Skelettmuskulaturen differentiering är en mycket dynamisk process, som särskilt bygger på nukleära positionering. Här, beskriver vi en metod att spåra atomkärnor rörelser av levande cell imaging under gorgina differentiering och myotube bildning och utföra en kvantitativ karakterisering av atomkärnor dynamik genom att extrahera information från automatisk spårning.
Nukleära positionering inom celler är viktigt för flera cellulära processer i utveckling och förnyelse. Det mest spännande exemplet på nukleära positionering sker under skelettmuskulaturen differentiering. Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler bildas genom fusion av föregångare muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering. Korrekt nukleära positionering inom myofibers krävs för korrekt muskel förnyelse och funktion. Det enhetliga förfarandet att bedöma gorgina differentiering och myofiber bildandet är beroende av fasta cellerna analyseras av immunofluorescens, vilken hindrar studiet av kärntekniska rörelsen och cell beteende över tid. Här, beskriver vi en metod för analys av gorgina differentiering och myofiber bildandet av levande cell imaging. Vi erbjuder en programvara för automatiserad nukleära tracking för att få en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende (dvs banan) under differentiering och fusion.
Skelettmuskulaturen är den största vävnaden i den mänskliga kroppen, totalt 35-40% av kroppen massa1. Satellit celler är muskelstamceller, anatomiskt kännetecknas av deras position (kontrasteras till plasmamembranet, under den basala lamina av muskelfibrer), som ger upphov till prolifererande myoblasts (myogenic progenitorceller), som så småningom differentiera och integrera i befintliga myofibers eller säkring till formuläret ny myofibers2,3,4. Deras upptäckt och framsteg i studien av deras biologi har lett till betydande insikter i muskelutveckling och förnyelse.
Protokoll att isolera och differentieras myoblasts till myotubes har utvecklats för många år sedan och fortfarande ofta används för att studera skelettmuskulaturen differentiering5,6,7. De flesta av dessa metoder utgör dock statiska procedurer som förlitar sig på en analys av fasta celler och, följaktligen, inte tillåter forskare att fullt utforska högdynamiska processer, såsom gorgina fusion och myofiber mognad. Det mest slående exemplet är kärnkraft positionering, som är hårt reglerad, med kärnor från början i mitten av myofiber och, sedan, ligger på periferin efter myofiber mognad8,9. Levande imaging är den lämpligaste tekniken för att få ytterligare insikter om sådant märkliga fenomen.
Här beskriver vi en metod som gör det möjligt för forskare att registrera gorgina differentiering och myotube bildandet av time-lapse Mikroskopi och utföra kvantitativa analyser från automatisk spårning av gorgina atomkärnor. Denna metod ger en hög genomströmning kvantitativa karakterisering av nukleära dynamics och gorgina beteende under differentiering och fusion. Protokollet är uppdelad i fyra olika delar, nämligen (1) samling av muskler från bakbenen av möss, (2) isolering av primära myoblasts som består i mekaniska och enzymatisk nedbrytning, (3) gorgina proliferation och differentiering och (4) Live imaging att spåra atomkärnor inom de första 16 h gorgina differentiering.
I följande procedur, är myoblasts isolerade från H2B-GFP möss och behandlas med 1 µg/mL av doxycyklin att inducera H2B-GFP uttryck, som tidigare beskrivits10. Alternativt är det möjligt att isolera myoblasts från andra transgena möss som uttrycker ett fluorescerande protein i cellkärnan eller transfect celler isolerade från vildtyp möss att uttrycka ett fluorescerande protein i cellkärnan, som beskrivs av Pimentel et al. 9.
Muskelfibrer (myofibers) är multinucleära celler som bildas genom fusion av prekursorer muskelceller (myoblasts) härrör från muskelstamceller (satellit celler) som genomgår proliferation och differentiering2,3, 4. För att bedöma gorgina differentiering, består det gemensamma förfarandet av odlingsskålar myoblasts gäller att differentiera medium och åtgärda cellerna vid olika tidpunkter att utföra immunofluorescen…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete var stöds av AFM-Telethon att E.V. (#21545) och Ospedale San Raffaele (OSR) utsäde bidraget till S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez från navet bild analys av Institut Pasteur är erkänt för att offentligt dela sin ”enkel Tracker” MATLAB-rutiner.
chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
doxyciclin | Sigma | D1515 | |
DMEM | Sigma | D5671 | |
fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
gentamicin | Sigma | G1397 | |
Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
Hoechst | life technologies | 33342 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
L-glutamine | Sigma | G7513 | |
Matrigel | Corning | 356231 | |
penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
Digestion medium | |||
collagenase | 40 mg | ||
dispase | 70 mg | ||
PBS | 20 ml | ||
filtered 0.22um | |||
Blocking medium | |||
DMEM | |||
Fetal bovine serum | 10% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
filtered 0.22um | |||
proliferation medium | |||
IMDM | |||
Fetal bovine serum | 20% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
chichen embryo extract | 3% | ||
filtered 0.22um | |||
differentiation medium | |||
IMDM | |||
Horse serum | 2% | ||
L-glutammine | 1% | ||
penicillin-streptomycin | 1% | ||
gentamicin | 1 ‰ | ||
chichen embryo extract | 1% | ||
filtered 0.22um |