Summary
Skeletspieren differentiatie is een uiterst dynamisch proces, die met name gebaseerd op nucleaire positionering is. Hier beschrijven we een methode voor het bijhouden van de bewegingen van de kernen door levende cel imaging tijdens myoblast differentiatie en myotube vorming en voor het uitvoeren van een kwantitatieve karakterisering van de dynamiek van de kernen door het extraheren van informatie van automatisch bijhouden.
Abstract
Nucleaire positionering binnen cellen is belangrijk voor meerdere cellulaire processen in ontwikkeling en regeneratie. Het meest intrigerende voorbeeld van nucleaire positionering optreedt tijdens de differentiatie van de skeletspieren. Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen gevormd door de fusie van spier voorlopercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die proliferatie en differentiatie ondergaan. Juiste nucleaire positionering binnen myofibers is vereist voor de juiste spier regeneratie en functie. De uniforme procedure te beoordelen myoblast differentiatie en myofiber vorming is afhankelijk van vaste cellen geanalyseerd door immunofluorescentie, die de studie van nucleaire verkeer en cel gedrag na verloop van tijd belemmert. Hier beschrijven we een methode voor de analyse van myoblast differentiatie en myofiber formatie door levende cel imaging. We bieden een software voor geautomatiseerde nucleaire tracking te verkrijgen van een kwantitatieve karakterisering van hoge-doorvoer van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag (dat wil zeggen, het traject) tijdens de differentiatie en fusion.
Introduction
Skeletspieren is het grootste weefsel in het menselijk lichaam, totaal 35% - 40% van het lichaam massa1. Satelliet cellen zijn de cellen van de stam van het spier, anatomisch gekenmerkt door hun positie (naast aan het plasma-membraan, onder de basale lamina van spiervezels), die aanleiding geven tot delende myoblasts (myogenic voorlopercellen), die uiteindelijk differentiëren en integreren in bestaande myofibers en/of zekering formulier nieuwe myofibers2,3,4. Hun ontdekking en de vooruitgang in de studie van hun biologie heeft geleid tot belangrijke inzichten in spierontwikkeling en regeneratie.
Protocollen te isoleren en te onderscheiden van myoblasts in myotubes vele jaren geleden ontwikkeld en zijn nog steeds gebruikte om te studeren van skeletspieren differentiatie5,6,7. Meeste van deze methoden betekenen echter statische procedures die afhankelijk zijn van de analyse van vaste cellen en, bijgevolg, laat niet wetenschappers hoogdynamische processen, zoals myoblast fusion en rijping van de myofiber volledig te verkennen. Het meest opvallende voorbeeld is nucleaire positionering, die is strak geregeld, met kernen in eerste instantie in het midden van de myofiber en, vervolgens, gelegen aan de rand na8,9van de rijping van de myofiber. Levende imaging is de meest geschikte techniek om nadere te verkrijgen inzichten in dergelijk merkwaardige fenomeen.
Hier beschrijven we een methode waarmee wetenschappers met het opnemen van myoblast differentiatie en myotube vorming door time-lapse microscopie en kwantitatieve analyses uitvoeren van de automatisch bijhouden van myoblast kernen. Deze methode biedt een high-throughput kwantitatieve karakterisering van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag tijdens de differentiatie en fusion. Het protocol is onderverdeeld in vier verschillende delen, namelijk (1) het innen van de spieren van de hindlimbs van muizen, (2) het isolement van de primaire myoblasts, die in de mechanische en enzymatische spijsvertering, (3) myoblast proliferatie en differentiatie, en (4 bestaat) Live imaging voor het bijhouden van de kernen binnen de eerste 16 h myoblast differentiatie.
In de volgende procedure, zijn myoblasts van muizen H2B-GFP werd geïsoleerd en behandeld met 1 µg/mL doxycycline ertoe H2B-GFP expressie, als eerder beschreven10. Als alternatief, is het mogelijk om te isoleren van de myoblasts van andere transgene muizen die uitdrukking geven aan een fluorescente proteïne in de celkern of naar de cellen die geïsoleerd van wild-type muizen uitspreken een fluorescente proteïne in de celkern, zoals beschreven door Pimentel et al. transfect. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door het San Raffaele institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. dissectie van muis stuk spieren
- Pincetten en scharen (zowel rechte als gebogen) in autoclaaf steriliseren.
- Bereiden en te filteren (0,22 µm) alle media (blokkerende medium, spijsvertering medium, prolifererende medium en differentiatie van medium) voordat het experiment (Zie Tabel van materialen).
- Zet 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 35 mm petrischaal voor spier collectie.
- De muis offeren door cervicale dislocatie of met behulp van CO2 en steriliseren van de huid met ethanol. Verwijder de huid van de hindlimbs en de bovenste ledematen met behulp van schaar en pincet, ter vergemakkelijking van het isolement van de spieren.
Opmerking: De spieren kunnen worden geïsoleerd van neonatale of volwassen muizen. Neonatale muizen hebben een groter aantal cellen van de satelliet ten opzichte van volwassen muizen. Het totale aantal satelliet-cellen die geïsoleerd uit een enkele volwassen muis worden kunnen is echter voldoende zijn voor het uitvoeren van het experiment hieronder beschreven. - Isoleren tibialis, soleus extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius, quadriceps en triceps, en leg ze in de petrischaal met PBS. Laat de schotel op het ijs. Verwijder voorzichtig pezen en vet met een gesteriliseerde schaar en pincet.
2. isolatie van primaire myoblasts
Opmerking: Alle procedures voor cultuur van de cel zijn gedaan onder steriele omstandigheden.
- Verwijder de spieren van de PBS. Knippen en gehakt van de spieren, met behulp van steriele gebogen schaar, totdat een uniforme massa is verkregen. Zet de stukken van de spier in een tube van 50 mL.
- Voeg 10 mL van de spijsvertering-medium aan de stukken van de spier en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten onder sterke agitatie (250 min-1) in een waterbad, te verteren enzymatisch de spieren.
- Voeg toe 10 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS), 1% glutamine, penicilline/streptomycine 1% en 1% gentamicine (blokkerende medium) om te stoppen met de spijsvertering.
- Centrifugeer bij 40 x g gedurende 5 minuten en het verzamelen van de bovendrijvende substantie in een tube van 50 mL. Sla de pellet op ijs.
Opmerking: Na het centrifugeren, het supernatant bevat bepaalde satelliet cellen, bloedcellen, endotheliale cellen en fibroblasten, terwijl de pellet stukjes onverteerd spier- en bindweefsel bevat. Het vergroten van het aantal geïsoleerde cellen, moet de pellet worden onderworpen aan extra stappen van de spijsvertering zoals hieronder beschreven. - Centrifugeer het supernatant bij 650 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL DMEM met 10% FBS. Houden van de geresuspendeerde pellet op ijs.
- Herhaal stap 2.2 – 2.5 2 x voor de rest van de pellet in stap 2.4 verkregen en de vervolgens geresuspendeerde pellets toevoegen aan de eerste geresuspendeerde pellet bewaard op het ijs.
- Langs de geresuspendeerde pellets door een 70 µm filter en vervolgens door een 40 µm filter. Voeg toe 15 mL DMEM met 10% FBS, en centrifuge bij 650 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet cel in 3 mL lysisbuffermengsel rode bloedcellen aan het afbreken van de rode bloedcellen. Incubeer het gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 40 mL PBS te stoppen van de lysis van de rode bloedcellen, en centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL DMEM met 10% FBS.
- Plaat als preplating stap, de cellen 20 ml voor proliferatie medium in een 150 mm ongecoate petrischaal. Na 1 uur incubatie in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) verzamelen het medium.
Opmerking: Fibroblasten, verbonden aan de plaat, worden dan verwijderd, terwijl de satelliet cellen blijven in suspensie. - Herhaal stap 2.9 3 x en de laatste preplating stap, verzamelen van het medium waarin de cellen van de satelliet in suspensie.
- Centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 min.
- Terwijl de cellen zijn centrifugeren, jas twee 150 mm petrischalen met collageen (10 mL van de oplossing van een 0,1% in 0,1 M azijnzuur). Om dit te doen, het collageen op de plaat gezet, Incubeer gedurende 5 min en verwijderen. Laat de plaat gedurende 30 minuten drogen.
- Verwijder het in stap 2.11 verkregen supernatant en resuspendeer de pellet cel in 40 mL van proliferatie medium (Tabel van materialen). Plaat van de cellen in twee petrischalen in collageen beklede 150 mm (20 mL per schotel) en houden van de cellen in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) in proliferatie medium voor 2-3 dagen met 1 µg/mL doxycycline ertoe H2B-GFP expressie.
Opmerking: Deze stap maakt het mogelijk de proliferatie van myoblasts om een hoger aantal cellen voor verdere tests te verkrijgen. Celdichtheid wordt onderhouden zeer laag om te voorkomen dat een spontane differentiatie van myoblasts in myotubes.
3. Myoblast proliferatie en differentiatie testen
Opmerking: Wanneer myoblast dichtheid hoog is, sommige cellen initiëren rek, en dan is het noodzakelijk om de cellen splitsen. In het algemeen, is het mogelijk om te splitsen van cellen 2 x-3 x zonder hun fenotype.
- Negeren van het medium, wassen van de cellen met 5 mL PBS, voeg toe 2 mL trypsine (1 x), Incubeer de plaat bij 37 ° C in een cel incubator voor 5 min. Check onder de Microscoop en ronde cellen los, voeg 5 mL van DMEM met 10% FBS voor inactivering van de trypsine. Het aantal cellen tellen (meestal is het mogelijk om ongeveer 1 x 106 cellen/muis).
Opmerking: Incubatie met trypsine voor 5 min is meestal genoeg om het delende myoblasts los te maken. - Onverminderd de cellen één van de tests die hieronder worden beschreven.
-
Proliferatie assay
- 50.000 cellen per putje in 1 mL/goed voor proliferatie medium in een 12-well collageen beklede plaat plaat en de vergulde cellen in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) uit te broeden. Bevestigen en de cellen op 24, 48 of 72 uur tellen.
Opmerking: Het medium vervangen elke 48 uur om te voorkomen dat voedingsstoffen uitputting.
- 50.000 cellen per putje in 1 mL/goed voor proliferatie medium in een 12-well collageen beklede plaat plaat en de vergulde cellen in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2) uit te broeden. Bevestigen en de cellen op 24, 48 of 72 uur tellen.
-
Differentiatie assay
- Jas van een 12-well plaat met 350 µL van differentiatie middellange met kelder membraan matrix (1:100). Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten en verwijder het medium.
- Plaat 200.000 cellen per putje in het medium van de differentiatie in de matrix beklede plaat. Incubeer de cellen in een cel cultuur incubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) totdat ze aan de plaat voldoen (2 h zijn over het algemeen genoeg voor de cellen te houden en te beginnen differentiatie).
- Uitvoeren om te beoordelen van differentiatie, kleuring voor myosin zware ketting en kernen als eerder beschreven11. U kunt ook live-imaging analyses kunnen uitvoeren zoals hieronder beschreven.
-
Proliferatie assay
4. Live-imaging van myoblast differentiatie en nucleaire bijhouden
- Voor levende cel imaging, zet u de gewenste cellen, verkregen in punt 3.2.2 en vergulde in een 12-well-plate, onder een confocal microscoop, uitgerust met een incubatie-systeem om de cellen bij 37 ° C in 5% CO2.
- Gebruik een droge doelstelling van 20 x (0.7 nvt) om weergave van de velden met honderden cellen, genoeg om te controleren vorming van de myofiber. H2B-GFP cellen kunnen worden beeld met een lage intensiteit 488 nm Argon laser.
Opmerking: Een open pinhole zorgt ervoor dat de afbeelding diepte (~ 10 µm) de dikte van de cel, bevat zodat de cellen worden bewaard in focus gedurende het gehele experiment. Met behulp van een confocal microscoop is voordelig omdat het verbetert de signal-to-noise verhouding van de beelden, maar breed-gebied microscopie kan ook worden gebruikt. Vorming van Myofiber kan worden gecontroleerd via de transmissiekanaal. - Verwerven van beelden van 16-bits en 1024 x 1024 pixels per frame elke 6 min voor 16 h. Voor elke verworven positie, een multiframe.tif-bestand genereren (zie voorbeeld in de Aanvullende bestanden).
Opmerking: In het huidige protocol, commerciële software, die is gekoppeld aan de Microscoop (Tabel of Materials) is gebruikt; Gebruik de juiste software om hetzelfde doel te bereiken bij het gebruik van andere microscopen. - Downloaden van de software die wordt geleverd als een .zip- bestand aanvullende.
Opmerking: De routines zijn scripts die moeten worden uitgevoerd in MATLAB. De software is een aanpassing van een gepubliceerde software12 geoptimaliseerd voor het volgen van de kernen tijdens de vorming van de myotube. Deze software is verdeeld in twee delen: het ene identificeert de kernen in elk frame door segmenteren, terwijl de tweede één "tracks" (trajecten) kernen verkeer genereert. De volledige code voor nucleaire segmentatie en tracering en een stapsgewijze handleiding aan de slag vindt u in de Aanvullende bestanden. - Pak het zipbestand en sla het op in een gewenste pad op de personal computer (PC) in gebruik. Alle uitvoeren de onderstaande passages over een PC met de benodigde software al geïnstalleerd. Merk op dat het .zip-bestand uit drie mappen bestaat zoals hieronder vermeld.
Opmerking: Segmentatie Routines bevat de functies moet worden uitgevoerd voor de segmentatie. Tracking Routines, in plaats daarvan bevat de functies die nodig zijn voor de tracering. In het volgende voorbeeld segmentatie Tracking biedt fundamentele scripts en bestanden om bekend te raken met het systeem. De software gebruikt voor segmentatie en bijhouden van de kernen loopt goed in MATLAB, R2015a of hoger. - Naam om het segment van de kernen van het TIF-bestand, het bestand, bijvoorbeeld NameFile.tif.
- Open de map Voorbeeld segmentatie bijhouden en klik op DoSegmentation.m. Dit wordt het opdrachtvenster geopend in MATLAB.
- Controleer het venster van de Huidige map aan de linkerkant om te zien van alle elementen in de map Voorbeeld van het bijhouden van de segmentatie . Dubbelklik op DoSegmentation.m.
Opmerking: Gedetailleerde informatie over de wijzigingen die moeten worden gedaan in het script kan worden gevonden in het StepbyStep.txt bestand. Het is verplicht om het script wijzigen zodat de variabele filenameinput NameFile.tif is en folderinput is de map waar het TIF-bestand is opgenomen. - Het script uitvoeren (door te klikken op de groene knop uitvoeren ). Het resultaat van de segmentatie wordt opgeslagen als een file.mat (SegmentedNameFile.mat), terwijl de segmentatie van de kernen kan worden gevisualiseerd in de output afbeelding.
Opmerking: Parameters voor de segmentatie, beschreven in het script, kunnen worden gewijzigd indien nodig. De kwaliteit van de segmentatie kan worden gecontroleerd met behulp van het script CheckSegmentation.m (Zie het bestand StepbyStep.txt). Op basis van deze, als de kwaliteit van de segmentatie is slecht (slechts een paar kernen gedetecteerd), aanpassen van de parameters van de segmentatie, duidelijk aangegeven in het DoSegmentation.m script, en herhaal de procedure.
- Voor het genereren van de tracks (dat wil zeggen, de trajecten van elk van de kernen in tijd), met behulp van de nucleaire standpunten verkregen in de segmentatie, voer het script GenerateTracks.m in dezelfde werkmap. Zorg ervoor dat u de juiste segmentatie-bestand toevoegen als een inbreng verkregen (Zie het bestand StepbyStep.txt voor meer informatie).
Opmerking: Als uitgang, krijgt de gebruiker een bestand TrackedNameFile.mat, met een matrix voor de x-coördinaten en een andere matrix voor de y-coördinaten van de gegenereerde nummers. - Evalueren van de kwaliteit van de tracks met behulp van CheckTracking.m (Zie het bestand StepbyStep.txt voor meer informatie). Met de figuur van de uitvoer van deze laatste passage kunt visualiseren van elke positie van de kernen in de tijd. Controleer op de linkerzijde voor groene kruizen die elke gesegmenteerde nucleus aangeven. U selecteert een specifieke kern met de lagere scrollbar. Merk op dat de geselecteerde kern zal worden omcirkeld in het rood, terwijl aan de rechterkant, het traject van de geselecteerde cel kan worden gevolgd in tijd (met behulp van de bovenste scrollbar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als u wilt automatisch volgen nucleaire beweging tijdens myoblast differentiatie in levende imaging, moeten de kernen bij voorkeur worden fluorescently aangeduid. Het is belangrijk op te merken dat met behulp van DNA-intercalating moleculen niet haalbaar is omdat deze moleculen met de proliferatie en differentiatie van primaire myoblasts13 interfereren. Als voorbeeld, hebben de proliferatie en differentiatie in primaire myoblasts gekweekt met of zonder Hoechst (Figuur 1) is geanalyseerd. Het is duidelijk dat proliferatie (figuur 1A, B) en differentiatie (Figuur 1 c, middelste deelvenster) sterk beperkingen in myoblasts gekweekt met Hoechst 33342 ondervinden. Omgekeerd, myoblasts van muizen H2B-GFP werd geïsoleerd en gekweekt met doxycycline hebben kernen met groene fluorescentie en differentiëren op dezelfde manier te myoblasts geïsoleerd van wild-type muizen (Figuur 1 c, links en rechts panelen, respectievelijk).
Levende cel beeldbewerking met primaire myoblasts uiten het H2B-GFP-eiwit maakt het volgen van kernen tijdens differentiatie (Figuur 2 en aanvullende Video 1). Beelden van de transmissie- en GFP kanalen op de eerste (figuur 2A) en de laatste tijd punten (figuur 2B) tijdens de differentiatie van H2B-GFP myoblasts wetenschappers te identificeren myotubes en, bijgevolg, kernen die uiteindelijk laten samengevoegd een myotube (bijvoorbeeld de kern in de blauwe cirkel) te integreren of kernen die niet tot een myotube (bijvoorbeeld de kern in de rode cirkel samensmelten doen).
Om extract informatie over kernen/cel bewegingen van de levende cel imaging gegevens, kan het gebruik van de meegeleverde software voor het bijhouden van de trajecten van de kernen. De software maakt gebruik van het beeld van het H2B-GFP kanaal (de kernen; Figuur 3A) om een masker te maken en de kernen in elk frame in segmenten. Voor nucleaire segmentatie in een frame, is een "conservatieve" drempel gekozen aan de hand van de Otsu methode op de afbeelding na Gaussian filters14. Vervolgens objecten zijn ruwweg gesegmenteerd; Als u een fijnere segmentatie, wordt elk object gemaskeerd weer met behulp van een drempel op basis van het gemiddelde in het selectiekader. Een waterscheiding transformatie wordt vervolgens gebruikt om te scheiden in de buurt van objecten (figuur 3B). In onze handen, één watershed transformatie heeft niet in geslaagd om te scheiden van de meeste nabijgelegen kernen (figuur 3B, * inzet). Dus, we gebruikten het gebied de grotere objecten in de afbeelding selecteren en toepassen van een nieuwe watershed transformatie (figuur 3B, ** inzet), die is in staat om te scheiden extra nabijgelegen kernen. Met deze aanpak, zijn allermeest naar de kernen aangegeven in de afbeelding (afbeelding 3 c).
Als u wilt bijhouden van de kernen, verbeterd we de routines door de integratie van de routines van de tracking gepubliceerd door Tinevez15. Kortom, Verwijzigingen de tracking-algoritme kernen gedetecteerd in opeenvolgende frames met het oog op het minimaliseren van de som van de afstanden tussen de positie van elke kern in een frame en de positie van de dezelfde kern in de volgende, gebruik de "Hongaarse algorithm" voor dergelijke minimalisering16. De stap wordt herhaald om het koppelen van niet-gekoppelde kernen die tot een bepaalde maximum aantal frames weg. Een drempel voor de maximale afstand tussen de positie van een object in een frame en het volgende is ook gevestigd. Voor de hier gepresenteerde gegevens geven een maximumaantal van vijf frames en een maximale afstand van 20 pixels per stap een groot aantal van de juiste tracks (figuur 3D). Nog belangrijker is, kunnen we deze routines gebruiken om te controleren de kwaliteit van de tracering. Het is ook mogelijk om dit script te gebruiken om te vinden van cellen die een bepaald gedrag, bijvoorbeeld vormen (of niet) hebben een myofiber, en vervolgens analyseren van de dynamische functies van de set cellen van belang.
De toegepaste software genereert de tracks met de x - en y-coördinaten voor elke cel in frame n, 
, voor honderden cellen (figuur 3D). Wij kunnen dergelijke informatie gebruiken om informatie over kernen beweging te extraheren. Als voorbeeld, de totale verplaatsing tussen het eerste frame (n = 0) en het laatste frame N wordt als volgt gedefinieerd.
Verplaatsing van een traject = || 
||
Hier, "|| · ||" staat voor de norm van de vector (figuur 4A).
De snelheid van elke kern in frame n is als volgt.
Vervolgens kunnen we de lengte van een traject voor een bepaalde cel als volgt definiëren.
Lengte van het traject =
Als een voorbeeld van hoe deze eenvoudige parameters al relevante informatie kunnen geven, berekend we de lengte van de kernen trajecten van myoblasts geïncubeerd met of zonder Hoechst. Het blijkt dat de totale lengte van de trajecten iets hoger voor cellen gekleurd met Hoechst, is hoewel het verschil niet significant (figuur 4B is). Echter wanneer we berekend de totale verplaatsing tijdens een time-lapse, vastgesteld we hebben dat de totale verplaatsing van cellen gekleurd met Hoechst aanzienlijk kleiner dan die van onbevlekt cellen (figuur 4C was). Dit geeft aan dat het verkeer van gekleurde cellen een lagere directionaliteit. Om deze hypothese verder te versterken, gekwantificeerd we de directionaliteit van de beweging van een cel door het berekenen van de hoek van de snelheid in elk frame (figuur 4A).
Wij ook de variatie van de hoek tussen frames gekwantificeerd.
De variatie van de totale hoek langs een traject kan dan als volgt worden gedefinieerd.
Total hoek variatie =
Zoals voorspeld, de variatie van de hoek van de totale voor de onbevlekt cellen is aanzienlijk kleiner in vergelijking met cellen gekleurd met Hoechst (Figuur 4 d). Vandaar deze eenvoudige ingreep van directionaliteit, verkregen uit een eenvoudige berekening, geeft aan dat de myoblasts gekleurd met Hoechst minder gevoelig zijn voor het handhaven van de richting van hun ontheemding, waarin hun verminderde vermogen bij de vorming van myotubes (Figuur 1).
Kortom, levende imaging celgegevens gegenereerd zoals hier beschreven bieden een kwantitatief verband tussen nucleaire dynamiek en de mogelijkheid om de vorm myotubes en kan worden gebruikt als invoer voor een kwantitatieve karakterisering van hoge-doorvoer van nucleaire dynamiek en myoblast gedrag tijdens de differentiatie en fusion.
Figuur 1: incubatie met Hoechst interfereert met de proliferatie en differentiatie van myoblasts. (A) representatieve beelden van primaire myoblasts gekleurd met Hoechst na 24 h in de proliferatie medium (linkerdeel) of gekweekt voor 24u in proliferatie medium met Hoechst (rechtervenster), en (B) het relatieve kwantificering. Gegevens zijn de gemiddelde ± SEM, en de statistische significantie werd beoordeeld met de Student t-test. P < 0.05. (C) representatieve beelden van primaire wild-type myoblasts, gekweekte gedurende 24 uur in het onderscheiden van medium zonder (linkerdeel) of met Hoechst (middelste deelvenster), en van H2B-GFP myoblasts gekweekt gedurende 24 uur in het onderscheiden van medium (rechtervenster) en gekleurd met Hoechst (blauw) en een anti-myosin zware ketting antilichaam (MyHC; rood). De schaal balken = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Live beeldvorming van H2B-GFP myoblasts tijdens differentiatie. Samengevoegde afbeeldingen van transmissie- en GFP kanalen op (A) de eerste (t = 0 h) en (B) laatste keer punten (t = 16 h) tijdens de differentiatie van H2B-GFP myoblasts (20 x doelstelling). Enkele voorbeelden van myotubes zijn gemarkeerd met zwarte pijlen in deelvenster B. De schaal balken = 50 µm. (C) Magnified bezaaid gebieden uit panelen A en B , waarin men kan identificeren van een enkele kern die eindigt integreren in een myotube (in blauw) of niet (in rood) op t = 0 h, t = 8 h en t < / C12 > = 16 h. De schaal balken = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: segmentatie van H2B-GFP myoblasts bijhouden tijdens differentiatie. (A) voorbeeld van een frame van de tijd vervalt de kernen van ongeveer 400 cellen weergegeven. (B) voorbeeld van kernen maskeren en segmentatie. Heldere objecten zijn gesegmenteerd met behulp van zowel een globale en een lokale drempel en een watershed transformatie wordt toegepast om te scheiden in de buurt van kernen. Nabijgelegen kernen wellicht moeilijk aan segment (* verzonken vlak), dus een tweede waterscheiding gebaseerde segmentatie is uitgevoerd in objecten van grote gebieden in segmenten een hoger aantal kernen (** inzet). (C) gedetecteerd nucleaire standpunten (rode kruisjes), die later gebruikt in de tracking-algoritme. (D) Tracks die zijn gegenereerd met de tracking-algoritme die de som van de afstanden tussen de positie van elk object in twee opeenvolgende frames minimaliseert. Een maximale mogelijke waarde van zo'n afstand voor elk object wordt geleverd als een input waarmee wetenschappers om te linken kernen gescheiden door meer dan één frame. De schaal balken = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: kwantitatieve analyses van kernen dynamiek ontdekken het verminderde vermogen van myoblasts geïncubeerd met Hoechst om cel directionaliteit. (A) beschrijving van metingen van de parameter. Het is mogelijk om de snelheid van een nucleus definiëren door na te gaan van het standpunt in twee opeenvolgende frames. Het traject hoek en de variatie van de hoek kunnen vervolgens worden gemakkelijk berekend op basis van de standpunten zoals aangegeven in de regeling. (B) verdeling van de trajecten lengte, de totale verplaatsing (C) en (D) variatie van de hoek van de trajecten van myoblasts geïncubeerd zonder Hoechst (groene lijn) of met Hoechst (blauwe lijn). De twee distributies zijn niet significant verschillend, terwijl de totale verplaatsing aanzienlijk hoger is, en de variatie van de hoek aanzienlijk lager voor onbevlekt cellen is (eenzijdige Kolmogorov-Smirnov test, *p < 0,05 en **p < 0.005). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Video 1: Live beeldvorming van H2B-GFP myoblasts tijdens differentiatie. Imaging van H2B-GFP myoblasts gekweekt in medium differentiëren uit de oorspronkelijke (t = 0 h) op laatste keer punten (t = 16 h) met behulp van transmissie- en GFP kanalen (20 x doelstelling). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spiervezels (myofibers) zijn multinucleaire cellen die worden gevormd door de fusie van precursoren spiercellen (myoblasts) afgeleid van stam spiercellen (satelliet-cellen) die ondergaan van de proliferatie en differentiatie2,3, 4. Om te beoordelen myoblast differentiatie, bestaat de uniforme procedure voor het kweken van myoblasts in de differentiatie van de middelgrote en tot vaststelling van de cellen op verschillende tijdstippen uit te voeren van de immunofluorescentie kleuring voor MyHC, een marker van differentiatie en verkleuring van de kernen met DNA-intercalating moleculen (b.v., Hoechst)5. Deze methode is handig om te evalueren myoblast differentiatie door het meten van verschillende parameters, zoals de differentiatie index (aantal MyHC-positieve cellen/totaal aantal cellen) of de fusie index (aantal myotubes met ten minste twee kernen/totaal celaantal) . Myoblast kernversmelting en de vorming van de myotube zijn echter zeer dynamische processen die afhankelijk is van de motiliteit van de kernen8. Inderdaad, nucleaire positionering binnen myofibers is vereist voor de juiste spier regeneratie en functie17. De mobiliteit van myoblasts en van hun kernen zou kunnen blijken te zijn een kritieke parameter te evalueren myoblast differentiatie en ontdekken van nieuwe gebreken in musculaire stoornissen. Daarom is het essentieel om nieuwe procedures om te bestuderen van cel gedrag en nucleaire beweging tijdens myoblast differentiatie en de vorming van de myofiber te ontwikkelen.
Hier beschrijven we een methode waarmee wetenschappers te volgen myoblast differentiatie en myotube vorming door levende cel imaging en kwantitatieve analyses uitvoeren van de automatisch bijhouden van kernen. Het voordeel van deze methode is de mogelijkheid om bij te houden tijdens de differentiatie van fluorescerende kernen van myoblasts, geïsoleerd van H2B-GFP muizen, zonder enige cel transfectie of extra kleuring. De H2B-GFP muizen zijn commercieel verkrijgbaar en dus gemakkelijk te bereiken. Anderzijds is het mogelijk om te isoleren van de myoblasts van andere transgene muizen die uitdrukking geven aan een fluorescente proteïne in de celkern of aan transfect van de cellen geïsoleerd uit wild-type muizen uitspreken een fluorescente proteïne in de celkern, zoals eerder beschreven9 . Deze verschillende opties verder uit te breiden de mogelijke toepassingen van de methode die hier gepresenteerd.
Het huidige protocol is afhankelijk van de cultuur van de primaire myoblasts, en bijgevolg een hoge variabiliteit kan worden waargenomen in de volgende experimentele procedures, ook vanwege de mogelijke aanwezigheid van nonmyogenic cellen na de isolatie van spieren18 . Om deze beperking te overwinnen, is het mogelijk om te isoleren van de myoblasts door de cel sorteren als eerder beschreven19. Een ander kritisch punt in de hier beschreven methode is de moeilijkheid om het genereren van een perfecte opvolging van kernen wanneer cellen dicht bij elkaar, zoals tijdens de vorming van de myotube. Evenwel toestaan dat de hier besproken softwareroutines wetenschappers Inspecteer visueel of de kwaliteit van de tracking en, indien nodig, selecteert u een subset van cellen van belang zijn voor een latere analyse. Verdere verbetering van de software kan verplicht zijn te zorgen voor een volledige karakterisering van nucleaire dynamiek tijdens de vorming van de myofiber.
Kortom, is deze methode handig kwantitatieve om inzicht te verschaffen in de kernen dynamiek tijdens myoblast differentiatie door het vergelijken van verschillende omstandigheden, zoals we gemeld met Hoechst incubatie. In het volgende voorbeeld illustreert de mogelijkheid zinvolle dynamische om gegevens te extraheren uit time-lapse experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de AFM-Telethon e.v. (#21545) en door de toekenning van het Ospedale San Raffaele (OSR) zaad aan S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez vanaf de Hub van de beeld-analyse van het Institut Pasteur is erkend voor het publiekelijk delen van zijn "Eenvoudige Tracker" MATLAB routines.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
- Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. , SIAM. (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
