Summary

3D-scanning teknik överbrygga mikrokretsar och Macroscale hjärn bilder i 3D roman bädda överlappande protokoll

Published: May 12, 2019
doi:

Summary

Denna artikel introducerar ett experimentellt protokoll med 3D-scanning teknik överbrygga två rumsliga skalor: den makroskopiska rumsliga skalan av hela hjärnans anatomi avbildas av MRT vid > 100 μm och den mikroskopiska rumsliga skalan av neuronala distributioner med hjälp av immunohistokemi färgning och en multielektrod array system och andra metoder (~ 10 μm).

Abstract

Den mänskliga hjärnan, som är ett flerskalig system, har både makroskopiska elektriska signaler, globalt flyter längs tjocka vita partiklar fiber buntar, och mikroskopiska neuronala spikar, förökningsmaterial längs axoner och dendriter. Båda skalorna kompletterar olika aspekter av människans kognitiva och beteendemässiga funktioner. Vid makroskopisk nivå har MRI varit den nuvarande standarden Imaging Technology, där den minsta rumsliga upplösningen, Voxel storlek, är 0,1-1 mm3. Även på mikroskopisk nivå, tidigare fysiologiska studier var medvetna om icke-enhetliga neuronala arkitekturer inom sådana voxels. Denna studie utvecklar ett kraftfullt sätt att korrekt bädda in mikroskopiska data i en makroskopisk karta genom att gränssnitt biologisk vetenskaplig forskning med tekniska framsteg i 3D-scanning teknik. Eftersom 3D-scanning teknik har mestadels använts för ingenjörskonst och industridesign fram till nu, det är återanvänt för första gången att bädda in microconnectomes i hela hjärnan och samtidigt bevara naturliga tillspikning i levande hjärnceller. För att uppnå detta syfte, först, konstruerade vi ett skannings protokoll för att få exakt 3D-bilder från levande bio-organismer till sin natur utmanande att bilden på grund av fuktiga och reflekterande ytor. För det andra, vi utbildade för att hålla hastigheten för att förhindra nedbrytning av levande hjärnvävnad, vilket är en nyckelfaktor för att behålla bättre villkor och registrera mer naturliga neuronala spikar från aktiva nervceller i hjärnvävnaden. Två kortikala yta bilder, oberoende ur två olika Imaging moduler, nämligen MRI och 3D-skanner yta bilder, överraskande Visa ett avstånds fel på endast 50 μm som läge värdet av histogrammet. Denna noggrannhet är jämförbar i skala till den mikroskopiska upplösningen av intercellulära avstånd; Dessutom är det stabilt bland olika enskilda möss. Detta nya protokoll, 3D-romanen bädda överlappande (3D-NEO) protokoll, broar makroskopiska och mikroskopisk nivåer som härrör från detta integrerande protokoll och påskyndar nya vetenskapliga rön att studera omfattande anslutning arkitekturer (dvs. mikroconnectome).

Introduction

Icke-enhetliga flerskaliga arkitekturer på olika fysiska och biologiska organisationer finns vanligtvis1,2. Hjärnan är också en mycket NonUniform och Multiscale knyter kontakt organisation3,4. Olika kognitiva funktioner kodas i sådana nätverk organisationer, hålla temporala förändringar av elektriska Spike mönster av neuronala populationer i submillisekund temporala resolutioner. Historiskt sett, de komplexa nätverken bland nervceller var strukturellt observerats i detalj med hjälp av färgning tekniker av Santiago Ramón y Cajal från över 150 år sedan5. För att observera grupp beteenden av aktiva nervceller, forskare har utvecklat olika inspelningsteknik6,7,8, och den senaste tidens betydande utvecklingen av sådan teknik har gjort det möjligt för oss att spela in elektriska aktiviteter från ett enormt antal nervceller samtidigt. Dessutom, från sådan funktionell verksamhet, har forskarna lyckats rekonstruera nätverk av kausala interaktioner mellan ett stort antal nervceller och har förklarat den topologiska arkitekturen i deras komplexa interaktioner “microconnectome”9 . Makroskopiska observationer av hjärnan också möjliggöra om en hel hjärna som en nätverksorganisation eftersom många hjärnregioner är anslutna med flera fiber-buntar. Inbäddning av microconnectomes i den globala hjärn kartan har fortfarande tydliga begränsningar inom nuvarande teknologiska framsteg, varför detta inbäddnings protokoll är så viktigt. Det finns dock många utmaningar för utvecklingen av inbäddnings protokollet. Till exempel för att observera aktiviteter av levande lokala neuronala kretsar i rent isolerade hjärnregioner, hjärn skivor måste produceras för in vitro-inspelningar. Dessutom är inspelningar från hjärn skivor för in vitro-inspelningar fortfarande ett viktigt val av minst två anledningar. För det första är det fortfarande inte lätt att observera aktiviteter för många levande enskilda nervceller samtidigt från hjärnregioner djupare än ~ 1,5 mm och i hög temporala upplösning (< 1 MS). För det andra, när vi hoppas att veta den interna arkitekturen i en lokal neuronala krets, måste vi stoppa alla ingångar som kommer från externa hjärnregioner för att eliminera confounding faktorer. För att identifiera riktningar och positioner av producerade hjärn skivor, kommer det att vara ytterligare nödvändigt att integrera de rumsliga positionerna för dessa producerade hjärn skivor med hjälp av koordinater. Det finns dock några systematiska och pålitliga sätt att göra hjärn skivor på ett organiserat sätt10,11. Här introduceras ett nytt coregistration Protocol, med hjälp av 3D-scanning teknik för neurovetenskaplig forskning för att ge ett integrativt protokoll. Detta protokoll fungerar för att samordna mikro-och macroscales och bädda in multielektrod array (MEA) mikrodata12,13 och färgning data på ett makroskopiskt MRI utrymme genom 3D Scan ytor av extraherade hjärnor, samt av noninvasivt inspelade hjärnor. Överraskande, detta visade ett avstånds fel på endast ~ 50 μm som läge värdet av histogrammet. Det innebär att läges värden för minsta avstånd mellan två ytor mellan MRI-ytan och den skannade 3D-ytan var nästan 50 μm för alla sex möss, vilket är ett lämpligt antal vid kontroll av gemensamhet bland individer. Den typiska segment bredden hade en inspelad spik aktivitet på cirka 300 μm.

Protocol

Alla experimentella procedurer som beskrivs här har godkänts av Kyoto-universitetets djur vårds kommitté. 1. djur (dag 1) Förbered kvinnliga C57BL/6J möss (n = 6, åldrad 3 − 5 veckor).Anmärkning: Detta protokoll är tillämpligt på alla gnagare arter. 2. MRI-inställningar (dag 1) Placera musen i en akryl anestesi låda placerad på en värmare matta justerad till 37 ° c med en värmare matta Contro…

Representative Results

Vi utvärderade avstånd mellan kortikala ytor, producerad av strippning MRI volym, och ytor som erhållits från 3D-skanningar av extraherade hjärnor. Funktionsläget värderar av histogrammet av distanserar är endast 55 μm (figurera 3a). Dessutom, när du ackumulerar histogrammet från den punkt där avståndet är lika med noll, uppnår det ackumulerade värdet 90% av de totala prov numren på ~ 300 μm (figur 3b). Final hi…

Discussion

Vi utvecklade ett nytt protokoll som kallas 3D-NEO-protokollet för att överbrygga makroskopiska och mikroskopisk rumsliga skalor genom att överlappa två hjärn ytor mer exakt än tidigare. Ursprungligen fanns det två utmaningar i att skapa detta protokoll som gjorde det möjligt att exakt överlappning av två hjärnan yta bilder och inspelning friska neuronala aktiviteter från levande organismer. Först var det nödvändigt att effektivt torka skär lösning som omger den extraherade hjärnan efter extrahering av …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MS är tacksam för stöd från alla anställda i medicinsk information Engineering kurs i forskarskolan för medicin och medicinska fakulteten, och vill tacka prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, och Doris Zakian för deras hjälpsamma Kommentarer. Denna studie stöddes av ett bidrag-in-Aid för utmanande undersökande forskning och av det ledande initiativet för utmärkt unga forskare (LEADER) program till MS från MEXT (ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik). MRI-experimenten i detta arbete utfördes i avdelningen för små djur MRI, Medical Research Support Center, forskarskolan i medicin, Kyoto University, Japan.

Materials

Air compressor Kimura Medical KA-100 Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscope KEYENCE BZ-X710
Anesthesia box Bio Research Center RIC-01 Animal preparation for MRI
Anesthesia system ACOMA Medical Industry NS-5000A Animal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2 Merk Millipore MAB5406 For immunostaining
Calcium Chrolide nacalai tesque 06729-55 aCSF
Choline Chloride nacalai tesque 08809-45 aCSF
curved blunt forceps
Disposal scalpel Kai 10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) nacalai tesque For immunostaining
D(+)-Glucose Wako 049-31165 aCSF
Gelatin nacalai tesque 16605-42 re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32723 For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Invitrogen A32732 For immunostaining
Heater mat Bio Research Center HM-10 Animal preparation for MRI
Heater mat controller Bio Research Center BWT-100A Animal preparation for MRI
Heater system SA Instruments MR-compatible Small Animal Heating System Animal preparation for MRI
Isoflurane AbbVie Animal preparation for MRI
Isoflurane vaporizer ACOMA Medical Industry MKIIIai Animal preparation for MRI
Linear Slicer DOSAKA Neo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Wako 196-01252 aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate Wako 135-00165 aCSF
MaxOne Single-Well MEA MaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring system SA Instruments Model 1025 Animal preparation for MRI
Monitoring software SA Instruments PC-SAM V.5.12 Animal preparation for MRI
MRI compatible cradle Bruker BioSpin T12812 Animal preparation for MRI
MRI coil Bruker BioSpin T9988 For MRI
MRI operation software Bruker BioSpin ParaVision 5.1 For MRI
Neo LinearSlicer MT D.S.K. NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb Cell Signaling 24307 For immunostaining
Normal Goat Serum Wako 143-06561 For immunostaining
Potassium Chloride Wako 163-03545 aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether nacalai tesque 12967-45 For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensor SA Instruments RS-301 Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scanner Bruker BioSpin BioSpec 70/20 USR For MRI
Pyruvic Acid Sodium Salt nacalai tesque 29806-54 aCSF
SCAN in a BOX Open Technologies srl
scissors
Sieve bottle TIGERCROWN 81 For 3D scan
SlowFade Gold Antifade Mountant Invitrogen S36937 For immunostaining
Sodium Chloride Wako 191-01665 aCSF
Sodium Dihydrogenphosphate Wako 197-09705 aCSF
Sodium Hydrogen Carbonate Wako 191-01305 aCSF
Sodium Hydrogensulfite nacalai tesque 31220-15 For immunostaining
Thermistor temperature probe SA Instruments RTP-101-B, PLTPC-300 Animal preparation for MRI
Tooth bar Bruker BioSpin T10146 Animal preparation for MRI
Winged intravenous needle TERUMO SV-23CLK For perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution nacalai tesque 35436-01 For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acid nacalai tesque 37314-15 For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 For immunostaining

References

  1. Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
  2. Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
  3. Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
  4. Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
  5. DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
  6. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
  7. Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
  10. Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
  11. Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
  12. Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
  13. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
  14. Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
  15. Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
  16. Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
  17. Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
  18. Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
  19. Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
  20. Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
  21. Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
  22. Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
  23. Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).

Play Video

Cite This Article
Ide, S., Kajiwara, M., Imai, H., Shimono, M. 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol. J. Vis. Exp. (147), e58911, doi:10.3791/58911 (2019).

View Video