material). Tallrik två kollagen-belagd 150 mm petriskålar (20 mL per maträtt) celler och hålla celler i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) i spridning medium i 2 – 3 dagar med 1 µg/mL av doxycyklin att inducera H2B-GFP uttryck.
Obs: Detta steg kan spridningen av myoblasts att erhålla ett högre antal celler för vidare analyser. Celldensitet underhålls mycket låg för att undvika en spontan differentiering av myoblasts i myotubes.
3. gorgina proliferation och differentiering analyser
Obs: När gorgina densitet är hög, vissa celler initiera töjning, och då är det nödvändigt att dela upp cellerna. Generellt, är det möjligt att dela celler 2 x-3 x utan att påverka deras fenotyp.
- Kassera mediet, tvätta cellerna med 5 mL PBS, tillsätt 2 mL av trypsin (1 x), och inkubera plattan vid 37 ° C i en cell inkubator för 5 min. Kontrollera under mikroskopet och, runda celler lossa, tillsätt 5 mL av DMEM med 10% FBS att inaktivera trypsin. Räkna antalet celler (vanligtvis det är möjligt att få ca 1 x 106 celler/mus).
Obs: Inkubation med trypsin för 5 min är oftast tillräckligt för att lossa den prolifererande myoblasts. - Cellerna är föremål för en av de analyser som beskrivs nedan.
-
Proliferation assay
- Plåt 50 000 celler per brunn i 1 mL/väl för spridning medium i en kollagen-belagd 12-well platta och inkubera guldpläterade celler i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fixa och räkna cellerna vid 24, 48 eller 72 h.
Obs: Medium ersätts varje 48 h för att undvika näringsämnen utmattning.
- Plåt 50 000 celler per brunn i 1 mL/väl för spridning medium i en kollagen-belagd 12-well platta och inkubera guldpläterade celler i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fixa och räkna cellerna vid 24, 48 eller 72 h.
-
Differentiering-analys
- Coat en 12-well platta med 350 µL av differentiering medium innehållande basalmembranet matrix (1: 100). Inkubera plattan vid 37 ° C i 30 min och ta bort medlet.
- Tallrik 200 000 celler per brunn differentiering medium i matrix-belagd plåt. Inkubera cellerna i en cell kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) tills de iakttar plattan (2 h är i allmänhet tillräckligt för cellerna att följa och att starta differentiering).
- För att bedöma differentiering, utföra färgning för myosin heavy chain och kärnor som tidigare beskrivits11. Alternativt utföra live-imaging analyser som beskrivs nedan.
-
Proliferation assay
4. Live-imaging gorgina differentiering och nukleära spårning
- För levande cell imaging, sätta cellerna, erhållits i avsnitt 3.2.2 och klädd i en 12-well platta, under en confocal Mikroskop, utrustad med en inkubation för att behålla cellerna vid 37 ° C i 5% CO2.
- Använd en torr 20 x-objektiv (0.7 NA) för att få synfält med hundratals celler, nog för att övervaka myofiber bildandet. H2B-GFP celler kan avbildas med en låg intensitet 488 nm Argon laser.
Obs: En öppen pinhole säkerställer att bilddjup (~ 10 µm) innehåller cell tjocklek så att cellerna hålls i fokus under hela försöket. Med confocal Mikroskop är fördelaktigt eftersom det förbättrar signal-brus-förhållandet mellan bilderna, även om wide-fältet mikroskopi kan också användas. Myofiber bildandet kan övervakas genom överföringskanalen. - Skaffa bilder av 16-bitars och 1 024 x 1 024 pixlar per bildruta varje 6 min för 16 h. För varje förvärvad position, generera en multiframe.tif fil (se exempel i Kompletterande filer).
Obs: I detta protokoll, kommersiell programvara som är associerad med mikroskopet (Tabell för material) har använts; Använd lämplig programvara för att uppnå samma mål när du använder andra Mikroskop. - Ladda ner den programvara som tillhandahålls som en zip- kompletterande fil.
Obs: Rutinerna är skript som måste köras i MATLAB. Programvaran är en anpassning av en publicerad programvara12 optimerad för spårning av atomkärnor under myotube bildande. Denna programvara är uppdelad i två delar: den första som identifierar kärnan i varje bildruta genom att segmentera dem, medan den andra en genererar ”tracks” (banor) atomkärnor rörlighet. Den fullständiga koden för nukleära segmentering och spårning och en stegvis guide för att komma igång finns i Kompletterande filer. - Extrahera zip-filen och spara den i en önskad sökväg på din dator (PC) används. Utföra alla de nedan passager på en PC med den nödvändiga programvaran redan installerad. Observera att zip-filen består av tre mappar som nämns nedan.
Obs: Segmentering rutiner innehåller funktionerna som ska köras för segmentering. Spårning rutiner, i stället innehåller de funktioner som krävs för spårning. Exempel segmentering spårning ger grundläggande skript och filer för att bekanta dig med systemet. Programvaran används för segmentering och spårning på atomkärnor fungerar korrekt i MATLAB, R2015a eller senare versioner. - För att segmentera kärnorna från TIF filen, filnamnet, till exempel NameFile.tif.
- Öppna mappen Exempel segmentering spårning och klicka på DoSegmentation.m. Detta öppnar kommandofönstret i MATLAB.
- Kontrollera fönstret Aktuell mapp till vänster för att se alla element i mappen Exempel av segmentering spårning . Dubbelklicka på DoSegmentation.m.
Obs: Detaljerad information om de ändringar som måste göras i skriptet kan hittas i filen StepbyStep.txt. Det är obligatoriskt att ändra skriptet så att den rörliga filenameinput är NameFile.tif och folderinput är mappen där filen .tif ingår. - Kör skriptet (genom att klicka på gröna kör knapp). Resultatet av segmenteringen kommer att sparas som en file.mat (SegmentedNameFile.mat), medan segmentering av atomkärnor kan visualiseras i bilden utdata.
Observera: Parametrar för segmentering, beskrivs i skriptet, kan ändras om det behövs. Kvaliteten på segmentering kan kontrolleras med hjälp av skriptet CheckSegmentation.m (se filen StepbyStep.txt). Baserat på detta, om kvaliteten på segmentering är dålig (endast några kärnor upptäckt), justera parametrarna för segmentering, tydligt anges i den DoSegmentation.m skriften, och upprepa proceduren.
- Generera spår (dvs trajectoriesen av atomkärnor i tiden), använder de nukleära positionerna erhållits i segmentering, kör skriptet GenerateTracks.m i samma arbetsmappen. Glöm inte att lägga till filen korrekt segmentering som indata, erhållna innan (se filen StepbyStep.txt för ytterligare information).
Obs: Som utdata, användaren kommer att få en fil TrackedNameFile.mat, med en matris för x-koordinater och en annan matris för y-koordinaterna för de genererade spår. - Utvärdera kvaliteten på spåren med hjälp av CheckTracking.m (se filen StepbyStep.txt för ytterligare information). Använd utgång figurera av denna senaste passage för att visualisera varje atomkärnor position i tid. Kolla till vänster för gröna korsen som visar varje segmenterade nucleus. Välj en specifik nucleus, använda lägre rullningslisten. Observera att valda kärnan kommer vara inringad i rött, medan på höger, banan för den markerade cellen kan följas i tid (med hjälp av den övre rullningslisten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att automatiskt följa kärntekniska rörelsen under gorgina differentiering i levande imaging, bör företrädesvis atomkärnor märkas fluorescently. Det är viktigt att notera att använda DNA-infoga molekyler inte är möjligt eftersom dessa molekyler störa proliferation och differentiering av primära myoblasts13. Som ett exempel, har proliferation och differentiering analyserats i primära myoblasts odlade med eller utan Hoechst (figur 1). Det är uppenbart att spridning (figur 1A, B) och differentiering (figur 1 c, mellersta panelen) är starkt försämras myoblasts odlade med Hoechst 33342. Omvänt, myoblasts isolerade från H2B-GFP möss och odlade med doxycyklin har kärnor med grön fluorescens och skilja på samma sätt till myoblasts isolerade från vildtyp möss (figur 1 c, höger och vänster paneler, respektive).
Levande cellen imaging med primära myoblasts uttrycker proteinet H2B-GFP tillåter spårning på atomkärnor under differentiering (figur 2 och kompletterande Video 1). Sammanslagna bilder av överföring och god Jordbrukarsed kanaler vid initial (figur 2A) och sista gången punkter (figur 2B) under differentieringen av H2B-GFP myoblasts tillåter forskare att identifiera myotubes och följaktligen atomkärnor som hamnar att integrera i en myotube (t.ex. kärnan i den blå cirkeln) eller kärnor som inte smälter i en myotube (t.ex. kärnan i den röda cirkeln).
För att extrahera information om kärnor deponicell rörelser från levande cell imaging data, är det möjligt att använda den medföljande programvaran för att spåra trajectoriesen av atomkärnor. Programvaran använder bilden från kanalen H2B-GFP (kärnor; Figur 3A) att skapa en mask och att segmentera kärnor i varje ram. För nukleära segmentering i en ram väljs en ”konservativ” tröskel med Otsu metod på bild efter Gaussisk filtrering14. Nästa, objekt är ungefär segmenterad; för att få en finare segmentering, är varje objekt maskerad igen med ett tröskelvärde som baserat på genomsnittet i dess begränsningsram. En vattendelare transformering används sedan för att separera närliggande objekt (figur 3B). I våra händer, en vattendelare omformar har kunnat skilja de flesta närliggande atomkärnor (figur 3B, * infälld). Således, vi använde området och markera de största objekt i bilden som du kan tillämpa en ny vattendelare omvandling (figur 3B, ** infälld), som är kompetent att separera ytterligare närliggande atomkärnor. Med detta synsätt identifieras de flesta av atomkärnor i bilden (figur 3 c).
För att spåra atomkärnor, förbättrade vi rutiner genom att införliva de spårning rutiner utgiven av Tinevez15. Kort sagt, länkar spårning algoritmen atomkärnor som upptäckts i bildrutor i syfte att minimera summan av avstånden mellan positionen för varje kärna i en ram och position av samma kärnan i nästa, med ”ungerska algoritm” för sådan minimering16. Steget upprepas för att länka olänkade kärnor som är upp till ett visst högsta antal ramar bort. En tröskel för det maximala avståndet mellan positionen för ett objekt i en ram och nästa är också etablerad. För de data som presenteras här, ger ett maximalt antal fem ramar och ett maximalt avstånd på 20 pixlar per steg ett högt antal rätt spår (figur 3D). Ännu viktigare, kan vi använda dessa rutiner för att kontrollera kvaliteten på spårning. Det är också möjligt att använda detta skript för att hitta celler som har ett visst beteende, till exempel bildar (eller inte) en myofiber, och därefter analysera de dynamiska funktionerna i uppsättningen celler av intresse.
Tillämpad programvaran genererar spåren med x - och y-koordinaterna för varje cell i frame n, 
, för hundratals celler (figur 3D). Vi kan använda sådan information för att extrahera information om kärnor rörelse. Som ett exempel, den totala förskjutningen mellan den första bildrutan (n = 0) och den sista bildrutan N definieras enligt följande.
Förskjutning av en bana = || 
||
Här ”, || · ||” står för normen av vektorn (figur 4A).
Hastigheten för varje kärna i frame n är som följer.
Sedan kan vi definiera längden på en bana för en given cell enligt följande.
Längden på banan =
Som ett exempel på hur dessa enkla parametrar redan kan ge relevant information, beräknade vi längden av atomkärnor banor av myoblasts inkuberas med eller utan Hoechst. Det verkar som den totala längden av banor är något högre för cellerna färgas med Hoechst, även om skillnaden inte är signifikant (figur 4B). När vi beräknade totala förskjutningen under en tid förflutit, konstaterade vi dock att den totala förskjutningen av celler som färgas med Hoechst var betydligt mindre än i ofärgade celler (figur 4 c). Detta indikerar att rörelsen av färgade celler har en lägre riktverkan. För att ytterligare stärka denna hypotes, kvantifierade vi riktningen på rörelse i en cell genom att beräkna vinkeln på hastigheten i varje ram (figur 4A).
Vi kvantifierades också variationen i vinkeln mellan ramar.
Den totala vinkel variationen längs en bana kan sedan fastställas enligt följande.
Summa vinkel variation =
Som förutspått, är den totala vinkel variationen för de ofärgade cellerna betydligt mindre jämfört med celler som färgas med Hoechst (figur 4 d). Därför visar denna enkla åtgärd av riktverkan, erhålls från en enkel beräkning att de myoblasts färgas med Hoechst är mindre benägna att bibehålla riktningen av deras deplacement, vilket speglar deras nedsatt förmåga i att bilda myotubes (figur 1).
Kort sagt, levande cell imaging data som genereras som beskrivs här ge en kvantitativ länk mellan nukleära dynamics och förmågan att bilda myotubes och kan användas som indata för en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamik och gorgina beteende under differentiering och fusion.
Figur 1: inkubation med Hoechst stör proliferation och differentiering av myoblasts. (A) representativa bilder av primära myoblasts färgas med Hoechst efter 24 h i spridning medium (till vänster) eller odlade för 24 h i spridning medium med Hoechst (höger panel), och (B) relativ kvantifiering. Uppgifterna är det medelvärde ± SEM, och den statistiska signifikansen bedömdes med Student's t-test. P < 0,05. (C) representativa bilder av primära vildtyp myoblasts, odlade för 24 h i differentiera medium utan (till vänster) eller med Hoechst (mellersta panel), och av H2B-GFP myoblasts odlade för 24 h i differentiera medium (höger panel) och målat med Hoechst (blå) och en anti myosin heavy chain antikropp (MyHC; röd). Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Live avbildning av H2B-GFP myoblasts under differentiering. Sammanslagna bilder av överföring och god Jordbrukarsed kanaler vid (A) ursprungliga (t = 0 h) och (B) sista gången punkter (t = 16 h) under differentieringen av H2B-GFP myoblasts (20 x mål). Några exempel på myotubes är markerade med svarta pilar i panelen B. Skala barer = 50 µm. (C) förstorad prickade områden från paneler A och B där det är möjligt att identifiera en enda kärna som slutar upp att integrera i en myotube (i blått) eller inte (i rött) vid t = 0 h, t = 8 h och t < / C12 > = 16 h. Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: segmentering av H2B-GFP myoblasts spårning under differentiering. (A) exempel på en bildruta på de tiden förfaller visar atomkärnor av ungefärligt 400 celler. (B) exempel på kärnor maskering och segmentering. Ljusa föremål segmenteras med både en global och en lokal tröskel och en vattendelare omvandling används för att separera närliggande atomkärnor. Närliggande atomkärnor kan vara svårt att segmentet (* infällda), så en andra vattendelare-baserade segmentering utförs i objekt av stora områden att segmentera ett högre antal atomkärnor (** infälld). (C) upptäckt kärn positioner (röda kors), som senare används i spårning algoritm. (D) spår genereras med hjälp av spårning algoritmen som minimerar summan av avstånden mellan varje objekts position i två bildrutor. Ett högsta möjliga värde på sådana avstånd för varje objekt tillhandahålls som en ingång som tillåter forskare att länka atomkärnor skiljs åt av fler än en bildruta. Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: kvantitativa analyser av atomkärnor dynamics avslöja myoblasts inkuberas med Hoechst nedsatt förmåga att upprätthålla cell riktningsverkan. (A) Beskrivning av parametern mätningar. Det är möjligt att definiera hastigheten av en kärna av med tanke på positionen i två bildrutor. Bollbana vinkeln och vinkel variationen kan sedan lätt beräknas från ståndpunkterna som anges i systemet. (B) fördelningen av banor längd, (C) slagvolym och (D) variant av banor vinkel myoblasts inkuberas utan Hoechst (gröna linjen) eller med Hoechst (blå linje). De två distributionerna är inte signifikant, medan den totala förskjutningen är betydligt högre och variationen av vinkeln är betydligt lägre för ofärgade celler (ensidig Kolmogorov-Smirnov test, *p < 0,05 och **p < 0,005). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Video 1: Live avbildning av H2B-GFP myoblasts under differentiering. Avbildning av H2B-GFP myoblasts odlade skilja medium från ursprungliga (t = 0 h) till slutliga tidpunkter (t = 16 h) använder överföring och god Jordbrukarsed kanaler (20 x mål). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler som bildas genom fusion av prekursorer muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering2,3, 4. För att bedöma gorgina differentiering, består det gemensamma förfarandet av odlingsskålar myoblasts gäller att differentiera medium och åtgärda cellerna vid olika tidpunkter att utföra immunofluorescens färgning för MyHC, en markör för differentiering och färgning av kärnor med DNA-infoga molekyler (t.ex. Hoechst)5. Denna metod är användbar att utvärdera gorgina differentiering genom att mäta olika parametrar, till exempel differentiering index (antalet MyHC-positiva celler/total cell) eller fusion index (antal myotubes med minst två kärnor/totala cell) . Gorgina fusion och myotube bildning är dock mycket dynamiska processer som förlitar sig på motiliteten av kärnor8. Faktiskt, nukleära positionering inom myofibers krävs för korrekt muskel förnyelse och funktion17. Rörlighet av myoblasts och deras kärnor kan visa sig vara en kritisk parameter att utvärdera gorgina differentiering och att avslöja nya defekter i muskelsjukdomar. Därför är det viktigt att utveckla nya förfaranden för att studera cell beteende och kärntekniska rörelsen under gorgina differentiering och myofiber bildandet.
Här beskriver vi en metod som gör det möjligt för forskare att följa gorgina differentiering och myotube bildandet av levande cell imaging och utföra kvantitativa analyser från automatisk spårning av atomkärnor. Fördelen med denna metod är möjligheten att spåra under differentieringen av fluorescerande kärnor av myoblasts, isolerade från H2B-GFP möss, utan cell transfection eller ytterligare färgning. H2B-GFP möss är kommersiellt tillgängliga och därmed lättillgängligt. Alternativt är det möjligt att isolera myoblasts från andra transgena möss som uttrycker ett fluorescerande protein i cellkärnan eller till transfect celler isolerade från vildtyp möss att uttrycka ett fluorescerande protein i cellkärnan, som tidigare beskrivits9 . Dessa olika alternativ ytterligare utöka de potentiella tillämpningarna av metoden presenteras här.
Det nuvarande protokollet bygger på kulturen av primära myoblasts, och följaktligen en hög variabilitet kan observeras i följande experimentella procedurer, också på grund av den potentiella förekomsten av nonmyogenic celler efter isolering från muskler18 . För att övervinna denna begränsning, är det möjligt att isolera myoblasts av cell sortering som tidigare beskrivits19. En annan kritisk punkt i den metod som beskrivs här är svårigheten att skapa en perfekt spårning på atomkärnor när celler är nära varandra, som under myotube bildande. Dock de programrutiner som diskuteras här tillåter forskare att visuellt inspektera kvaliteten av spårning och, om nödvändigt, att välja en delmängd av celler av intresse för efterföljande analys. Ytterligare förbättringar av programvaran kan krävas för att ge en fullständig karakterisering av nukleära dynamics under myofiber bildandet.
Avslutningsvis är denna metod användbar för att ge kvantitativa insikt i atomkärnor dynamics under gorgina differentiering genom att jämföra olika förutsättningar, som vi rapporterade med Hoechst inkubation. Detta exempel illustrerar möjligheten att extrahera meningsfull dynamisk data från time-lapse experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av AFM-Telethon att E.V. (#21545) och Ospedale San Raffaele (OSR) utsäde bidraget till S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez från navet bild analys av Institut Pasteur är erkänt för att offentligt dela sin ”enkel Tracker” MATLAB-rutiner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
