Summary
Différenciation musculaire squelettique est un processus très dynamique, qui s’appuie notamment sur positionnement nucléaire. Nous décrivons ici une méthode pour suivre les mouvements des noyaux par imagerie de cellules vivantes pendant la formation de différenciation et de myotubes myoblastes et d’effectuer une caractérisation quantitative de noyaux dynamique en extrayant les informations de suivi automatique.
Abstract
Un positionnement nucléaire au sein de cellules est important pour plusieurs processus cellulaires dans le développement et la régénération. L’exemple plus intrigant de positionnement nucléaire se produit au cours de la différenciation musculaire squelettique. Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées formés par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivés de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation. Bon positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et la fonction. La procédure uniforme pour évaluer la formation la différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes s’appuie sur les cellules fixes analysés par immunofluorescence, qui fait obstacle à l’étude du comportement de mouvement et de la cellule nucléaire au fil du temps. Nous décrivons ici une méthode pour l’analyse de formation de différenciation et de la fibre musculaire de myoblastes par imagerie de cellules vivantes. Nous fournissons un logiciel pour un suivi automatisé nucléaire afin d’obtenir une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et le comportement de myoblastes (c.-à-d., la trajectoire) au cours de la différenciation et la fusion.
Introduction
Le muscle squelettique est un tissu plus grand dans le corps humain, pour un total de 35-40 % de la masse de corps1. Cellules satellites sont des cellules souches musculaires, caractérisées anatomiquement par leur position (juxtaposée à la membrane plasmique, sous la couche basale des fibres musculaires), qui donnent lieu à la prolifération de myoblastes (progéniteurs myogéniques), qui finit par différencier et intégrer les myofibres existants et/ou fondre à forme nouvelle myofibres2,3,4. Leur découverte et les progrès dans l’étude de leur biologie a conduit à un aperçu significatif de développement musculaire et la régénération.
Protocoles d’isoler et de se différencier de myoblastes en myotubes ont été mis au point il y a de nombreuses années et sont encore largement utilisés pour étudier les muscles squelettiques différenciation5,6,7. Cependant, la plupart de ces méthodes représente les procédures statiques qui reposent sur l’analyse des cellules fixées et, par conséquent, ne permettent pas de scientifiques pour explorer pleinement les processus hautement dynamiques, telles que la fusion des myoblastes et de la maturation de la fibre musculaire. L’exemple le plus frappant est le positionnement nucléaire, qui est étroitement contrôlée, avec des noyaux au départ dans le centre de la fibre musculaire et, ensuite, situé à la périphérie après la fibre musculaire maturation8,9. L’imagerie Live est la technique la plus appropriée pour obtenir de plus amples aperçus de ce phénomène étrange.
Nous décrivons ici une méthode qui permet aux scientifiques d’enregistrer des myoblastes différenciation et myotubes formation en time-lapse microscopie et pour effectuer des analyses quantitatives de la poursuite automatique des noyaux de myoblastes. Cette méthode fournit une caractérisation quantitative de haut débit de comportement dynamique et de myoblastes nucléaire au cours de la différenciation et la fusion. Le protocole est divisé en quatre parties différentes, à savoir (1) la collection des muscles des membres postérieurs des souris, (2) l’isolement des myoblastes primaires qui consiste dans la digestion mécanique et enzymatique, myoblastes (3) la prolifération et la différenciation et (4) vivre d’imagerie pour suivre les noyaux au cours des 16 premières heures de la différenciation des myoblastes.
Dans la procédure suivante, les myoblastes sont isolés de souris H2B-GFP et traités avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la GFP-H2B, comme décrit précédemment10. Alternativement, il est possible d’isoler les myoblastes des autres souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans le noyau ou à transfecter les cellules isolées de souris de type sauvage à exprimer une protéine fluorescente dans le noyau, tel que décrit par Pimentel et al. 9.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de San Raffaele Institutional Animal Care.
1. la dissection des muscles postérieurs de la souris
- Stériliser les pinces et ciseaux (à la fois droites et courbes) à l’autoclave.
- Préparer et filtrer (0,22 µm) tous les médias (blocage moyen, moyen de digestion, prolifèrent moyen et moyen de différencier) avant de commencer l’expérience (voir Table des matières).
- Mettre 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une boîte de pétri pour collection de muscle de 35 mm.
- Sacrifier la souris par dislocation cervicale ou à l’aide de CO2 et stériliser la peau avec de l’éthanol. Enlever la peau des membres postérieurs et des membres supérieurs à l’aide de ciseaux et pince à épiler, afin de faciliter l’isolement des muscles.
Remarque : Les Muscles peuvent être isolés de souris néonatales ou adultes. Les souris néonatales ont un nombre accru de cellules satellites par rapport à des souris adultes. Toutefois, le nombre total de cellules satellites qui peuvent être isolés dans une souris adulte seule est suffisant pour réaliser l’expérience décrite ci-dessous. - Isoler le muscle jambier, soléaire, extenseur commun des orteils (EDL), gastrocnémien, quadriceps et triceps et mettez-les dans le plat de pétri contenant du PBS. Laisser le plat sur la glace. Retirez soigneusement les tendons et la graisse avec des ciseaux stérilisés et pince à épiler.
2. isolement des myoblastes primaires
Remarque : Toutes les procédures pour la culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles.
- Retirez les muscles de la PBS. Couper et émincer les muscles, à l’aide de ciseaux courbes stérile, jusqu'à l’obtention d’une masse uniforme. Mettre les morceaux de muscle dans un tube de 50 mL.
- Ajouter 10 mL de milieu digestion pour les morceaux de muscle et incuber à 37 ° C pendant 30 min sous forte agitation (250 min-1) dans un bain d’eau, à digérer enzymatiquement les muscles.
- Ajouter 10 mL de Dulbecco aigle modifié (DMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), glutamine 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % de gentamicine (blocage moyen) pour arrêter la digestion.
- Centrifuger à 40 x g pendant 5 min et recueillir le surnageant dans un tube de 50 mL. Sauver le culot sur la glace.
Remarque : Après la centrifugation, le surnageant contient certaines cellules satellites, cellules sanguines, les cellules endothéliales et fibroblastes, tandis que le granule contient des morceaux de muscle non digéré et du tissu conjonctif. Pour augmenter le nombre de cellules isolées, le culot doit être soumis à des mesures supplémentaires de la digestion tel que décrit ci-dessous. - Centrifuger le surnageant à 650 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de DMEM contenant 10 % FBS. Garder l’extrait concentré sur la glace.
- Répétez les étapes 2.2 – 2,5 x 2 pour le reste de l’extrait concentré obtenu à l’étape 2.4 et ajouter les boulettes ensuite remises en suspension pour le premier extrait concentré conservée sur la glace.
- Passer les boulettes remises en suspension à travers un filtre à 70 µm, puis à travers un filtre à 40 µm. Ajouter 15 mL de DMEM avec 10 % de BF et centrifuger à 650 x g pendant 5 min.
- Resuspendre le culot dans 3 mL de tampon de lyse des globules rouges pour épuiser les globules rouges. Il incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 40 mL de PBS à arrêter la lyse des globules rouges et centrifuger à 650 g pendant 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de DMEM avec 10 % FBS.
- Comme étape prédorure, plaque les cellules dans 20 mL de milieu de prolifération dans un 150 mm non revêtus de pétri. Après 1 h d’incubation dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2), recueillir le milieu.
Remarque : Les fibroblastes, fixation de la plaque, ensuite rejetées, alors que les cellules satellites restent en suspension. - Répétez l’étape 2,9 3 x et, à la dernière étape prédorure, recueillir le support qui contient les cellules satellites en suspension.
- Centrifuger à 650 x g pendant 5 min.
- Alors que les cellules sont centrifugation, enduire les deux plats de pétri de 150 mm avec le collagène (10 mL d’une solution à 0,1 % dans l’acide acétique 0,1 M). Pour ce faire, mettez le collagène sur la plaque, incuber pendant 5 min et retirez-le. Sécher la plaque pendant 30 min.
- Éliminer le liquide surnageant obtenu à l’étape 2.11 et resuspendre le culot dans 40 mL de milieu de prolifération (Table des matières). Plaque de cellules de collagène-enduit 150 mm deux boîtes de pétri (20 mL par plat) et garder les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2) dans le milieu de la prolifération pendant 2 – 3 jours avec 1 µg/mL de doxycycline pour induire l’expression de la H2B-GFP.
Remarque : Cette étape permet la prolifération des myoblastes pour obtenir un plus grand nombre de cellules pour plus amples essais. La densité cellulaire est maintenue très basses afin d’éviter une différenciation spontanée des myoblastes en myotubes.
3. tests de prolifération et la différenciation myoblastes
Remarque : Lorsque myoblastes densité est élevée, certaines cellules initier l’élongation, et ensuite, il est nécessaire de séparer les cellules. Généralement, il est possible de fractionner les cellules 2 x x-3 sans affecter leur phénotype.
- Ignorer le milieu, laver les cellules avec 5 mL de PBS, ajouter 2 mL de trypsine (1 x) et incuber les plaques à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 5 min. vérifier au microscope et, lorsque les cellules rondes détachement, ajouter 5 mL de DMEM avec 10 % FBS pour inactiver la trypsine. Compter le nombre de cellules (généralement, il est possible d’obtenir environ 1 x 106 cellules/souris).
Remarque : L’Incubation avec la trypsine pendant 5 min est habituellement assez pour détacher les myoblastes proliférantes. - Soumettre les cellules à l’un des essais décrits ci-dessous.
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Essai de prolifération
- Plaque 50 000 cellules par puits dans 1 mL/bien du milieu de la prolifération dans une plaque de 12 puits de collagène-enduit et incuber les cellules plaqués dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2). Difficulté et compter les cellules à 24, 48 ou 72 h.
NOTE : Le support est remplacé toutes les 48 h afin d’éviter l’épuisement des éléments nutritifs.
- Plaque 50 000 cellules par puits dans 1 mL/bien du milieu de la prolifération dans une plaque de 12 puits de collagène-enduit et incuber les cellules plaqués dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % de CO2). Difficulté et compter les cellules à 24, 48 ou 72 h.
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Test de différenciation
- Recouvrir une plaque de 12 puits avec 350 µL de différenciation moyenne contenant membrane basale matrice (1/100). Incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min et retirer le support.
- Plaque de 200 000 cellules/puits dans le milieu de la différenciation dans la plaque matrice-enduit. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2) jusqu'à ce qu’ils adhèrent à la plaque (2 h sont généralement assez pour les cellules d’adhérer et de commencer la différenciation).
- Afin d’évaluer la différenciation, effectuer une coloration pour la chaîne lourde de myosine et noyaux comme décrit précédemment11. Vous pouvez également effectuer des analyses de vivre-imagerie tel que décrit ci-dessous.
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Essai de prolifération
4. Live-imagerie de la différenciation des myoblastes et suivi nucléaire
- Pour l’imagerie de cellules vivantes, mettre les cellules obtenues à la section 3.2.2 et plaqué dans une plaque de 12 puits, sous un microscope confocal, équipé d’un système d’incubation pour maintenir les cellules à 37 ° C à 5 % de CO2.
- Utilisez un objectif de sèche 20 x (NA 0,7) pour obtenir des champs de vision avec des centaines de cellules, assez pour suivre la formation de la fibre musculaire. Les cellules H2B-GFP peuvent être photographiées avec un laser à Argon faible intensité 488 nm.
NOTE : Un trou d’épingle ouverte assure que la profondeur de l’image (~ 10 µm) contienne l’épaisseur de la cellule afin que les cellules sont conservées en bref tout au long de l’expérience. À l’aide d’un microscope confocal est avantageuse, car elle améliore le rapport signal-bruit des images, bien que la microscopie à champ large pourrait également être utilisée. Formation de la fibre musculaire peut être surveillée par le canal de transmission. - Acquisition d’images de 16 bits et 1 024 x 1 024 pixels par image toutes les 6 minutes pendant 16 h. Générer un fichier de multiframe.tif pour chaque position acquise, (voir l’exemple dans les Fichiers supplémentaires).
Remarque : Dans le présent protocole, les logiciels commerciaux associés au microscope (Table des matières) a été utilisé ; Utilisez le logiciel approprié pour atteindre le même objectif lorsque vous utilisez d’autres microscopes. - Télécharger le logiciel fourni sous forme de.zip fichier supplémentaire.
Remarque : Les routines sont des scripts qui doivent être exécutés en MATLAB. Le logiciel est une adaptation d’un logiciel publié12 optimisé pour le suivi des noyaux pendant la formation des myotubes. Ce logiciel est divisé en deux parties : l’une identifie les noyaux dans chaque image en segmentant, tandis que l’autre génère des « pistes » (trajectoires) du mouvement des noyaux. Le code complet de la segmentation nucléaire et de suivi et d’un guide détaillé de mise en route sont fournis dans les Fichiers supplémentaires. - Extrayez le fichier zip et enregistrez-le dans un chemin d’accès souhaité sur l’ordinateur personnel (PC) en cours d’utilisation. Effectuer toutes les dessous de passages sur un PC avec le logiciel nécessaire déjà installé. Notez que le fichier .zip est composé de trois dossiers qui est mentionné ci-dessous.
Remarque : Les Routines de Segmentation contient les fonctions à exécuter pour la segmentation. Routines de suivi, au contraire, contient les fonctions requises pour le suivi. Exemple de Segmentation suivi fournit les fichiers de se familiariser avec le système et les scripts de base. Le logiciel utilisé pour la segmentation et le suivi des noyaux s’exécute correctement dans MATLAB, R2015a ou versions ultérieures. - Pour segmenter les noyaux du fichier .tif, nommez le fichier, par exemple, NameFile.tif.
- Ouvrez le dossier Exemple Segmentation suivi et cliquez sur DoSegmentation.m. Ceci ouvrira la fenêtre de commande MATLAB.
- Vérifiez la fenêtre du Dossier en cours sur la gauche pour voir tous les éléments dans le dossier Exemple de Segmentation suivi . Double-cliquez sur DoSegmentation.m.
NOTE : Des informations détaillées sur les modifications qui doivent être montés dans le script se trouvent dans le fichier StepbyStep.txt. Il est obligatoire de modifier le script pour que la variable filenameinput est NameFile.tif et folderinput correspond au dossier où figure le fichier .tif. - Exécutez le script (en cliquant sur le vert bouton exécuter ). Le résultat de la segmentation est enregistré comme un file.mat (SegmentedNameFile.mat), tandis que la segmentation des noyaux peut être visualisée à la figure de sortie.
Remarque : Les paramètres pour la segmentation, décrit dans le script, peuvent être modifiés si nécessaire. La qualité de la segmentation peut être vérifiée à l’aide du script CheckSegmentation.m (voir le fichier StepbyStep.txt). Sur cette base, si la qualité de la segmentation est faible (seulement quelques noyaux détectés), ajuster les paramètres de la segmentation, clairement indiqué dans le script DoSegmentation.m et répéter la procédure.
- Pour générer les pistes (c.-à-d., les trajectoires de chacun des noyaux dans le temps), en utilisant les positions nucléaires obtenues dans la segmentation, exécutez le script GenerateTracks.m dans le même dossier de travail. N’oubliez pas d’ajouter le fichier de segmentation appropriée comme intrant, obtenus auparavant (voir le fichier StepbyStep.txt pour plus d’informations).
Remarque : En tant que sortie, l’utilisateur obtiendra un fichier TrackedNameFile.mat, avec une matrice pour les coordonnées x et une autre matrice pour les coordonnées y de la voie ferrée générée. - Évaluer la qualité des pistes à l’aide de CheckTracking.m (voir le fichier StepbyStep.txt pour plus d’informations). Utilisez la figure de la sortie de ce dernier passage pour aider à visualiser chaque position de noyaux dans le temps. Vérifier sur la gauche pour les croix vertes qui indiquent chaque noyau segmenté. Pour sélectionner un noyau spécifique, utilisez la barre de défilement inférieure. Notez que le noyau sélectionné sera encerclé en rouge, tandis que sur la droite, la trajectoire de la cellule sélectionnée peut être suivie dans le temps (à l’aide de la barre de défilement supérieure).
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Representative Results
Pour suivre automatiquement les mouvement nucléaire au cours de la différenciation des myoblastes en imagerie live, les noyaux doivent préférentiellement être fluorescent étiquetés. Il est important de noter que l’à l’aide de molécules d’ADN-intercalation n’est pas possible car ces molécules interfèrent avec la prolifération et la différenciation des myoblastes primaires13. À titre d’exemple, la prolifération et la différenciation ont été analysés dans les myoblastes primaires cultivées avec ou sans Hoechst (Figure 1). Il est évident que (Figure 1 a, B) la prolifération et la différenciation (Figure 1, panneau central) sont fortement altérées chez les myoblastes cultivés avec Hoechst 33342. À l’inverse, myoblastes isolés de souris H2B-GFP et cultivés avec la doxycycline ont des noyaux avec fluorescence verte et se différencient de la même façon aux myoblastes isolés de souris de type sauvage (panneauxFigure 1, droite et gauche, respectivement).
L’imagerie de cellules vivantes avec des myoblastes primaires exprimant la protéine GFP-H2B permet le suivi des noyaux au cours de la différenciation (Figure 2 et supplémentaire vidéo 1). Fusion des images de transmission et de canaux GFP à l’initiale (Figure 2 a) et la dernière fois points (Figure 2 b) au cours de la différenciation des myoblastes H2B-GFP permettent aux scientifiques d’identifier des myotubes et, par conséquent, les noyaux qui finissent par intégrer un myotubes (par exemple, le noyau dans le cercle bleu) ou les noyaux qui ne fusionnent pas dans un myotubes (par exemple, le noyau dans le cercle rouge).
Pour extraire des informations sur les mouvements de noyaux/cellule d’après les données d’imagerie de cellules vivantes, il est possible d’utiliser le logiciel fourni pour suivre les trajectoires des noyaux. Le logiciel utilise l’image du canal H2B-GFP (les noyaux ; Figure 3 a) pour créer un masque et de segmenter les noyaux dans chaque image. Pour segmentation nucléaire dans un cadre, un seuil de « conservateur » est sélectionné en utilisant la méthode d’Otsu sur l’image après gaussienne filtrage14. Ensuite, les objets sont à peu près segmentés ; pour obtenir une segmentation plus fine, chaque objet est masqué en utilisant un seuil basé sur la moyenne dans la zone englobante. Une transformation du bassin est ensuite utilisée pour séparer les objets (Figure 3 b) à proximité. Dans nos mains, une transformation de bassin versant a été incapable de séparer la plupart des noyaux voisins (Figure 3 b, * encart). Ainsi, nous avons utilisé la zone à sélectionner des objectifs plus larges de l’image et d’appliquer une nouvelle transformation de bassin versant (Figure 3 b, ** en médaillon), qui est capable de séparer les autres proches des noyaux. Avec cette approche, la plupart des noyaux est identifiée dans l’image (Figure 3).
Pour suivre les noyaux, nous avons amélioré les routines en incorporant les routines de suivi publiées par Tinevez15. En bref, l’algorithme de tracking lie noyaux détectés dans les images consécutives dans le but de réduire au minimum la somme des distances entre la position de chacun des noyaux dans une trame et la position du noyau même dans celle qui suit, à l’aide de l’algorithme de « hongrois » pour de telles 16de minimisation. L’étape est répétée afin de relier les noyaux non couplés qui sont jusqu'à un certain nombre maximal d’images loin. Un seuil pour la distance maximale entre la position d’un objet dans un cadre et celle qui suit est également établi. Concernant les données présentées ici, un nombre maximum de cinq images et une distance maximale de 20 pixels par étape donnent un grand nombre de titres correctes (Figure 3D). Ce qui est important, nous pouvons utiliser ces routines pour vérifier la qualité de la localisation. Il est également possible d’utiliser ce script pour trouver les cellules qui ont un comportement donné, par exemple former (ou non) une fibre musculaire et ensuite analyser les caractéristiques dynamiques de l’ensemble des cellules d’intérêt.
Le logiciel appliqué génère les pistes avec les coordonnées x et y pour chaque cellule dans le cadre n, 
, pour des centaines de cellules (Figure 3D). Nous pouvons utiliser ces informations pour extraire des informations sur le mouvement des noyaux. À titre d’exemple, le déplacement total entre la trame initiale (n = 0) et la dernière image N est définie comme suit.
Déplacement d’une trajectoire = || 
||
Ici, « || · || » est l’acronyme de la norme du vecteur (Figure 4 a).
La vitesse de chacun des noyaux dans le cadre n est comme suit.
Ensuite, nous pouvons définir la longueur d’une trajectoire pour une cellule donnée comme suit.
Longueur de la trajectoire =
Comme un exemple de comment ces paramètres simples peuvent déjà donner des informations pertinentes, nous avons calculé la longueur des trajectoires des noyaux des myoblastes incubés avec ou sans Hoechst. Il semble que la longueur totale des trajectoires est légèrement plus élevée de cellules colorées avec Hoechst, bien que la différence n’est pas significative (Figure 4 b). Cependant, lorsque nous avons calculé le déplacement total pendant un laps de temps, nous avons observé que le déplacement total de cellules colorées avec Hoechst était significativement plus faible que celui des cellules incolores (Figure 4). Cela indique que le mouvement de cellules colorées a une plus faible directivité. Pour renforcer encore cette hypothèse, nous avons quantifié la directionnalité de la motion d’une cellule en calculant l’angle de la vitesse dans chaque image (Figure 4 a).
Aussi, nous avons mesuré la variation de l’angle entre les cadres.
La variation de l’angle total le long d’une trajectoire peut alors être définie comme suit.
Total des variations de l’angle =
Comme prévu, la variation de l’angle total pour les cellules non souillés est significativement plus petite que cellules colorées avec Hoechst (Figure 4). Par conséquent, cette simple mesure de directivité, obtenue à partir d’un simple calcul, indique que les myoblastes colorées avec Hoechst sont moins enclins à maintenir le cap de leur déplacement, ce qui reflète leur capacité affaiblie dans la formation myotubes (Figure 1).
En bref, données d’imagerie de cellules vivantes générées comme décrit ici fournissent un lien quantitatif entre dynamique nucléaire et la capacité de myotubes de forme et peuvent être utilisées comme entrée pour une caractérisation quantitative de haut débit de dynamique nucléaire et myoblaste comportement au cours de la différenciation et la fusion.
Figure 1 : Incubation avec Hoechst interfère avec la prolifération et la différenciation des myoblastes. (A) les images représentatives des myoblastes primaires colorées avec Hoechst après 24 h en moyenne de prolifération (panneau de gauche) ou cultivées pendant 24 h dans un milieu de prolifération avec Hoechst (panneau de droite) et (B) la quantification relative. Les données sont la moyenne ± SEM et la signification statistique a été évaluée avec de Student t-test. P < 0,05. (C) des images représentatives de primaires sauvage myoblastes, cultivés pendant 24 h pour différencier les moyennes sans (panneau de gauche) ou avec Hoechst (panneau central) et des myoblastes H2B-GFP colorées et cultivées pendant 24 h pour différencier les médium (panneau de droite) avec Hoechst (bleu) et un anticorps de la chaîne lourde de anti-myosine (chaîne ; rouge). Les barres d’échelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : imagerie des myoblastes H2B-GFP durant la différenciation en direct. Des images fusionnées de transmission et GFP canaux à (A) l’initiale (t = 0 h) et (B) points dans le temps final (t = 16 h) au cours de la différenciation des myoblastes H2B-GFP (objectif 20 x). Quelques exemples de myotubes sont mises en évidence avec des flèches noires dans le groupe B. Les barres d’échelle = 50 µm. (C) Magnified pointillé surfaces des panneaux A et B , dans lequel il est possible d’identifier un seul noyau qui finit par intégrer un myotubes (en bleu) ou pas (en rouge) à t = 0 h, t = 8 h et t < / C12 > = 16 h. Les barres d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Segmentation des myoblastes H2B-GFP suivi au cours de la différenciation. (A) exemple d’une trame des fautes de temps montrant les noyaux des cellules environ 400. (B) exemple de noyaux de masquage et de segmentation. Des objets lumineux sont segmentés en utilisant un global et un local seuil, et une transformation du bassin versant est appliquée pour séparer à proximité de noyaux. Noyaux voisins peuvent être difficiles de segment (* en médaillon), donc une segmentation deuxième versant est exécutée dans les objets de grandes surfaces permet de segmenter un plus grand nombre de noyaux (** encart). (C) a détecté des positions nucléaires (croix rouge), qui sont ensuites utilisés dans l’algorithme de tracking. (D) les titres générés à l’aide de l’algorithme de tracking qui minimise la somme des distances entre la position de chaque objet dans deux images consécutives. Une valeur maximale possible d’une telle distance pour chaque objet est fournie comme une entrée qui permet aux scientifiques de relier les noyaux séparés par plusieurs trames. Les barres d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : analyse Quantitative de la dynamique des noyaux de découvrir la capacité affaiblie des myoblastes incubés avec Hoechst pour maintenir la directionnalité de la cellule. (A) Description de la mesure des paramètres. Il est possible de définir la vitesse d’un noyau en tenant compte de la position de deux images consécutives. L’angle de la trajectoire et la variation de l’angle peuvent ensuite être facilement calculées des positions comme il est indiqué dans le schéma. (B) Distribution de la longueur de trajectoires, déplacement total (C) et (D) la variation de l’angle de trajectoire de myoblastes incubés avec Hoechst (ligne bleue) ou sans Hoechst (ligne verte). Les deux distributions ne sont pas significativement différentes, tandis que la cylindrée totale est significativement plus élevée, et la variation de l’angle est significativement plus faible pour les cellules incolores (partial test de Kolmogorov-Smirnov, *p < 0,05 et **p < 0,005). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire vidéo 1 : Live durant la différenciation, l’imagerie des myoblastes H2B-GFP. Imagerie des myoblastes H2B-GFP cultivées pour différencier les moyennes de l’initiale (t = 0 h) aux points dans le temps final (t = 16 h) à l’aide de canaux GFP (objectif 20 x) et transmission. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Les fibres musculaires (fibres musculaires) sont des cellules multinucléées qui sont formées par la fusion de cellules précurseurs de muscle (myoblastes) dérivée de cellules souches musculaires (cellules satellites) qui subissent la prolifération et la différenciation2,3, 4. Afin d’évaluer la différenciation des myoblastes, la procédure commune consiste en cultivant des myoblastes au moyen de différenciation et de fixer les cellules à des moments différents pour effectuer l’immunofluorescence souillant pour chaîne, un marqueur de différenciation et de coloration de noyaux avec intercalation d’ADN molécules (p. ex., Hoechst)5. Cette méthode est utile pour évaluer la différenciation des myoblastes en mesurant différents paramètres, tels que l’indice de différenciation (nombre de nombre de cellules de cellules/total MyHC positif) ou l’indice de fusion (nombre de myotubes au moins deux noyaux/cellule nombre total) . Cependant, fusion des myoblastes et formation des myotubes sont des processus très dynamiques qui s’appuient sur la motilité des noyaux8. En effet, le positionnement nucléaire au sein des fibres musculaires est nécessaire pour la régénération musculaire correcte et fonction17. La mobilité des myoblastes et de leurs noyaux pourrait se pour révéler un paramètre essentiel pour évaluer la différenciation des myoblastes et de découvrir de nouveaux défauts de troubles musculaires. Par conséquent, il est essentiel de développer de nouvelles procédures pour étudier le comportement cellulaire et nucléaire mouvement durant la différenciation des myoblastes et formation de la fibre musculaire.
Nous décrivons ici une méthode qui permet aux scientifiques de suivre la formation de différenciation et de myotubes myoblastes par imagerie de cellules vivantes et d’effectuer des analyses quantitatives de la poursuite automatique des noyaux. L’avantage de cette méthode est la possibilité de suivre au cours de la différenciation des noyaux fluorescents des myoblastes, isolés de souris H2B-GFP, sans la transfection cellulaire ou coloration supplémentaire. Les souris H2B-GFP sont disponibles dans le commerce et, par conséquent, facilement accessible. Par ailleurs, il est possible d’isoler les myoblastes des autres souris transgéniques exprimant une protéine fluorescente dans le noyau ou à transfecter les cellules isolées de souris de type sauvage à exprimer une protéine fluorescente dans le noyau, comme décrit précédemment9 . Ces différentes options encore étendent les applications potentielles de la méthode présentée ici.
Le protocole actuel repose sur la culture des myoblastes primaires et par conséquent, une forte variabilité pourrait être observée dans les procédures expérimentales suivantes, également en raison de la présence potentielle de cellules nonmyogenic après l’isolement du muscles18 . Pour contourner cette limitation, il est possible d’isoler des myoblastes par cellule tri comme décrit précédemment19. Un autre point critique de la méthode décrite ici est la difficulté pour générer un suivi parfait des noyaux lorsque les cellules sont rapprochées, comme au cours de la formation des myotubes. Toutefois, les routines de logiciels discutés ici permettent aux scientifiques d’inspecter visuellement la qualité du suivi et, le cas échéant, pour sélectionner un sous-ensemble de cellules d’intérêt pour une analyse ultérieure. Nouvelles améliorations du logiciel peuvent être nécessaires pour obtenir une caractérisation complète de la dynamique nucléaire pendant la formation de la fibre musculaire.
En conclusion, cette méthode est utile pour fournir quantitatif aperçu dynamique des noyaux au cours de la différenciation des myoblastes en comparant les différentes conditions, comme nous l’indiquions avec Hoechst d’incubation. Cet exemple illustre la possibilité d’extraire des données significatives de dynamiques de time-lapse expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’AFM-Telethon e.v. (#21545) et par la subvention de démarrage de Ospedale San Raffaele (OSR) à S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez du moyeu de l’analyse d’Image de l’Institut Pasteur est reconnue pour partager publiquement ses routines MATLAB « Simple Tracker ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
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