Summary
Denne artikel introducerer en eksperimentel protokol med 3D-scanningsteknologi, som bygger bro mellem to rumlige skalaer: den makroskopiske rumlige skala af helhjernens anatomi, som er afbildet af MRI ved > 100 μm og den mikroskopiske rumlige skala af neuronal distributioner ved immun Histokemisk farvning og et multielektrode array system og andre metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den menneskelige hjerne, som er en multi skala system, har både makroskopiske elektriske signaler, globalt flyder langs tykke hvide stof fiber bundter, og mikroskopiske neuronal pigge, formerings langs axoner og dendritter. Begge skalaer supplerer forskellige aspekter af menneskets kognitive og adfærdsmæssige funktioner. På det makroskopiske niveau har MRI været den nuværende standard billedbehandlingsteknologi, hvor den mindste rumlige opløsning, voxel størrelse, er 0,1 – 1 mm3. Også på mikroskopisk niveau, tidligere fysiologiske undersøgelser var klar over ikke-ensartede neuronal arkitekturer inden for sådanne voxels. Denne undersøgelse udvikler en effektiv måde til præcist at integrere mikroskopiske data i et makroskopisk kort ved at grænseflade biologisk videnskabelig forskning med teknologiske fremskridt i 3D-scanningsteknologi. Da 3D scanningsteknologi for det meste er blevet brugt til ingeniørarbejde og industrielt design indtil nu, det er repurposed for første gang at indlejre microconnectomes i hele hjernen samtidig bevare naturlige spiking i levende hjerneceller. For at opnå dette formål, først, vi konstrueret en scanning protokol til at opnå nøjagtige 3D-billeder fra levende bio-organismer i sagens natur udfordrende at billedet på grund af fugtige og reflekterende overflader. For det andet, vi uddannet til at holde fart for at forhindre nedbrydning af levende hjernevæv, som er en nøglefaktor i at bevare bedre betingelser og registrere mere naturlige neuronal pigge fra aktive neuroner i hjernevæv. To kortikale overflade billeder, uafhængigt udvundet fra to forskellige billedbehandlings moduler, nemlig MRI-og 3D-scanner overflade billeder, viser overraskende en afstands fejl på kun 50 μm som tilstandsværdi af histogrammet. Denne nøjagtighed kan sammenlignes med den mikroskopiske opløsning af intercellulære afstande. også, det er stabilt blandt forskellige individuelle mus. Denne nye protokol, 3D romanen Embedding overlappende (3D-NEO) protokol, broer makroskopiske og mikroskopiske niveauer afledt af denne Integrative protokol og accelererer nye videnskabelige resultater for at studere omfattende forbindelses arkitekturer (dvs. microconnectome).
Introduction
Ikke-ensartede multiscale arkitekturer ved forskellige fysiske og biologiske organisationer er almindeligt forekommende1,2. Hjernen er også en meget ikke-ensartet og multi skala netværksorganisation3,4. Forskellige kognitive funktioner er kodet i sådanne netværk organisationer, bedrift tidsmæssige ændringer af elektriske Spike mønstre af neuronal populationer i submillisecond tidsmæssige opløsninger. Historisk set blev de komplekse netværk blandt neuroner strukturelt observeret i detaljer ved hjælp af farvnings teknikkerne af Santiago Ramón y cajal fra over 150 år siden5. For at observere gruppe adfærd af aktive neuroner, forskere har udviklet forskellige optagelses teknologier6,7,8, og den seneste betydelige udvikling af sådanne teknologier har gjort det muligt for os at registrere elektriske aktiviteter fra et stort antal neuroner samtidigt. Ud fra sådanne funktionelle aktiviteter har forskerne desuden formået at genopbygge netværk af kausale interaktioner mellem et stort antal neuroner og har erklæret den topologiske arkitektur af deres komplekse interaktioner ' microconnectome '9 . Makroskopiske observationer af hjernen giver også mulighed for med hensyn til en hel hjerne som et netværk organisation, fordi mange hjerneregioner er forbundet med flere fiber-bundter. Indlejringen af microconnectomes i det globale hjerne kort har stadig klare begrænsninger inden for de nuværende teknologiske fremskridt, hvilket er grunden til, at denne integrerings protokol er så vigtig. Der er dog mange udfordringer i udviklingen af integrerings protokollen. For eksempel, for at observere aktiviteter af levende lokale neuronal kredsløb i rent isolerede hjerneområder, hjerne skiver skal produceres til in vitro-optagelser. Derudover er optagelser fra hjerne skiver til in vitro-optagelser stadig et vigtigt valg af mindst to grunde. For det første er det stadig ikke let at observere aktiviteter af mange levende individuelle neuroner samtidig fra hjernen regioner dybere end ~ 1,5 mm og i høj tidsmæssig opløsning (< 1 MS). For det andet, når vi håber at kende den interne arkitektur af en lokal neuronal kredsløb, er vi nødt til at stoppe alle indgange, der kommer fra eksterne hjerneregioner for at eliminere forstyrrende faktorer. For at identificere retninger og positioner af producerede hjerne skiver, vil det være yderligere nødvendigt at integrere de rumlige positioner af disse producerede hjerne skiver ved hjælp af koordinater. Der er dog et par systematiske og pålidelige måder at gøre hjernen skiver på en organiseret måde10,11. Her introduceres en ny koregistration protokol, ved hjælp af 3D scanning teknologi til neurovidenskabelig forskning for at give en integrativ protokol. Denne protokol handler om at koordinere mikro-og makro vægte og integrere mikrodata12,13 og farvnings data på et makroskopisk MRI-rum via 3D-scannings flader af ekstraherede hjerner samt af ikke-invasivt optaget hjerne. Overraskende, indeværende viste en afstand fejl i bare ~ 50 μm nemlig den måde værdi i den histogram. Som følge heraf var tilstandsværdierne for minimumsafstande mellem to overflader mellem MRI-overfladen og den scannede 3D-overflade næsten 50 μm for alle seks mus, hvilket er et passende tal, når der søges efter ensartethed blandt individer. Den typiske skive bredde havde en indspillet Spike aktivitet på omkring 300 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Kyoto-universitetets dyrebeskyttelses Komité.
1. dyr (dag 1)
- Forbered kvindelige C57BL/6J mus (n = 6, i alderen 3 − 5 uger).
Bemærk: Denne protokol gælder for alle gnaverarter.
2. MRI-indstillinger (dag 1)
- Sæt musen i en akryl anæstesi boks placeret på en varmelegeme mat justeret til 37 °C ved hjælp af en radiator mat controller.
- Bedøvelse musen med 2% isofluran i luft strømmer gennem kassen ved en strømningshastighed på 1,4 L/min ved hjælp af en anæstesi system, som er sammensat af en isofluran vaporizer, luft flow meter, og luftkompressor.
- Efter induktion af anæstesi, placere musen i en MRI-kompatibel vugge i udsatte position. Kontroller, om anæstesi er tilstrækkeligt ved at klippe en tå af musen med pincet for at se, om det ikke føler smerte.
- Fastgør musens hoved med tandstangen og ansigtsmasken, som er udstyret med holderen. Derefter, vedligeholde anæstesi med 1% − 1.5% isofluran i luft ved 1,4 L/min via ansigtsmaske.
- Indsæt en termo mistor temperatursonde i endetarmen af musen og Placer en trykfølsom respiration sensor på bagsiden af musen.
- Overfør holderen til boring af en MRI-magnet. Koncentrationen af isofluran justeres til ca. 1% − 1,5% for at sikre en stabil og reproducerbar dybde af anæstesi. Monitor, hvis kropstemperaturen styres mellem 33 − 35 °C og respirationshastigheden mellem 0,5 − 1,3 Hz under hele MRI-eksperimenterne, ved hjælp af et overvågningssystem (tabel over materialer) til de fysiologiske parametre for små dyr med dedikeret software (tabel over materialer).
- Ved hjælp af den målte værdi af rektal temperaturen regulere kropstemperaturen ved at styre temperaturen af varm luft, der leveres i magnet boring fra et varmesystem udstyret i overvågningssystemet.
3. Mr-opkøb (dag 1)
-
Forberedelser til 3D T2-vægtet MRI-scanning med høj opløsning
- Erhverve tre magnetiske resonans (MR) billeder i tre retvinklede (aksial, koronal, og sagittal) fly for at kontrollere musens position.
- Med henvisning til disse billeder skal du justere placeringen af musen ved at flytte holderen, så midten af muse hjernen er placeret i midten af resonatoren samt i midten af gradient spoler i aksial retning.
- Justér MRI-systemet ved at indstille resonatoren, justere den statiske magnetiske felt homogenitet (flimmer) og den grundlæggende frekvens og kalibrere radiofrekvens strømmen (RF).
- Opnå 2D-billeder med lav opløsning med flere skiver, T2-vægtede (T2W) med kantede og sagittiske retninger. Baseret på disse billeder, bestemme synsfeltet (FOV) for en høj opløsning 3D T2W MRI scanning.
- Udfør lokaliseret konisk ved hjælp af en fastmap automatisk shim-algoritme. For FASTMAP-protokollen skal du vælge et rektangulært område, der dækker hele hjernen. Efter færdiggørelsen af den lokaliserede flimmer, Bekræft B0 felt inhomogenitet i hjernen region af en lokaliseret 1H spektrum ved hjælp af punkt-løst SPEKTROSKOPI (tryk).
- Erhverve 3D T2W billeder med lav opløsning for at sikre, at scanningsindstillingerne for 3D-T2W MRI med høj opløsning er passende ved at kontrollere den relevante position af FOV, fraværet af wraparound (aliasing) artefakter og effektiv undertrykkelse af fedt signaler.
-
Imaging Pulse sekvens
- Efter de præparater, der er beskrevet ovenfor, erhverve høj opløsning 3D T2W billeder af musens hele hjernen, ved hjælp af en hurtig erhvervelse med afslapning ekstraudstyr (sjælden) sekvens.
Bemærk: I denne artikel blev der udført MRI-eksperimenter på en 7 T, 210 mm horisontal boring, præklinisk scanner, udstyret med et gradueringssystem på 440 mT/m ved rampetiden 100 μs. En kvadratur volumen resonator med en indvendig diameter på 35 mm blev brugt til RF excitation og signalmodtagelse. Mr-data blev anskaffet med en dedikeret Operations software. Anskaffelses parametrene for den 3D sjælden pulssekvens, der anvendes i dette studie, er opsummeret i tabel 1.
- Efter de præparater, der er beskrevet ovenfor, erhverve høj opløsning 3D T2W billeder af musens hele hjernen, ved hjælp af en hurtig erhvervelse med afslapning ekstraudstyr (sjælden) sekvens.
4. klargøring af eksperimentelle opløsninger (dag 2)
- Forbered 500 mL af en iskold skære opløsning (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 7 mm mgcl2, 15 mm glucose, 25 mm NaHCO3, 0,5 mm CaCl2, 11,6 mm natriumascorbat, 3,1 mm natrium pyruvat og 100 mm cholinchlorid, bukkede med 95% O2 og 5% Co2). Juster pH-værdien til 7,3 − 7,4.
- Forbered 1 L af den kunstige cerebrospinalvæske (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 1 mm mgcl2, 15 mm glucose, 25 mm NaHCO3, og 2 mm CaCl2, BUKKEDE med 95% O2 og 5% Co2). Justér pH-værdien til 7,3 – 7,4.
5. klargøring af udstyr (dag 2)
- Forbered en 6,6 cm2 kvadrat, 0,5 cm tyk magnet "ring" og først placere sort tape og, for det andet, kirurgisk tape på ringen (figur 1c-2). Bemærk, at dette materiale hedder en hjerne blok base (BBB), og holde det koldt på blokke af is.
Bemærk: Senere vil båndene blive fastgjort til udsnitnings stationen med hjerne blokke til vibratome. Den firkantede ring bruges som den nederste base af BBB til at opfylde to formål, nemlig at migrere hjernen blokke jævnt fra 3D-scanning Station til en vibratome og til at måle præcist højder af hjernen blokke i scanningen trin. - Konfigurer BBB med en automatisk pladespiller. Tænd for scanneren og drejeskiven. Start billedbehandlings softwaren.
-
Forud for alle eksperimenter, udføre kalibreringer af kameraerne og den tilsluttede pladespiller af en struktureret lys projektion og desktop-type 3D scanner.
- Tænd for Center projektoren, de to kameraer og drejeskiven. Åbn derefter softwaren. I softwaren skal du klikke på optisk opsætning og vælge billedområdet som 100 x 80 og gitter numrene som 100 x 100. Derefter starter kameraets kalibrering i henhold til følgende fire trin.
- Til projektorens Opsætning skal du lægge kalibrerings arket på skrivebordet og sætte kalibrerings kortet på kalibrerings arket for at justere måleområdets fastgørelsespunkt til midten af arket og retningen til forsiden. Juster afstanden mellem projektoren og brættet til ca. 200 mm. Løsn skruerne, som fastgør de to knapper, og drej knapperne for at justere lysfølsomhed og fokus for de to kameraer. Klik derefter på pil for at gå til næste trin.
- For at orientere kameraerne skal du løsne skruerne, som fastgør de to kameraer selv og flytte positionerne og rotationerne, så de overlapper med midterlinjen på kalibrerings kortet, den lodrette linje og det gule kryds projiceret fra projektoren. Fastgør kameraerne, og klik på pil igen. Derefter bliver skærmen mørk.
- For at fokusere kameraerne, efter løsningen af fastgørelsesskruerne på knoperne, skal du øge lysfølsomhed og tune fokus igen. Klik derefter på pil for at gå til næste trin.
- For F-værdien og eksponeringsgraden (for kameraet) skal du justere lysfølsomhed igen til lige under, hvor den røde region forsvinder. Klik derefter på pil igen, og klik på kalibrerings start, og vælg Ja , hvis du bliver spurgt, om du har afsluttet den optiske indstilling?
- Klik på Initialiser kalibreringen, og kontroller, om pixelværdierne er normaliseret mellem 0 – 255. Klik derefter på Fortsæt.
- Ved at følge foreslåede positioner, optage billeder af ni forskellige relative vinkler af scanneren og kalibrerings kortet, og Afslut efter bekræftelse af kalibreringsprocessen, og endelig, klik på opdatering af kalibreringen.
- Ombytte kalibrerings kortet for drejeskiven, og klik på plade kalibreringen.
Bemærk: Nu er alle kalibreringer afsluttet.
- Tænd for Center projektoren, de to kameraer og drejeskiven. Åbn derefter softwaren. I softwaren skal du klikke på optisk opsætning og vælge billedområdet som 100 x 80 og gitter numrene som 100 x 100. Derefter starter kameraets kalibrering i henhold til følgende fire trin.
6. scanning af hjerne overfladen, skæring og MEA-optagelse (dag 2)
- Bedøvelses en mus med 1% − 1,5% isofluran og halshug musen. Brug en skalpel til at åbne huden og udsætte kraniet.
- Skær hovedbunden af den bedøvede mus langs sagittalsuturen ved hjælp af en kirurgisk kniv, og skær kraniet i diagonale retninger fra lambda-punktet til et punkt lidt foran bregma ved hjælp af kirurgisk saks. Derefter forsigtigt skrælle kraniet fra hjernen ved hjælp af buede tweezers.
- Brug en spatel til at løfte hjernen og overføre den til en Petri skål (100 mm x 20 mm) med iskold skære opløsning (forberedt i trin 4,1). Flow luft, der indeholder 95% O2 og 5% Co2 fra en ekstern gasbombe med en kontrolleret rotationshastighed på pumpen (~ 4,0 RPM) for at generere små bobler i den iskold skære opløsning (figur 1a).
- Efter 1 – 2 min, sætte hjernen på en microfiber klud, hvis overflade er lidt dækket af en mel sigte, og tørre væske fra hjernen overflade, forsigtigt ved hjælp af microfiber klud (figur 1b).
- Sætte hjernen med sin dorsale aspekt op på prøvestanden på BBB, og også sætte BBB i midten af den automatiske pladespiller.
- Gør rummet mørkere under 3D-scanningen, og Udfør en 3D-scanning på drejeskiven. Hvis du vil teste, om 3D-scanningen fungerer godt, skal du klikke på 3D-scanning ved at vælge vinklen mellem to billeder som 22,5, start vinklen som 0 og den sidste vinkel som 360 (figur 1c-1).
- Flyt hjernen til en Petri skål, og boble hjernen i skære opløsningen for ca. 10 s.
- Skær hjernen i to blokke i midten af det koronale plan ved hjælp af en kirurgisk kniv, og Flyt de to hjerne blokke forsigtigt til den flade overflade ved hjælp af en kirurgisk spatel.
- Fastgør hjernen blokke af BBB ved hjælp af instant lim, og blødt og forsigtigt tørre væsken fra hjernen overflade inden for 1 – 2 min, ved hjælp af en microfiber klud igen. Udfør derefter en 3D-scanning igen (figur 1c-2).
- Fastgør den sorte tape, der dækker midten af BBB til midten af skæringen for en vibratome (figur 1d).
- Hæld skæring løsning i skæring fase og sætte skæring fase på vibratome. Juster skærehastigheden og amplitude. Lav 2 – 5 koronale skiver (300 μm tyk) fra de to hjerne blokke. Hold opløsningen i skære stadiet boblende, hvis det er muligt (figur 1E).
- Fastgør en klinge til knivholderen på vibratome og Optimer systemets skærehastighed, frekvens og vibrations amplitude ved at sætte dem som 12,7 mm/min for hastigheden, 87 – 88 Hz for frekvensen og 0,8 – 1,0 mm for sving bredden. Når omhyggelig skæring er nødvendig, bremse hastigheden til niveau 2 – 3.
- Mens skære hjernen skiver, registrere den skiver koordinat i det format, herunder den forreste-posterior koordinat, halvkugle, og andre betingelser (figur 2c).
- Overfør forsigtigt hjerne Snittene til et bægerglas fyldt med forvarmet (~ 34 °C) ACSF ved hjælp af en tyk plastik pipette, og Inkuber dem i bægerglasset ved ~ 34 °C i ~ 1 time. I løbet af denne tid, udføre en 3D-scanning af de resterende hjerne blokke på skæring fase (figur 1c-2).
- Indstil en MEA-chip på en optageenhed. Tilslut chippen til en peristaltisk pumpe ved hjælp af to rør. Brug et rør til at styre den samme ACSF i MEA-chippen og det andet rør for at styre ACSF ud af MEA-chippen.
- Fastgør to nåle (0,60 mm x 19 mm), forbundet ved spidsen af de to rør, til toppen af væggen af MEA-chippen, og fastgør deres positioner med deres spidser efter den indvendige væg af MEA-chippen. Indstil strømningshastigheden af ACSF til 4,1 rpm.
- Når 1 time er passeret, skal du flytte et udsnit på chippen ved hjælp af en tyk plastik pipette og indstille positionen ved hjælp af en blød børste. Derefter starte optagelsen proces af neuronal aktiviteter (figur 2-d).
7. immun Histokemisk farvning (dag 3 og 4)
- Når MEA-optagelsen er færdig, overføres udsnittene til 1,5 mL rør fyldt med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Inkubatér dem natten over ved 4 °C. Fjern derefter 4% PFA-opløsningen, og vask udsnittene 3x med PBS i alt 5 minutter.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, indlejre udsnittene i 20% gelatine/PBS og resektion skiven for at gøre det tyndere end 50 μm, ved hjælp af vibratome. - Forbered antigen genfinding opløsning (10 mM natriumcitrat, pH 6,0). Fjern PBS fra den sidste vask og tilsæt antigen-genfindings opløsningen.
- Kog vand i en elektrisk Termokande og Inkubér rørene med skiverne i 20 minutter ved ~ 95 – 98 °C i gryden, efterfulgt af naturlig afkøling.
- Forbered 50 mm Tris-bufferet saltvand og tilsæt 1% na bisulfit (1% na natriumbisulfit-Tris-opløsning). Juster pH-værdien til 7,5. Derefter vaskes udsnittene med 1% na bisulfite-Tris-opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur (~ 20 – 25 °C).
- Forbered blokerende opløsning ved at tilføje 4% normalt gede serum og 0,5% Octylphenol ethoxylat til 1% na bisulfite-Tris-opløsningen.
- Fjern 1% na bisulfite-Tris-opløsningen fra rørene med skiver og Tilføj blokerende opløsning. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
- Den primære antistof opløsning fremstilles ved tilsætning af 1% normalt gede serum og 0,5% Triton X-100 til 1% na bisulfite-Tris-opløsningen og fortynding af primære antistoffer. Brug følgende koncentrationer af primære antistoffer: 1:800 af mus anti-GAD67 og 1:500 af kanin anti-NeuN.
- Fjern 1% na bisulfite-Tris-opløsningen fra rørene med skiverne, og tilsæt den primære antistof opløsning. Inkubatér den natten over ved 4 °C.
- Forbered 50 mM Tris-bufferet saltvand og tilsæt 8,5 g/L NaCl (Tris-NaCl-opløsning). PH-værdien titreret til 7,5. Derefter vaskes udsnittene 3x med Tris-NaCl-opløsningen (~ 20 – 25 °C) i 5 minutter i alt.
- Den anden antistof opløsning fremstilles ved tilsætning af 3% normalt gede serum og 0,3% Triton X-100 til Tris-NaCl-opløsningen og fortynding af sekundære antistoffer. Brug følgende koncentrationer af sekundære antistoffer: 1:500 af ged anti-Mouse og 1:500 af ged anti-kanin.
- Fjern Tris-NaCl-opløsningen fra rørene med skiverne, og tilsæt den sekundære antistof opløsning. Inkubatér den i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter vaskes skiver 3x med Tris-NaCl-opløsningen i 5 min i alt.
- Placer udsnittene på diaset ved hjælp af en lille børste, og Anvend monterings medier og en dækseddel. Undersøg diasene med et Konfokal mikroskop. Tag billeder af overfladen af et udsnit (figur 2E).
8. Mr-data behandling til at udtrække kortikale volumener
- Installer den gratis software FSL (https://FSL.fmrib.ox.ac.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation). Klargør de MRI-billeder, som er erhvervet i afsnit 3.
- Skift billedformatet ved hjælp af kommandoen fslchfile type NIFTI_PAIR_GZ . Udvid hjerne billedet for at gøre det så stort som en menneskelig hjerne ved hjælp af kommandoen fslcreatehd , og Skift om nødvendigt retningen ved hjælp af fslorient med option -setqformcode 1. Efter dette, gendanne det oprindelige filformat ved hjælp af fslchfile type NIFTI_GZ. Den nøjagtige kommando er som følger.
fslchfile type NFTI_PAIR [input Image]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [input billede]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [input Image]. HDR. gz
fslchfile type NIFTI_GZ [input Image] - Skriv FSL for at åbne FSL-softwaren. Uddrag hjerner ved hjælp af bet kommando fra den grafiske brugergrænseflade (GUI), men ikke skrælle for meget. Derefter, styre de fraktioneret intensitet tærskler,... og koordinater af centrum af den indledende hjerne overflade sfære omhyggeligt. De optimale værdier er forskellige for individuelle data.
- Resize hjernen billedet til den oprindelige mus hjernen størrelse, ved hjælp af samme procedure som i trin 8,2. Den nøjagtige kommando er som følger:
fslchfile type NFTI_PAIR [input Image]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,08 0 0 0 0 4 [input billede]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [input Image]. HDR. gz
fslchfile type NIFTI_GZ [input Image] - Coregistrate alle hjerne billeder ved hjælp af flirt kommando, og producere en gennemsnitlig hjerne billede ved hjælp af -Add option og -div mulighed for fslmath kommando.
fslmaths [Brain image 1] – add... – Tilføj [Brain image N] – div N [gennemsnitligt billednavn] – ODT float - Gør den gennemsnitligt hjerne renser ved hjælp af -thr mulighed for fslmath kommando. Vælg derefter en optimal tærskelværdi, som er tilpasset individuelle tilfælde.
fslmaths [gennemsnitligt billednavn] – thr [thr værdi, for eksempel, 5000] [thresholded Average Image] - Endelig omforme det gennemsnitligt hjerne billede til en persons koordinat ved hjælp af flirt -kommandoen igen. Derefter forberede temmelig rene ekstraherede cortexes (figur 2a).
Bemærk: Desværre, den olfaktoriske pære og cerebellum vil ikke være perfekt i den rekonstruerede hjerne overflade fra MRI-volumener på grund af FSL softwarens væsentlige begrænsninger for at Peal alle hjerne dele herunder olfaktoriske pære og cerebellum.
9. MRI-billedbehandling til stribe kortikale overflader
- Download en anden gratis software, 3D slicer (https://download.Slicer.org/).
- Åbn MR billeder af den ekstraherede hjerner (Klik på fil og vælg Tilføj data) produceret i henhold til afsnit 8, ved hjælp af Volume rendering og Editor moduler i 3D Slicer.
- Skift tilstanden fra Editor til Volume rendering, og klik på en målknap for at få billedet af hjernen til at komme til midten af skærmen.
- Vælg Mr-T2-Brain mode og tune tærsklen ved at flytte Shift bar. Flyt derefter tilbage fra Volume rende ring til Editor , og klik på knappen tærskeleffekt .
- Påfør etiketten 41. Hjernebarken og gemme hjernen overflade data som en . STL fil. Derefter skal du ændre filformatet fra . vtk til . STLog gemme filen ved at markere formularen.
10. forbehandling til 3D-scannings data
-
Udfør automatisk koregistration blandt 8 eller 16 billeder taget fra 8 eller 16 forskellige vinkler i en sekvens af en scanning for at korrigere små uoverensstemmelser blandt dem ved at klikke på global registrering inkluderet i justeringsmuligheden og integrere dem. Gentag scanninger fra forskellige vinkler for at opnå hele hjerne overfladen (figur 2b).
- Hvis integrationen mellem billeder, der er scannet fra forskellige vinkler, ikke lykkedes, skal du klikke på Manuel justering og vælge et par af et fast billede og et levende billede.
- Klik på Start for at starte den manuelle justering af billederne ved at vælge tre eller fire almindeligt forekommende punkter i forskellige billeder. Klik derefter på OK. Optimerings algoritmen er den iterativ nærmeste spids (ICP) algoritme10. Det omfatter ikke en ikke-lineær deformation.
- Gør en maske af alle de justerede billeder (dvs., af prikker datasæt) ved at vælge alle billeder og ved at klikke på knappen mesh generation . Vælg derefter indstillingen lille kunstnerisk objekt for at få masken som den højeste opløsning. Gem derefter billedet som. STL Binary eller i ASCII-format.
11. koregistration af MRI-overfladen og 3D-scannings overfladen
-
Åbn MRI-overfladen, og Flet den med 3D-scannings overfladen ved hjælp af Surface Processing-softwaren. Udfør derefter en manuel justeringsproces ved hjælp af den samme fremgangsmåde som beskrevet i trin 10.1.1 og 10.1.2. Gem derefter disse koregistered Surface-billeder igen (figur 2a, b).
- Rengør om nødvendigt de enkelte overflade data, for eksempel ved at slette små lyde omkring hjerne området, især i tilfælde af MRI-data, og ved at udfylde huller, hvis der er nogen, især i tilfælde af 3D-scanningsdata.
- Endelig, åbne Surface data med en dataanalyse software, for eksempel MATLAB, og udføre og evaluere histogrammer af minimumsafstanden mellem de to overflader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi vurderede afstanden mellem de kortikale overflader, der produceres ved stripping MRI-volumen, og overflader opnået fra 3D-scanninger af ekstraherede hjerner. Tilstandsværdierne for histogrammet for afstandene er kun 55 μm (figur 3a). Når du akkumulerer histogrammet fra det punkt, hvor afstanden er lig med nul, når den akkumulerede værdi desuden 90% af det samlede antal prøve numre ved ~ 300 μm (figur 3b). Det sidste histogram af afstanden mellem to overflader viste en typisk top omkring 50 μm. Hvis vi fortolker denne værdi fra et makroskopisk synspunkt, er det interessant, at nøjagtigheden, tilstands værdien ~ 50 μm, svarer til den geometriske begrænsning, som blev forventet fra voxel-størrelsen af MRIs (figur 3a), nemlig 100 μm. Dette punkt antyder indirekte, at den overlappende algoritme, ICP, mellem MRI-og 3D-scanningen fungerede fremragende godt, og at støjniveauerne for både MRI og 3D-scanning blev undertrykt som lav værdi (figur 2a, b)14.
Figur 1: det eksperimentelle flow. (a) først, efter udvinding af en hjerne fra en mus, hjernen blev droppet i en bukkede skæring løsning. (b) efter aftørring af skære opløsningen med et blødt og stærkt absorberende håndklæde, (c) hjernen blev scannet på en pladespiller. (d) ved at lave skiver (trin 8 i processen) blev hjerne blokkene scannet på en BBB, fordi det er let at flytte hjerne blokke til basen for en vibratome (trin 7 og 8 i processen). (e) efter at have fået nok skiver til optagelse af elektriske aktiviteter eller til farvning af celle distributioner og andre metoder, blev de resterende hjerne blokke scannet igen (trin 10 i processen). Tykkelsen af de resterende hjerne blokke gav yderligere vigtige støtte oplysninger om, hvor skiverne blev taget fra. (f) Endelig registrerede vi funktionelle aktiviteter eller strukturelle arkitekturer ved hjælp af MEA-eller farvningsmetoder og andre metoder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: databehandling rørledning. a) et eksempel på en kortikal overflade fremstillet ved stripning af cortexes fra MRI-volumener som forklaret i protokollens afsnit 8 og 9. b) et eksempel på en kortikal overflade, der scannes direkte af et 3D-scanner system. c) et eksempel på et notat, der bruges til at opsummere hjerne området, hvorfra de enkelte hjerne skiver blev ekstraheret. d) et eksempel på, hvornår den kortikale skive er på en elektrode skål. (e) et eksempel på en farvet hjerne kortikal skive af Neun (rød) og GAD67 (grøn). Alle oplysninger vil nu blive samlet i en samlet database. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: overlappende nøjagtighed mellem MRIs og 3D-scanninger. a) histogrammer af afstande mellem overflader ekstraheret ved AFSKALNING af MRI-volumener. Overfladerne kom fra 3D-scannings optagelser. Den vigtigste søjlegraf er den gennemsnitlige histogram for alle individer, og andre farvede linjer er resultater for individuelle mus (N = 6, alderen 21 – 40 dage, alle var hunmus). En generel tendens, stabil for alle individer, kunne findes. b) den akkumulerede værdi af histogrammet vises som et søjlediagram. Den akkumulerede procentdel nåede 90% ved ~ 300 μm (punkterede linjer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: konceptualiseret billede af to skalaer af oplysninger integreret i en grafisk brugergrænseflade (GUI). Både den makroskopiske hjerne anatomi og de mikroskopiske neuronal kredsløb oplysninger blev integreret i et system repræsenteret ved et web. Den høje grad af nøjagtighed, vist i figur 3, gjorde det muligt for os at integrere disse to skalaer realistisk. Det makroskopiske billede præsenteret her er fra en skalerbar Brain Atlas15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Parametre | Værdier |
| Gentagelses tidspunkt (TR) | 2.000 MS |
| Ekko tid (TE) | 9 MS |
| Effektiv TE: | 45 MS |
| SJÆLDEN faktor | 16 |
| Størrelse på anskaffelses matrix | 196 x 144 x 144 |
| Synsfelt (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Erhvervelse båndbredde | 75 kHz |
| Orientering | Aksial (koronal retning i scanner indstilling) |
| Fedt undertrykkelse parammetre | |
| fedt frekvens | 2,6 MS-Gaussian-formet π/2 puls med 1051 Hz båndbredde |
| Spoiler gradient | |
| dummy scanninger | 2 gange |
| Antal gennemsnit | 3 |
| Anskaffelsestidspunkt | 2 t 42 min |
Tabel 1: anskaffelses parametrene for den 3D sjælden pulssekvens, der blev anvendt i dette studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet en ny protokol kaldet 3D-NEO-protokollen til at bygge bro mellem makroskopiske og mikroskopiske rumlige skalaer ved at overlappe to hjerne flader mere præcist end før. Oprindeligt var der to udfordringer i at skabe denne protokol, som gjorde det muligt at nøjagtig overlapning af to hjerne overflade billeder og optagelse af sunde neuronal aktiviteter fra levende organismer. For det første var det nødvendigt effektivt at tørre skære opløsningen omkring den ekstraherede hjerne efter ekstraktion fra kraniet uden at skade hjerne organismen (trin 6,2 i protokollen). For det andet, da den første og tredje betingelser for tørhed og tidsforsinkelse er potentielle negative faktorer for den levende organisme, efter behandling alle trinene i scanningen fra hjerne udvinding til skive præparater inden 10 – 15 min var også nødvendigt at holde neuronerne aktive.
Evnen til at registrere hjernens aktiviteter ved hjælp af denne protokol har nu gjort det muligt at koordinere ikke blot struktur organisationerne, men også de funktionelle aktiviteter på hele hjerne kortet. Et andet positivt aspekt af denne protokol er, at da en BBB blev forberedt, kalibrering fra scanneren til bunden af vibratome blev meget glattere.
Som nævnt i de repræsentative resultater, histogrammet af afstande mellem to overflader viste et højdepunkt på omkring 50 μm. Selv om vi udførte den overlappende proces, som om ved at se fra det makroskopiske synspunkt. Hvis vi fortolker resultatet fra mikroskopisk synspunkt, er 50 μm en sammenlignelig rumlig skala i fordelingen af neuroner, da tilslutnings sandsynligheder mellem par af kortikale neuroner henfald inden ~ 100 μm16,17, selv inden for flere millimeter18. Praktisk, MEA eller calcium Imaging undersøgelser ofte bruge 300 – 400 μm tykke skiver. Så den teknik, der præsenteres her, vil give stærke objektive beviser, hvis skiver er korrekt indlejret i oprindelige hele hjernen kort. Efter overlapning opnås nøjagtigt, vil yderligere nøjagtighed opnås udelukkende fra de lokale oplysninger observeret under et mikroskop. Derfor, ved at udføre en to-trins optimeringsproces bestående af globale og lokale optimering trin, vil det være muligt at nå en rumlig opløsning sidestille halvautomatisk til den typiske størrelse af en neuron i fremtiden.
Denne præcise integrations protokol giver grundlæggende teknologi til at generere forskellige hjerne atlaser18,20,21 og endda til at studere mere dybdegående MRI af andre primater22,23 og Human post mortem hjerner (selvom den menneskelige hjerne har sulci, er det muligt at få et tilstrækkeligt antal optagelses punkter fra Gyri). Nu er vi også ved at udvikle en visuel grænseflade til at integrere mange indspillede dataprøver i en fælles rumlig koordinat. Et billed tal som dette er vist i figur 4. I tilfælde af pattedyrs hjerner vil integrationen mellem kvantitativt forskellige skalaer også gøre nye fremskridt kvalitativt i forståelsen af sygdomstilstande og i vurderingen af narkotika virkningerne. Generelt vil dette være svært at anvende til fisk, krybdyr, og padder, fordi forskerne vil finde det vanskeligt at holde formen af den ekstraherede tynde hjerne stabilt til sin præ-ekstraherede form, og Mr-billeder af deres mindre hjerner vil også være relativt støjende.
Den 3D-NEO protokol er blevet introduceret af denne forskning i en neurovidenskabelig eller celle biologisk forskning område, med succes demonstrere høj nøjagtighed i Brobygning mellem makroskopisk anatomi og mikroskopisk neuronal fordeling, herunder topologiske arkitekturer af makro-og microconnectomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
M.S. er taknemmelig for støtte fra alle de ansatte i medicinsk information Engineering kursus i Graduate School of Medicine og Faculty of Medicine, og ønsker at takke Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, og Doris Zakian for deres hjælpsomme Kommentarer. Denne undersøgelse blev støttet af en støtte til udfordrende sonderende forskning og af det førende initiativ for fremragende unge forskere (LEADER) program til at M.S. fra MEXT (Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi). MRI eksperimenter i dette arbejde blev udført i divisionen for små dyr MRI, medicinsk forskning støtte Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
