Summary
Skjelettmuskel differensiering er en svært dynamisk prosess, som bruker spesielt kjernefysisk posisjonering. Her beskriver vi en metode å spore kjerner bevegelser av levende celle tenkelig under myoblast differensiering og myotube formasjon og utføre kvantitativ karakteristikk av kjerner dynamikken ved gitt informasjon automatisk sporing.
Abstract
Kjernefysisk posisjonering i celler er viktig for flere cellulære prosesser i utvikling og regeneration. Det mest spennende eksempelet på kjernefysiske posisjonering oppstår under Skjelettmuskel differensiering. Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler av fusjon av muskel precursor celler (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering. Riktig kjernefysiske posisjonering i myofibers er nødvendig for riktig muskulære og funksjon. Den vanlige prosedyren for å vurdere myoblast differensiering og myofiber formasjon er avhengig av faste celler analysert av immunofluorescence, som hindrer studiet av kjernefysiske bevegelse og celle oppførsel over tid. Her beskriver vi en metode for analyse av myoblast differensiering og myofiber dannelsen av levende celle tenkelig. Vi tilbyr en programvare for automatisert kjernefysiske sporing å få høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast atferd (dvs. banen) under differensiering og fusion.
Introduction
Skjelettmuskulatur er den største vev i kroppen, totalt 35% - 40% av kroppen masse1. Satellitt celler er muskel-stamceller, anatomisk preget av sin posisjon (satt sammen til plasma membranen, under den basale lamina av muskel fiber), som gir opphav til voksende myoblasts (myogenic stamfar celler), som til slutt skille og integrere i eksisterende myofibers og/eller sikring til skjemaet ny myofibers2,3,4. Funnet og fremgang i studiet av deres biologi har ført til betydelig innsikt i muskelutvikling og regeneration.
Protokoller å isolere og skille myoblasts i myotubes har blitt utviklet mange år siden og fortsatt er mye brukt til å studere Skjelettmuskel differensiering5,6,7. Men representerer de fleste av disse metodene statisk prosedyrer som stole på analyse av fast celler, og derfor tillater ikke forskere helt utforske svært dynamisk prosesser, for eksempel myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksemplet er kjernefysiske posisjonering, som er strengt regulert, med kjerner først i midten av myofiber, og deretter plassert i periferien etter myofiber modning8,9. Live bildebehandling er den mest passende teknikken for å få ytterligere innsikt i så merkelig fenomen.
Her beskriver vi en metode som gjør at forskerne å registrere myoblast differensiering og myotube dannelsen av time-lapse mikroskopi og utføre kvantitative analyser fra den automatiske sporingen av myoblast kjerner. Denne metoden gir høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast oppførsel under differensiering og fusion. Protokollen er delt inn i fire ulike deler, nemlig (1) samling av musklene hindlimbs mus, (2) isolering av primære myoblasts som består av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen, (3) myoblast spredning og differensiering og (4) Live bildebehandling spore kjerner innenfor de første 16 h myoblast differensiering.
Fremgangsmåten er myoblasts isolert fra H2B-GFP mus og behandlet med 1 µg/mL av doxycycline å indusere H2B-GFP uttrykk, som beskrevet tidligere10. Alternativt er det mulig å isolere myoblasts fra andre transgene mus som uttrykker et fluorescerende protein i kjernen eller transfect celler isolert fra vill-type mus å uttrykke et fluorescerende protein i kjernen, som beskrevet ved Pimentel et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent av San Raffaele institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. Disseksjon av musen hindlimb muskler
- Sterilisere pinsett og saks (både rette og buede) av autoklavering.
- Forberede og filtrere (0.22 µm) alle media (blokkerer medium, fordøyelsen medium, voksende medium, og skiller middels) før du starter eksperimentet (se Tabell for materiale).
- Sett 5 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) i 35 mm Petriskål for muskel samling.
- Ofre musen ved cervical forvridning eller CO2 og sterilisere huden med etanol. Fjern skinnet fra hindlimbs og øvre lemmer ved hjelp av saks og pinsetter, for å lette isolering av muskler.
Merk: Musklene kan være isolert fra neonatal eller voksen mus. Neonatal mus har et økt antall satellitt celler sammenlignet med voksne mus. Totalt antall satellitt celler som kan isoleres fra en enkelt voksen mus er imidlertid tilstrekkelig til å utføre eksperimentet beskrevet nedenfor. - Isoler tibialis, soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius, quadriceps og triceps og sette dem i Petriskål inneholder PBS. La fatet på ice. Fjern forsiktig tendons og fett med sterilisert saks og pinsett.
2. isolering av primære myoblasts
Merk: Alle prosedyrene for cellekultur er gjort i sterile forhold.
- Fjern musklene fra PBS. Klipp og hakke musklene, ved hjelp av sterile buet saks, til en ensartet masse er oppnådd. Sett muskel-biter i en 50 mL tube.
- Legg til 10 mL av fordøyelsen mediet for muskel-brikker og ruge på 37 ° C i 30 min under sterk agitasjon (250 min-1) i et vannbad, å fordøye enzymatisk musklene.
- Legge 10 mL av Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) som inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% glutamin, 1% penicillin/streptomycin og 1% gentamicin (blokkerer medium) å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuge på 40 x g i 5 min og samle nedbryting i en 50 mL tube. Lagre pellet på is.
Merk: Etter sentrifugering, nedbryting inneholder noen satellitt celler, blodceller, endotelceller og fibroblaster, mens pellet inneholder ufordøyd muskler og bindevev. For å øke antall isolerte celler, må pellet utsettes for flere trinn av fordøyelsen som beskrevet nedenfor. - Sentrifuge nedbryting på 650 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av DMEM som inneholder 10% FBS. Holde urinprøven på is.
- Gjenta 2.2-2.5 2 x for resten av pellet fikk i trinn 2.4 og legger deretter resuspended pellets første urinprøven bevart på is.
- Pass resuspended pellets gjennom en 70 µm og deretter gjennom en 40 µm. Legge til 15 mL DMEM med 10% FBS og sentrifuger 650 x g i 5 min.
- Resuspend celle pellet i 3 mL av røde blodlegemer lyseringsbuffer til deplete de røde blodcellene. Inkuber det i 5 minutter ved romtemperatur. Legge til 40 mL PBS skal stoppe lysis av røde blodceller, og sentrifuge 650 x g for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 5 mL av DMEM med 10% FBS.
- Som preplating skritt, plate cellene i 20 mL spredning medium i en 150 mm ubestrøket Petriskål. Etter 1 h med inkubering i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2), samle medium.
Merk: Fibroblaster, feste til platen, er deretter forkastet, mens satellitt celler forblir i suspensjon. - Gjenta trinn 2.9 3 x og siste preplating trinn, samle medium som inneholder satellitt cellene i suspensjon.
- Sentrifuger 650 x g i 5 min.
- Mens cellene er sentrifugering, pels to 150 mm Petri retter med kollagen (10 mL på 0,1% løsning i 0.1 M eddiksyre). For å gjøre så, sette kollagen på tallerkenen, ruge i 5 min og fjerne den. La plate tørke 30 min.
- Forkast nedbryting fikk i trinn 2.11 og resuspend celle pellet i 40 mL av spredning medium (Tabell for materiale). Plate cellene i to kollagen-belagt 150 mm Petri retter (20 mL per fat) og holde cellene i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) i spredning medium for 2-3 dager med 1 µg/mL doxycycline å indusere H2B-GFP uttrykk.
Merk: Dette trinnet kan spredning av myoblasts å få et høyere antall celler for videre analyser. Cellen tetthet opprettholdes svært lav å unngå en spontan differensiering av myoblasts i myotubes.
3. Myoblast spredning og differensiering analyser
Merk: Når myoblast tetthet er høy, noen celler starte forlengelse, og deretter er det nødvendig å dele cellene. Vanligvis er det mulig å dele celler 2 x-3 x uten å påvirke deres fenotypen.
- Forkaste medium, vaske cellene med 5 mL av PBS, legge 2 mL av trypsin (1 x), ruge platen på 37 ° C i en celle inkubator for 5 min. Sjekk under mikroskopet og når runde celler fjerne, legge til 5 mL av DMEM med 10% FBS å deaktivere trypsin. Teller antall celler (vanligvis det er mulig å få ca 1 x 106 celler/mus).
Merk: Inkubasjon med trypsin i 5 min er vanligvis nok til å koble den voksende myoblasts. - Underlagt cellene til en av analyser beskrevet nedenfor.
-
Spredning analysen
- Plate 50.000 celler/vel 1 mL/vel av spredning medium i en kollagen-belagt 12-vel plate og ruge belagt cellene i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fastsette og telle celler på 24, 48 og 72 h.
Merk: Medium erstattes hver 48 timer for å unngå næringsstoffer utmattelse.
- Plate 50.000 celler/vel 1 mL/vel av spredning medium i en kollagen-belagt 12-vel plate og ruge belagt cellene i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fastsette og telle celler på 24, 48 og 72 h.
-
Differensiering analysen
- Coat en 12-vel plate med 350 µL av differensiering middels inneholder kjelleren membran matrix (1: 100). Inkuber platen på 37 ° C i 30 min og fjerne mediet.
- Plate 200.000 celler/godt i differensiering medium i matrix-belagt plate. Inkuber cellene i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) før de overholder platen (2 timer er vanligvis nok for cellene å følge og starte differensiering).
- For å vurdere differensiering, utføre flekker myosin tung kjetting og kjerner som beskrevet tidligere11. Du kan også utføre live bildebehandling analyser som beskrevet nedenfor.
-
Spredning analysen
4. Live-imaging myoblast differensiering og kjernefysiske sporing
- For live celle imaging, sette cellene, innhentet i delen 3.2.2 og belagt i en 12-vel plate, under en AC confocal mikroskop, utstyrt med inkubering system å opprettholde cellene på 37 ° C i 5% CO2.
- Bruk en 20 x tørr målsetting (0,7 NA) for å få synsfelt med hundrevis av celler, nok til å overvåke myofiber formasjon. H2B-GFP celler kan avbildes med en lav intensitet 488 nm Argon laser.
Merk: En åpen pinhole sikrer at bildedybde (~ 10 µm) inneholder cellen tykkelsen slik at cellene holdes i fokus hele eksperimentet. Bruke AC confocal mikroskop er fordelaktig siden det bedrer signal-til-støy forholdet mellom bildene, selv om wide-field mikroskopi kan også brukes. Myofiber formasjon kan overvåkes gjennom overføringskanal. - Hente bilder på 16-biters og 1024 x 1024 piksler per bilde hver 6 min 16 h. Ervervet kor, generere en multiframe.tif fil (se eksempel i Supplerende filer).
Merk: I dagens protokollen, kommersiell programvare knyttet til mikroskopet (Tabell for materiale) er brukt; Bruk riktig programvare for å oppnå samme mål ved andre mikroskop. - Last ned programvaren som en zip- utfyllende fil.
Merk: Rutiner er skript som må kjøres i MATLAB. Programvaren er en tilpasning av en publisert programvare12 optimalisert for sporing av kjerner under myotube formasjon. Denne programvaren er delt i to deler: den første som identifiserer kjerner i hver ramme ved å segmentere dem, mens andre genererer "spor" (baner) kjerner bevegelse. Hele koden for kjernefysisk segmentering og sporing og trinnvise instruksjoner om å komme i gang er gitt i Supplerende filer. - Pakk ut zip-filen og lagre den i en ønsket bane på personlig datamaskin (PC) i bruk. Utføre alle de under passasjer på en PC med nødvendig programvare installert. Merk at zip-filen består av tre mapper som nevnt nedenfor.
Merk: Segmentering rutiner inneholder funksjonene kjøres i segmenteringen. Sporing rutiner, i stedet inneholder funksjonene kreves for sporing. Eksempel segmentering sporing gir grunnleggende skript og filer å bli kjent med systemet. Programvaren brukes til segmentering og sporing av kjerner kjører riktig i MATLAB, R2015a eller senere versjoner. - For å segmentere kjerner fra TIF-fil, navnet på filen, for eksempel NameFile.tif.
- Åpne mappen Eksempel segmentering sporing og klikk på DoSegmentation.m. Dette åpner vinduet i MATLAB.
- Når vinduet Gjeldende mappe til venstre til alle elementene i mappen Eksempel på segmentering sporing . Dobbeltklikk på DoSegmentation.m.
Merk: Detaljert informasjon om endringene som må gjøres i skriptet finnes i filen StepbyStep.txt. Det er obligatorisk å endre skriptet slik at den variable filenameinput er NameFile.tif og folderinput er mappen der den TIF-filen finnes. - Kjør skriptet (ved å klikke på grønne Kjør -knappen). Resultatet av segmenteringen lagres som en file.mat (SegmentedNameFile.mat), mens oppdeling av kjerner kan visualiseres i produksjonen figur.
Merk: Parametere for segmentering, beskrevet i skriptet kan endres om nødvendig. Kvaliteten på segmenteringen kan kontrolleres ved hjelp av skriptet CheckSegmentation.m (se filen StepbyStep.txt). Basert på dette, hvis kvaliteten på segmenteringen er dårlig (bare noen kjerner oppdaget), justere parameterne for segmentering, klart angitt i skriptet DoSegmentation.m og gjenta.
- Vil generere sporene (dvs. baner av kjerner i tid), bruke kjernefysiske stillingene innhentet i segmentering, kjører du skriptet GenerateTracks.m i samme arbeidsmappen. Sørg for å legge til riktig segmentering filen som inndata, innhentet før (se filen StepbyStep.txt for mer informasjon).
Merk: Som en utgang, vil brukeren få en fil TrackedNameFile.mat, med en matrise for x-koordinatene og en annen matrise for y-koordinatene for genererte sporene. - Vurdere kvaliteten på sporene bruke CheckTracking.m (se filen StepbyStep.txt for mer informasjon). Bruk utdata figuren av denne siste for å visualisere hver kjerner posisjon i tid. Sjekk til venstre for grønt kors som angir hver segmentert kjernen. For å velge en bestemt kjernen, bruk lavere rullefeltet. Merk at valgte kjernen vil være sirklet i rødt på høyre, banen til den merkede cellen kan følges i tid (ved øvre rullefeltet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å automatisk følge kjernefysiske bevegelse under myoblast differensiering i live bildebehandling, skal kjerner fortrinnsvis være fluorescently merket. Det er viktig å merke seg at ved hjelp av DNA-intercalating molekyler ikke er mulig fordi disse molekylene forstyrre spredning og differensiering av primære myoblasts13. Som et eksempel, er spredning og differensiering analysert i primære myoblasts kultivert med eller uten Hoechst (figur 1). Det er tydelig at spredning (figur 1A, B) og differensiering (figur 1 c, midtre panelet) er sterkt svekket i myoblasts kultivert med Hoechst 33342. Derimot myoblasts isolert fra H2B-GFP mus og kultivert med doxycycline har kjerner med grønne fluorescens og differensiere tilsvarende å myoblasts isolert fra vill-type mus (figur 1 c, høyre og venstre paneler, henholdsvis).
Levende celle bildebehandling med primær myoblasts uttrykke H2B-GFP protein tillater sporing av kjerner under differensiering (figur 2 og supplerende Video 1). Flettet bilder av overføring og GFP kanaler på den første (figur 2A) og siste gang poeng (figur 2B) under differensiering av H2B-GFP myoblasts tillate forskere å identifisere myotubes og følgelig kjerner som ender opp integrere i en myotube (f.eks kjernen i blå sirkel) eller atomkjerner som ikke sikring i en myotube (f.eks kjernen i den røde sirkelen).
For å ekstra informasjon om kjerner/mobiltelefon bevegelser fra levende celle bildebehandling data, er det mulig å bruke den medfølgende programvaren for å spore baner av kjerner. Programvaren bruker bildet fra H2B-GFP kanalen (kjerner; Figur 3A) til å opprette en maske og segmentere kjerner i hver ramme. For kjernefysisk segmentering i en ramme velges en "konservativ" terskel bruke Otsus metode på bildet etter Gaussian filtrering14. Deretter objekter er omtrent segmentert; for å få en finere segmentering, er hvert objekt maskert med en terskelen basert på gjennomsnittlige i markeringsrammen. Et vannskille transformeringen brukes deretter til å skille objekter (figur 3B) i nærheten. I våre hender, én vannskille transformasjon har vært i stand til å skille de nærliggende kjerner (figur 3B, * innfelt). Derfor vi brukte området å velge større objekter i bildet og bruke en ny vannskille transformering (figur 3B, ** innfelt), som er i stand til å skille flere nærliggende kjerner. Med denne tilnærmingen, er de fleste av kjerner identifisert i bildet (Figur 3 c).
For å spore kjerner, forbedret vi rutiner ved å innlemme sporing rutiner publisert av Tinevez15. Kort sagt, linker sporing algoritmen kjerner i påfølgende rammer med sikte på å minimere summen av avstandene mellom plasseringen av hver kjerne i en ramme og plasseringen av samme kjernen i den neste, ved hjelp av "ungarsk algoritmen" for slike minimering16. Trinnet gjentas for å koble ukoblet kjerner som et bestemt maksimalt antall rammer bort. En terskel for Maksimumsavstanden mellom plasseringen av et objekt i en ramme og neste er også etablert. Dataene som presenteres her, gi et maksimalt antall fem rammer og maksimal avstand på 20 piksler per trinn et høyt antall riktig spor (figur 3D). Viktigst, kan vi bruke disse rutinene for å sjekke kvaliteten på sporing. Det er også mulig å bruke dette skriptet for å finne celler som har en bestemt atferd, for eksempel danner (eller ikke) en myofiber, og deretter analysere de dynamiske funksjonene i settet med celler av interesse.
Brukte programvaren genererer sporene med x - og y-koordinatene for hver celle i rammen n, 
, i hundrevis av celler (figur 3D). Vi kan bruke slik informasjon trekke ut informasjon om kjerner bevegelse. Som et eksempel, totalt forskyvning mellom den første rammen (n = 0) og det siste bildet N er definert som følger.
Forskyvning av en bane = || 
||
Her, "|| · ||" står for normen av vektoren (figur 4A).
Hastigheten av hver kjerne i rammen n er som følger.
Da kan vi definere lengden på en bane for en gitt celle som følger.
Lengden på bane =
Som et eksempel på hvordan disse enkle parameterne kan allerede gi relevant informasjon, beregnet vi lengden på kjerner baner av myoblasts inkubert med eller uten Hoechst. Det virker som den totale lengden på baner er litt høyere for celler med Hoechst, selv om forskjellen ikke er betydelig (figur 4B). Men når vi beregnet det totale motorvolumet under en, observerte vi at det totale motorvolumet celler med Hoechst var betydelig mindre enn unstained kvinne celler (figur 4C). Dette angir at bevegelse av farget celler har en lavere retningen. For å styrke denne hypotesen, kvantifisert vi retningen av bevegelsen av en celle ved å beregne vinkelen på hastigheten i hver ramme (figur 4A).
Vi har også kvantifisert variasjonen av vinkelen mellom rammer.
Den totale vinkel varianten langs en bane kan deretter defineres som følger.
Totalt vinkel variant =
Som spådd, totalt vinkel variasjonen for unstained kvinne cellene er betydelig mindre i forhold til celler med Hoechst (Figur 4 d). Derfor indikerer denne enkel måling av retningen, fra en enkel beregning, at myoblasts med Hoechst er mindre utsatt for å opprettholde retning av sine fortrengning, som reflekterer deres svekket evne til å danne myotubes (figur 1).
Kort sagt, levende celle bildebehandling data generert som beskrevet her gi en kvantitativ link mellom kjernefysiske dynamikk og muligheten til å skjemaet myotubes og kan brukes som inndata for høy gjennomstrømming kvantitative karakteristikk av kjernefysiske dynamikk og myoblast opptreden differensiering og fusion.
Figur 1: inkubasjon med Hoechst forstyrrer spredning og differensiering av myoblasts. (A) representant bilder av primære myoblasts farget med Hoechst etter 24 h i spredning medium (venstre panel) eller kultivert 24 h i spredning medium med Hoechst (høyre panel) og (B) den relative kvantifiseringen. Er de gjennomsnittlig ± SEM og den statistiske betydningen ble vurdert med Student t-test. P < 0,05. (C) representant bilder av primære vill-type myoblasts, kultivert for 24 h i skille medium uten (venstre panel) eller med Hoechst (midtre panelet), og H2B-GFP myoblasts kultivert for 24 h i skille medium (høyre panel) og farget med Hoechst (blå) og en anti-myosin tunge kjeden antistoff (MyHC, rød). Skala barer = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Live bildebehandling av H2B-GFP myoblasts under differensiering. Flettede bilder av overføring og GFP kanaler på (A) innledende (t = 0 h) og (B) siste gang poeng (t = 16 h) under differensiering av H2B-GFP myoblasts (20 x objektiv). Eksempler på myotubes er markert med svarte piler i B-panelet. Skala barer = 50 µm. (C) Magnified prikkete områder fra paneler A og B det er mulig å identifisere en enkelt kjerne som ender opp integrere i en myotube (i blått) eller ikke (i rødt) ved t = 0 h, t = 8 h og t < / C12 > = 16 h. Skala barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: segmentering av H2B-GFP myoblasts sporing under differensiering. (A) eksempel på en ramme av tid feil viser kjerner i ca 400 celler. (B) eksempel på kjerner maskering og segmentering. Lyse objekter er segmentert med både en global og en lokal terskel, og en vannskille transformasjon brukes for å skille i nærheten kjerner. Nærliggende kjerner kan være vanskelig å segment (* innfelt), så en andre vannskille-basert segmentering utføres i objekter av store områder å segmentere et større antall kjerner (** innfelt). (C) oppdaget kjernefysiske stillinger (Røde Kors), som senere brukes i sporing algoritmen. (D) spor generert ved hjelp av sporing algoritme som minimerer summen av avstandene mellom hvert objekts posisjon i to påfølgende rammer. En maksimal mulig verdi så avstand for hvert objekt som gis som inndata som tillater forskere å koble kjerner atskilt med mer enn én ramme. Skala barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantitative analyser av kjerner dynamics avdekke nedsatt evne til myoblasts inkubert med Hoechst å opprettholde celle retningen. (A) beskrivelse av parameteren målinger. Det er mulig å definere hastigheten av en kjerne av vurderer plasseringen i to påfølgende rammer. Bane vinkelen og vinkel variasjonen kan deretter lett beregnes fra stillingene som angitt i skjemaet. (B) distribusjon av baner lengde, (C) total fortrengning og (D) variant av baner vinkelen på myoblasts ruges uten Hoechst (grønn linje) eller med Hoechst (blå linjen). De to distribusjonene er ikke vesentlig forskjellig, mens det totale motorvolumet er betydelig høyere, og variasjonen av vinkelen er betydelig lavere for unstained kvinne celler (ensidig Kolmogorov-Smirnov test, *p < 0,05 og **p < 0.005). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video 1: Live bildebehandling av H2B-GFP myoblasts under differensiering. Imaging for H2B-GFP myoblasts kultivert i skille medium fra første (t = 0 h) til siste gang poeng (t = 16 h) overføring og GFP kanaler (20 x objektiv). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muskel fiber (myofibers) er multinucleated celler som dannes ved blanding av prekursorer muskelceller (myoblasts) fra muskel-stamceller (satellitt celler) som gjennomgår spredning og differensiering2,3, 4. For å vurdere myoblast differensiering, består den felles prosedyren av dyrking myoblasts skille medium og feste cellene på ulike tidspunkt å utføre immunofluorescence flekker for MyHC, en markør av differensiering og flekker av kjerner med DNA-intercalating molekyler (f.eks Hoechst)5. Denne metoden er nyttig å evaluere myoblast differensiering ved å måle ulike parametere, for eksempel differensiering indeksen (antall MyHC-positive celler/totalt celle nummer) eller fusion indeks (antall myotubes med minst to kjerner/totalt celle nummer) . Men er myoblast fusion og myotube formasjon svært dynamisk prosesser som bruker motilitet av kjerner8. Faktisk er kjernefysiske plassering innen myofibers nødvendig for riktig muskulære og funksjonen17. Mobilitet av myoblasts og deres kjerner kan vise seg for å være en viktig parameter å evaluere myoblast differensiering og avdekke romanen defekter i muskel lidelser. Derfor er det avgjørende å utvikle romanen prosedyrene for å studere celle atferd og kjernefysiske bevegelse under myoblast differensiering og myofiber formasjon.
Her beskriver vi en metode som gjør at forskere til å følge myoblast differensiering og myotube dannelsen av levende celle tenkelig og utføre kvantitative analyser fra den automatiske sporingen av kjerner. Fordelen med denne metoden er muligheten til å spore under differensiering av fluorescerende kjerner i myoblasts, isolert fra H2B-GFP mus, uten celle transfection eller ekstra flekker. De H2B-GFP mus er kommersielt tilgjengelig og dermed lett tilgjengelig. Alternativt er det mulig å isolere myoblasts fra andre transgene mus som uttrykker et fluorescerende protein i kjernen eller å transfect celler isolert fra vill-type mus å uttrykke et fluorescerende protein i kjernen, som beskrevet tidligere9 . Disse alternativene ytterligere utvide den potensielle anvendelser av metoden presenteres her.
Gjeldende protokollen er avhengig av kulturen i primære myoblasts, og følgelig en høye variasjon kan observeres i eksperimentell følgende, også på grunn av den potensielle tilstedeværelsen av nonmyogenic celler etter isolasjon muskler18 . For å overkomme denne begrensningen, er det mulig å isolere myoblasts celle sortering som beskrevet tidligere19. En annen kritisk punkt i metoden beskrevet her er vanskeligheten å generere en perfekt sporing av kjerner når celler er nær hverandre, som under myotube formasjon. Men programvarerutiner diskutert her tillater forskere å visuelt inspisere kvaliteten på sporing og, om nødvendig, for å velge et delsett av celler av interesse for en senere analyse. Ytterligere forbedring av programvaren kan være nødvendig å oppgi fullstendig karakteristikk av kjernefysiske dynamics under myofiber formasjon.
I konklusjonen, er denne metoden nyttig å kvantitative kjerner dynamics under myoblast differensiering ved å sammenligne ulike forhold, som vi rapportert med Hoechst inkubasjon. Dette eksemplet illustrerer muligheten til å trekke ut meningsfull dynamiske data fra time-lapse eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av AFM-Telethon til E.V. (#21545) og til Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskudd til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra bildet analyse sentrum av Institut Pasteur er anerkjent for offentlig deler hans "Enkel Tracker" MATLAB rutiner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
