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Neuroscience

3 डी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी ब्रिजिंग माइक्रोसर्किट और Macroscale मस्तिष्क छवियाँ 3 डी उपन्यास एम्बेडिंग ओवरलैपिंग प्रोटोकॉल में

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58911
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, Kyoto University, 2Graduate School of Informatics, Kyoto University

Summary

यह लेख 3 डी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का परिचय दो स्थानिक तराजू ब्रिजिंग: पूरे मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान के स्थूल स्थानिक पैमाने पर एमआरआई द्वारा छवि और gt;100 $m और न्यूरोनल वितरण के सूक्ष्म स्थानिक पैमाने का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला और एक multielectrode सरणी प्रणाली और अन्य तरीकों ($ 10 डिग्री सेल्सियस)।

Abstract

मानव मस्तिष्क, एक multiscale प्रणाली जा रहा है, दोनों स्थूल विद्युत संकेत है, विश्व स्तर पर मोटी सफेद पदार्थ फाइबर बंडलों के साथ बह, और सूक्ष्म न्यूरॉन spikes, axons और dendrites साथ प्रचार. दोनों तराजू मानव संज्ञानात्मक और व्यवहार कार्यों के विभिन्न पहलुओं के पूरक हैं. स्थूल स्तर पर, एमआरआई वर्तमान मानक इमेजिंग प्रौद्योगिकी है, जिसमें सबसे छोटा स्थानिक संकल्प, voxel आकार, 0.1-1 मिमी3है. इसके अलावा, सूक्ष्म स्तर पर, पिछले शारीरिक अध्ययन ऐसे voxels के भीतर nonuniform न्यूरॉन आर्किटेक्चर के बारे में पता थे. यह अध्ययन 3 डी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी में तकनीकी प्रगति के साथ जैविक वैज्ञानिक अनुसंधान interfacing द्वारा एक स्थूल नक्शे में सूक्ष्म डेटा सही एम्बेड करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका विकसित करता है। 3 डी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी ज्यादातर अब तक इंजीनियरिंग और औद्योगिक डिजाइन के लिए इस्तेमाल किया गया है के बाद से, यह मस्तिष्क की कोशिकाओं में प्राकृतिक spiking संरक्षण करते हुए पूरे मस्तिष्क में microconnectomes एम्बेड करने के लिए पहली बार के लिए repurposed है. इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए, पहले, हमने नम और चिंतनशील सतहों के कारण छवि को स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण जीवों से सटीक 3 डी छवियों को प्राप्त करने के लिए एक स्कैनिंग प्रोटोकॉल का निर्माण किया। दूसरा, हम मस्तिष्क के ऊतकों में रहने वाले गिरावट को रोकने के लिए गति रखने के लिए प्रशिक्षित किया, जो बेहतर स्थितियों को बनाए रखने और मस्तिष्क के ऊतकों में सक्रिय न्यूरॉन spikes से अधिक प्राकृतिक न्यूरॉन spikes रिकॉर्डिंग में एक महत्वपूर्ण कारक है. दो cortical सतह छवियों, स्वतंत्र रूप से दो अलग इमेजिंग मॉड्यूल, अर्थात् एमआरआई और 3 डी स्कैनर सतह छवियों से निकाले, आश्चर्यजनक रूप से हिस्टोग्राम के मोड मूल्य के रूप में केवल 50 डिग्री मीटर की दूरी त्रुटि दिखा. इस सटीकता अंतरकोशिकीय दूरी के सूक्ष्म संकल्प के पैमाने में तुलनीय है; भी, यह विभिन्न व्यक्तिगत चूहों के बीच स्थिर है. इस नए प्रोटोकॉल, 3 डी उपन्यास embedding ओवरलैपिंग (3 डी-NEO) प्रोटोकॉल, पुल स्थूल और सूक्ष्म इस एकीकृत प्रोटोकॉल द्वारा व्युत्पन्न स्तर और व्यापक कनेक्टिविटी आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए नए वैज्ञानिक निष्कर्षों accelerates (यानी, माइक्रोकनेक्टोम)।

Introduction

विभिन्न भौतिक और जैविक संगठनों में असमान बहुमान वास्तु संरचना आमतौर पर1,2पाई जाती है . मस्तिष्क भी एक बहुत ही गैर वर्दी और बहुमान नेटवर्क संगठन3,4है . विभिन्न संज्ञानात्मक कार्यों ऐसे नेटवर्क संगठनों में कोडित कर रहे हैं, submillisecond अस्थायी संकल्प में न्यूरॉन आबादी के विद्युत कील पैटर्न के अस्थायी परिवर्तन पकड़े. ऐतिहासिक रूप से, न्यूरॉन्स के बीच जटिल नेटवर्क संरचनात्मक रूप से 150 साल पहले से सैंटियागो रामन वाई काजल द्वारा धुंधला तकनीक का उपयोग कर विस्तार से मनाया गया5. सक्रिय न्यूरॉन्स के समूह व्यवहार का निरीक्षण करनेके लिए, शोधकर्ताओं ने विभिन्न रिकॉर्डिंग प्रौद्योगिकियों 6 ,7,8विकसित किया है और इस तरह की प्रौद्योगिकियों के हाल के महत्वपूर्ण घटनाओं हमें रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम किया गया है न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या से एक साथ बिजली की गतिविधियों. इसके अलावा, इस तरह के कार्यात्मक गतिविधियों से, वैज्ञानिकों को न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या के बीच कारण बातचीत के नेटवर्क के पुनर्निर्माण में सफल रहा है और उनके जटिल बातचीत 'microconnectome' 9 के topological वास्तुकला की घोषणा की है . मस्तिष्क के Macroscopic टिप्पणियों भी एक नेटवर्क संगठन के रूप में एक पूरे मस्तिष्क के बारे में के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि कई मस्तिष्क क्षेत्रों कई फाइबर-बंडलों से जुड़े हुए हैं. वैश्विक मस्तिष्क के नक्शे में microconnectomes के embedding अभी भी वर्तमान तकनीकी प्रगति के भीतर स्पष्ट सीमाएं हैं, यही वजह है कि इस embedding प्रोटोकॉल इतना महत्वपूर्ण है. हालांकि, embedding प्रोटोकॉल के विकास के लिए कई चुनौतियां हैं। उदाहरण के लिए, विशुद्ध रूप से अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में रहने वाले स्थानीय न्यूरॉन सर्किट की गतिविधियों का निरीक्षण करने के लिए, मस्तिष्क स्लाइस इन इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए उत्पादन किया जा करने के लिए की जरूरत है। इसके अतिरिक्त, इन विट्रो रिकॉर्डिंग के लिए मस्तिष्क स्लाइस से रिकॉर्डिंग अभी भी कम से कम दो कारणों के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प हैं. सबसे पहले, यह अभी भी कई जीवित व्यक्ति न्यूरॉन्स की गतिविधियों का निरीक्षण करने के लिए आसान नहीं है एक साथ मस्तिष्क क्षेत्रों से गहरा से $ 1.5 मिमी और उच्च लौकिक संकल्प में ([lt;1 एमएस). दूसरा, जब हम एक स्थानीय न्यूरॉन सर्किट की आंतरिक वास्तुकला पता करने की उम्मीद है, हम सभी जानकारी बाहरी मस्तिष्क क्षेत्रों से आने को रोकने के लिए confounding कारकों को खत्म करने की जरूरत है. आदेश में निर्देशऔर उत्पादित मस्तिष्क स्लाइस की स्थिति की पहचान करने के लिए, यह निर्देशांक का उपयोग कर इन उत्पादित मस्तिष्क स्लाइस के स्थानिक पदों को एकीकृत करने के लिए आगे आवश्यक हो जाएगा. तथापि, मस्तिष्क स्लाइस को संगठित तरीके से बनाने केकुछ व्यवस्थित और विश्वसनीय तरीके हैं . यहाँ, एक नया coregistration प्रोटोकॉल शुरू की है, neuroवैज्ञानिक अनुसंधान के लिए 3 डी स्कैनिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल सूक्ष्म और मैक्रोस्केल और एम्बेड multielectrode सरणी (एमईए) microdata12,13 और निकाले गए दिमाग के 3 डी स्कैन सतहों के माध्यम से एक स्थूल एमआरआई अंतरिक्ष पर धुंधला डेटा समन्वय करने के लिए कार्य करता है, के रूप में अच्छी तरह से noninvasively दर्ज दिमाग. हैरानी की बात है, यह हिस्टोग्राम के मोड मूल्य के रूप में केवल $ 50 डिग्री मीटर की दूरी त्रुटि से पता चला. एक परिणाम के रूप में, एमआरआई सतह और स्कैन 3 डी सतह के बीच दो सतहों के बीच न्यूनतम दूरी के मोड मूल्यों सभी छह चूहों के लिए लगभग 50 डिग्री थे, जो एक उपयुक्त संख्या है जब व्यक्तियों के बीच समानता के लिए जाँच. ठेठ टुकड़ा चौड़ाई के आसपास 300 डिग्री की एक दर्ज कील गतिविधि थी.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं क्योटो विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. पशु (दिन 1)

  1. महिला C57BL/6J चूहों तैयार(n ] 6, आयु वर्ग 3 "5 सप्ताह).
    नोट: यह प्रोटोकॉल सभी कृंतक प्रजातियों पर लागू होता है।

2. एमआरआई सेटिंग्स (दिन 1)

  1. एक एक्रिलिक संज्ञाहरण बॉक्स में माउस रखो एक हीटर चटाई पर रखा 37 डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित एक हीटर चटाई नियंत्रक का उपयोग कर.
  2. एक संज्ञाहरण प्रणाली है, जो एक आइसोलुरेन vaporizer, हवा प्रवाह मीटर, और हवा कंप्रेसर से बना है का उपयोग कर 1.4 एल/मिनट की एक प्रवाह दर पर बॉक्स के माध्यम से बह हवा में 2% आइसोलुरेन के साथ माउस Anesthetize।
  3. संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद, प्रवण स्थिति में एमआरआई-संगत पालने में माउस रखें। जांच करें कि संज्ञाहरण चिमटी के साथ माउस के एक अंगुली कतरन द्वारा पर्याप्त है अगर यह दर्द महसूस नहीं करता है देखने के लिए.
  4. पालने से सुसज्जित टूथ बार और फेस मास्क के साथ माउस के सिर को ठीक करें। फिर, चेहरे मुखौटा के माध्यम से 1.4 L/min पर हवा में 1% $1.5% isoflurane के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
  5. माउस के मलाशय में एक थर्सेटर तापमान जांच डालें और माउस के पीछे एक दबाव के प्रति संवेदनशील श्वसन सेंसर रखें।
  6. एक एमआरआई चुंबक के बोर करने के लिए पालना स्थानांतरण। संज्ञाहरण के एक स्थिर और पुन: उत्पादनीय गहराई को सुनिश्चित करने के लिए लगभग 1% $1.5% के लिए आइसोफ्लुरेन एकाग्रता समायोजित करें। मॉनिटर अगर शरीर के तापमान के बीच नियंत्रित किया जाता है 33 डिग्री 35 डिग्री सेल्सियस और एमआरआई प्रयोगों की पूरी अवधि के दौरान 0.5 डिग्री 1.3 हर्ट्ज के बीच श्वसन दर, एक निगरानी प्रणाली का उपयोग कर (सामग्री की तालिका) के साथ छोटे जानवरों के शारीरिक मापदंडों के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका)।
  7. गुदा तापमान के मापा मूल्य का उपयोग करना, निगरानी प्रणाली में सुसज्जित एक हीटर प्रणाली से चुंबक बोर में आपूर्ति गर्म हवा के तापमान को नियंत्रित करके शरीर के तापमान को विनियमित।

3. एमआरआई अधिग्रहण (दिन 1)

  1. उच्च संकल्प 3 डी T2 भारित एमआरआई स्कैन के लिए तैयारी
    1. माउस की स्थिति की जांच करने के लिए तीन ऑर्थोगोनल (अक्षीय, कोरोनल, और सैगिटल) विमानों में तीन चुंबकीय अनुनाद (एमआर) छवियों का अधिग्रहण करें।
    2. इन छवियों का उल्लेख करते हुए, पालना को ले जाकर माउस की स्थिति को समायोजित करें ताकि माउस मस्तिष्क का केंद्र अनुनादक के केंद्र के साथ-साथ अक्षीय दिशा में ढाल कुंडली के केंद्र में स्थित हो।
    3. अनुनादक ट्यूनिंग द्वारा एमआरआई प्रणाली समायोजित, स्थिर चुंबकीय क्षेत्र एकरूपता (shimming) और बुनियादी आवृत्ति का समायोजन, और रेडियो आवृत्ति (आरएफ) शक्ति कैलिब्रेट.
    4. कम संकल्प 2 डी multislice T2-भारित (T2W) कोरोनल और sagittal अभिविन्यास के साथ छवियों का अधिग्रहण. इन छवियों के आधार पर, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3D T2W एमआरआई स्कैन के लिए दृश्य (FOV) के क्षेत्र का निर्धारण।
    5. एक FASTMAP स्वत: शिम एल्गोरिथ्म का उपयोग कर स्थानीयकृत shimming प्रदर्शन करते हैं। FASTMAP प्रोटोकॉल के लिए, एक आयताकार क्षेत्र है कि पूरे मस्तिष्क को शामिल किया गया का चयन करें. स्थानीयकृत shimming के पूरा होने के बाद, बिंदु हल स्पेक्ट्रोस्कोपी (पीएसईएस) का उपयोग करके एक स्थानीयकृत 1एच स्पेक्ट्रम द्वारा मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर बी0 क्षेत्र असह्यता की पुष्टि करें।
    6. उच्च संकल्प 3 डी T2W एमआरआई के लिए स्कैन सेटिंग्स FOV की उचित स्थिति की जाँच करके उपयुक्त हैं सुनिश्चित करने के लिए कम संकल्प 3 डी T2W छवियों का अधिग्रहण, wraparound की अनुपस्थिति (aliasing) कलाकृतियों, और वसा संकेतों के कुशल दमन.
  2. इमेजिंग स्पंद अनुक्रम
    1. ऊपर वर्णित तैयारी के बाद, उच्च संकल्प 3 डी T2W माउस के पूरे मस्तिष्क की छवियों को प्राप्त, विश्राम वृद्धि (रे) अनुक्रम के साथ एक तेजी से अधिग्रहण का उपयोग कर.
      नोट: इस अनुच्छेद में, एमआरआई प्रयोग एक 7 टी, 210 मिमी क्षैतिज बोर, पूर्व नैदानिक स्कैनर पर किए गए थे, जो रैंप समय 100 डिग्री पर 440 एमटी/मी की ढाल प्रणाली से सुसज्जित थे। 35 मिमी के एक आंतरिक व्यास के साथ एक चौथाई मात्रा अनुनादक आरएफ उत्तेजना और संकेत स्वागत के लिए इस्तेमाल किया गया था. एमआरआई डेटा एक समर्पित आपरेशन सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त किए गए थे. इस अध्ययन में प्रयुक्त 3डी दुर्लभ स्पंद अनुक्रम के अधिग्रहण पैरामीटरों को सारणी 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

4. प्रायोगिक समाधान की तैयारी (दिन 2)

  1. एक बर्फ ठंडा काटने समाधान के 500 एमएल तैयार (2.5 एम एम केसीएल, 1.25 एम एम एन एच2पीओ4, 7 एमएम एमजीसीएल2, 15 एमएम ग्लूकोज, 25 एमएम NaHCO3, 0.5 एमएम CaCl2, 11.6 एमएम सोडियम एसोर्ट, 3.1 एमएम सोडियम पाइरेवएट, और 100 एम एम बबली, क्लोरलीन, क्लोरलीन, 95% हे2 और 5% सीओ2के साथ ) . पीएच को 7.3 डिग्री 7.4 पर समायोजित करें।
  2. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव के 1 एल तैयार (ACSF; 127 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 MM MgCl2, 15 mM ग्लूकोज, 25 mM NaHCO3, और 2 mM CaCl2, 95% O2 और 5% सीओ2के साथ bubbled . पीएच को 7-3-7.4 तक समायोजित करें।

5. उपकरण की तैयारी (दिन 2)

  1. एक 6.6 सेमी2 वर्ग, 0.5 सेमी मोटी चुंबक "अंगूठी" तैयार करें और, पहला, काला टेप रखें और दूसरा, अंगूठी पर सर्जिकल टेप (चित्र 1ब्-2)। ध्यान दें कि इस सामग्री को एक मस्तिष्क ब्लॉक आधार (BBB) नाम दिया गया है, और यह बर्फ के ब्लॉक पर ठंडा रखना.
    नोट: बाद में, टेप vibratome के लिए मस्तिष्क ब्लॉक के साथ टुकड़ा करने स्टेशन से जुड़ा होगा. वर्ग अंगूठी BBB के नीचे आधार के रूप में प्रयोग किया जाता है दो उद्देश्यों को संतुष्ट करने के लिए, अर्थात् एक vibratome करने के लिए 3 डी स्कैन स्टेशन से आसानी से मस्तिष्क ब्लॉक स्थानांतरित करने के लिए और सही स्कैनिंग चरण में मस्तिष्क ब्लॉक की ऊंचाइयों को मापने के लिए.
  2. एक स्वचालित turntable के साथ BBB सेट करें. स्कैनर और turntable चालू करें। छवि संसाधन सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
  3. सभी प्रयोगों से पहले, कैमरों के अंशांकन और एक संरचित प्रकाश प्रक्षेपण और डेस्कटॉप प्रकार 3 डी स्कैनर के जुड़े turntable प्रदर्शन करते हैं.
    1. केंद्र प्रोजेक्टर, दो कैमरे, और turntable चालू करें. उसके बाद, सॉफ़्टवेयर खोलें। सॉफ़्टवेयर में, ऑप्टिकल सेटअप क्लिक करें और 100 x 80 के रूप में छवि क्षेत्र और 100 x 100 के रूप में ग्रिड संख्या का चयन करें। उसके बाद, कैमरा अंशांकन निम्न चार चरणों के अनुसार प्रारंभ होता है।
      1. प्रोजेक्टर सेटअप के लिए, डेस्क पर अंशांकन शीट रखना और अंशांकन बोर्ड को मापने के क्षेत्र के फिक्सिंग बिंदु को शीट के केंद्र और सामने के लिए अभिविन्यास समायोजित करने के लिए पर लिब्रेशन बोर्ड रखें। लगभग 200 मिमी के लिए प्रोजेक्टर और बोर्ड के बीच की दूरी को समायोजित करें, दो knobs फिक्सिंग शिकंजा ढीला, और प्रकाश संवेदनशीलता और दो कैमरों के ध्यान को समायोजित करने के लिए knobs बारी बारी से. उसके बाद, अगले चरण पर जाने के लिए तीर क्लिक करें.
      2. कैमरों उन्मुख करने के लिए, शिकंजा दो कैमरों खुद फिक्सिंग ढीला और पदों और rotations अंशांकन बोर्ड पर केंद्र लाइन के साथ ओवरलैप करने के लिए कदम, ऊर्ध्वाधर रेखा, और पीले पार प्रोजेक्टर से पेश किया. कैमरों को ठीक करें, और तीर फिर से क्लिक करें। फिर, स्क्रीन अंधेरा हो जाएगा।
      3. कैमरों ध्यान केंद्रित करने के लिए, knobs के फिक्सिंग शिकंजा ढीला करने के बाद, प्रकाश संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए और फिर ध्यान धुन. उसके बाद, अगले चरण पर जाने के लिए तीर क्लिक करें.
      4. एफ मूल्य और जोखिम की डिग्री के लिए (कैमरा के), प्रकाश संवेदनशीलता को फिर से समायोजित करने के लिए बस नीचे जहां लाल क्षेत्र गायब हो जाता है. उसके बाद, फिर तीर क्लिक करें, और कैलिब्रेशन प्रारंभक्लिक करें, और यदि आपसे ऑप्टिकल सेटिंग समाप्त करने के लिए पूछा जाए तो हाँ चुनें?
    2. अंशांकन प्रारंभकरें क्लिक करें, और जाँचें कि पिक्सेल मान 0-255 के बीच सामान्यीकृत हैं या नहीं. उसके बाद, जारी रखेंक्लिक करें.
    3. सुझाए गए स्थानों का अनुसरण करके, स्कैनर और अंशांकन बोर्ड के नौ अलग-अलग सापेक्ष कोणों की छवियों को रिकॉर्ड करें, और अंशांकन प्रक्रिया की पुष्टि करने के बाद समाप्त करें, और, अंत में, अंशांकन का अद्यतनक्लिक करें।
    4. turntable के लिए अंशांकन बोर्ड का आदान-प्रदान करें, और Turntable अंशांकनक्लिक करें।
      नोट: अब, सभी अंशांकन समाप्त हो गए हैं।

6. मस्तिष्क सतह स्कैन, टुकड़ा, और MEA रिकॉर्डिंग (दिन 2)

  1. 1% 1.5% isoflurane के साथ एक माउस anesthetize और माउस decapitate. त्वचा को खोलने और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
  2. एक शल्य चाकू का उपयोग कर sagittal सीवन के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस की खोपड़ी कट, और लैम्ब्डा बिंदु से विकर्ण दिशाओं में खोपड़ी में कटौती एक बिंदु के सामने एक छोटे से brigma शल्य कैंची का उपयोग कर. फिर, धीरे घुमावदार चम्मितता का उपयोग कर मस्तिष्क से खोपड़ी छील.
  3. मस्तिष्क लिफ्ट और बर्फ ठंडा काटने समाधान (चरण 4.1 में तैयार) के साथ एक पेट्री डिश (100 मिमी x 20 मिमी) के लिए इसे स्थानांतरित करने के लिए एक spatula का प्रयोग करें। एक बाहरी गैस बम से 95% व्2 और 5% ब्व्2 वाले प्रवाह वायु, पंप की नियंत्रित घूर्णन गति के साथ ($4.0 आरपीएम) बर्फ-ठंडा काटने के समाधान में छोटे बुलबुले उत्पन्न करने के लिए (चित्र 1क)।
  4. 1-2 मिनट के बाद, मस्तिष्क को माइक्रोफाइबर कपड़े पर रखें जिसकी सतह आटे की छलनी से थोड़ी ढकी हुई है, और मस्तिष्क की सतह से तरल पदार्थ पोंछें, धीरे से माइक्रोफाइबर कपड़े का उपयोग कर (चित्र 1ख)।
  5. BBB पर नमूना स्टैंड पर अपने पृष्ठीय पहलू के साथ मस्तिष्क रखो, और भी स्वत: turntable के केंद्र में BBB डाल दिया.
  6. 3 डी स्कैन के दौरान कमरे को गहरा करें और turntable पर एक 3 डी स्कैन प्रदर्शन करते हैं। यह परीक्षण करने के लिए कि 3D स्कैन अच्छी तरह से कार्य करता है या नहीं, दो शॉट्स के बीच के कोण को 22.5 के रूप में, प्रारंभिक कोण 0 के रूप में और अंतिम कोण 360 के रूप में (चित्र 1c-1) का चयन करके 3D स्कैन क्लिक करें.
  7. एक पेट्री डिश के लिए मस्तिष्क ले जाएँ, और लगभग 10 एस के लिए काटने के समाधान में मस्तिष्क बुलबुला.
  8. एक शल्य चाकू का उपयोग कर कोरोनल विमान के बीच में दो ब्लॉकों में मस्तिष्क कट, और एक शल्य स्पेचूला का उपयोग कर फ्लैट सतह के लिए धीरे से दो मस्तिष्क ब्लॉक ले जाएँ।
  9. तत्काल गोंद का उपयोग कर BBB के मस्तिष्क ब्लॉक संलग्न, और धीरे और ध्यान से 1-2 मिनट के भीतर मस्तिष्क की सतह से तरल पदार्थ पोंछ, एक microfiber कपड़े फिर से उपयोग कर. उसके बाद, एक 3 डी स्कैन फिर से निष्पादित करें (चित्र 1c-2).
  10. BBB के केंद्र को कवर करने वाले काले टेप को एक वाइब्नोम के लिए काटने के चरण के केंद्र से जोड़ें (चित्र 1d) )
  11. काटने के चरण में काटने समाधान डालो और vibratome पर काटने चरण सेट. काटने की गति और आयाम समायोजित करें। दो मस्तिष्क खंडों से 2-5 कोरोनल स्लाइस (300 डिग्री मी मोटी) बनाएं। यदि संभव हो तो काटने की अवस्था में समाधान को चुदते रखें (चित्र 1e) .
  12. vibratome के ब्लेड धारक के लिए एक ब्लेड संलग्न और काटने की गति, आवृत्ति, और उन्हें गति के लिए 12.7 मिमी/ मिनट के रूप में स्थापित करके प्रणाली के कंपन आयाम का अनुकूलन, आवृत्ति के लिए 87-88 हर्ट्ज, और स्विंग चौड़ाई के लिए 0.8-1.0 मिमी. जब सावधान काटने की आवश्यकता होती है, तो गति को 2-3 के स्तर तक धीमा कर दें।
  13. मस्तिष्क स्लाइस काटने के दौरान, प्रारूप में कटा हुआ निर्देशांक रिकॉर्ड, पूर्वकाल-पश्च निर्देशांक, गोलार्द्ध, और अन्य स्थितियों सहित (चित्र 2c).
  14. धीरे से prewarmed से भरा एक बीकर के लिए मस्तिष्क स्लाइस हस्तांतरण ($34 डिग्री सेल्सियस) ACSF एक मोटी प्लास्टिक पाइपेट का उपयोग कर, और उन्हें $ 1 के लिए $ 34 डिग्री सेल्सियस पर बीकर में इनक्यूबेट। इस समय के दौरान, काटने के चरण पर शेष मस्तिष्क ब्लॉकों का 3डी स्कैन करें (चित्र 1ब्-2)।
  15. एक रिकॉर्डिंग इकाई पर एक MEA चिप सेट करें. चिप को दो ट्यूबों का उपयोग करके एक peristaltic पंप से कनेक्ट करें। एक ट्यूब का प्रयोग करें MEA चिप और अन्य ट्यूब में एक ही ACSF मार्गदर्शन करने के लिए बाहर का ईया चिप से बाहर ACSF मार्गदर्शन.
  16. दो सुइयों संलग्न (0.60 मिमी x 19 मिमी), दो ट्यूबों के सुझावों पर जुड़े, MEA चिप की दीवार के शीर्ष करने के लिए, और MEA चिप की भीतरी दीवार के बाद अपने सुझावों के साथ अपनी स्थिति को ठीक. ACSF की प्रवाह दर 4.1 rpm करने के लिए सेट करें।
  17. 1 ज पारित होने के बाद, एक मोटी प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके चिप पर एक टुकड़ा ले जाएं, और एक नरम ब्रश का उपयोग करके स्थिति निर्धारित करें। फिर, न्यूरोनल गतिविधियों की रिकॉर्डिंग प्रक्रिया प्रारंभ करें (चित्र2-घ)।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री दाग (दिन 3 और 4)

  1. MEA रिकॉर्डिंग समाप्त होने के बाद, स्लाइस को फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) से भरे 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। उन्हें रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, 4% पीएफए समाधान निकालें, और कुल में 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइस 3x धो लें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो स्लाइस को 20% जिलेटिन/पीबीएस में एम्बेड करें और स्लाइस को 50 डिग्री मीटर से पतला बनाने के लिए, वाइब्राटोम का उपयोग करके इसे काट लें।
  2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान (10 एमएम सोडियम साइट्रेट, पीएच 6.0) तैयार करें। पिछले धोने से पीबीएस निकालें और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान जोड़ें.
  3. एक बिजली के थर्मस पॉट में पानी उबालें और बर्तन में $ 95-98 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए स्लाइस के साथ ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद प्राकृतिक ठंडा।
  4. 50 एमएम त्रिस-बफर नमकीन तैयार करें और 1% ना बिस्सुल्फ़ (1% ना बिस्सल्फेट-ट्रिस समाधान) जोड़ें। पीएच को 7.5 तक समायोजित करें. फिर, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1% ना bisulfite-Tris समाधान के साथ स्लाइस धोने ($ 20-25 डिग्री सेल्सियस).
  5. 4% सामान्य बकरी सीरम और 0.5% octylphenol ethoxylate 1% Na bisulfite-Tris समाधान करने के लिए जोड़कर अवरुद्ध समाधान तैयार करें।
  6. स्लाइस के साथ ट्यूब ों से 1% Na bisulfite-Tris समाधान निकालें और अवरुद्ध समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट।
  7. 1% ना बिस्सुल्फ़-ट्रिस समाधान के लिए 1% सामान्य बकरी सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 जोड़कर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें और प्राथमिक एंटीबॉडी को कम करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के निम्नलिखित सांद्रता का उपयोग करें: माउस विरोधी GAD67 के 1:800 और खरगोश विरोधी NeuN के 1:500.
  8. स्लाइस के साथ ट्यूबों से 1% Na bisulfite-Tris समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें. इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. 50 एमएम त्रिस-बफर नमकीन तैयार करें और 8.5 g/L NaCl (Tris-NaCl समाधान) जोड़ें। पीएच को 7.5 तक टिरेट करें। फिर, कुल में 5 मिनट के लिए Tris-NaCl समाधान ($20-25 डिग्री सेल्सियस) के साथ स्लाइस 3x धो लें।
  10. Tris-NaCl समाधान करने के लिए 3% सामान्य बकरी सीरम और 0.3% Triton एक्स-100 जोड़कर और माध्यमिक एंटीबॉडी को कम करके दूसरा एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के निम्नलिखित सांद्रता का प्रयोग करें: बकरी विरोधी माउस के 1:500 और बकरी विरोधी खरगोश के 1:500.
  11. स्लाइस के साथ ट्यूबों से Tris-NaCl समाधान निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इसे इनक्यूबेट करें। फिर, कुल में 5 मिनट के लिए Tris-NaCl समाधान के साथ स्लाइस 3x धो लें.
  12. एक छोटे से ब्रश का उपयोग कर स्लाइड पर स्लाइस प्लेस और बढ़ते मीडिया और एक coverslip लागू होते हैं. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड की जांच. स्लाइस की पृष्ठकी छवियोंको ली गई है (चित्र 2म)।

8. एमआरआई डेटा प्रसंस्करण Cortical मात्रा निकालने के लिए

  1. मुफ्त सॉफ्टवेयर एफएसएलस्थापित करें (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). धारा 3 में प्राप्त एमआरआई छवियों को तैयार करें।
  2. छवि स्वरूप को बदलें NIFTI[PAIR]G] आदेश का उपयोग कर। यह एक मानव मस्तिष्क के रूप में के रूप में बड़ा बनाने के लिए मस्तिष्क छवि का विस्तार fslcreatehd कमांड का उपयोग कर, और, यदि आवश्यक हो, विकल्प के साथ fslorient का उपयोग कर अभिविन्यास बदलने -setQformcode 1. इस के बाद, मूल फ़ाइल स्वरूप की वसूली fslchfiletype NIFTI[G]का उपयोग कर। सटीक आदेश निम्नानुसार है।
    fslchfiletype NFTI[PAIR ]input image].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [इनपुट छवि].hdr.gz
    एफ.एस.एल.रिडॉरिएंट -सेटक्फोर्मकोड 1 [इनपुट छवि].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI[G] [इनपुट छवि]
  3. एफएसएल सॉफ़्टवेयर खोलने के लिए fsl लिखें. चित्रमय यूजर इंटरफेस (GUI) से शर्त आदेश का उपयोग कर दिमाग निकालें, लेकिन बहुत ज्यादा छील नहीं है. फिर, भिन्नात्मक तीव्रता थ्रेशोल्ड को नियंत्रित करें, और प्रारंभिक मस्तिष्क सतह क्षेत्र के केंद्र के निर्देशांक सावधानी से। अलग-अलग डेटा के लिए इष्टतम मान भिन्न होते हैं.
  4. मूल माउस मस्तिष्क आकार के लिए मस्तिष्क छवि का आकार, चरण 8.2 में के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर. सटीक आदेश के रूप में का पालन करें है:
    fslchfiletype NFTI[PAIR ]input image].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 4 [इनपुट छवि].hdr.gz
    एफ.एस.एल.रिडॉरिएंट -सेटक्फोर्मकोड 1 [इनपुट छवि].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI[G] [इनपुट छवि]
  5. इश्कबाज आदेश का उपयोग कर सभी मस्तिष्क छवियों coregistrate, और -add विकल्प और fslmaths आदेश के div विकल्प का उपयोग कर एक औसत मस्तिष्क छवि का उत्पादन.
    fslmaths [मस्तिष्क छवि 1] -add ... -add [मस्तिष्क छवि N] -div N [औसत छवि नाम] -odt फ्लोट
  6. fslmaths आदेश के -thr विकल्प का उपयोग कर औसत मस्तिष्क क्लीनर बनाओ. फिर, अलग-अलग मामलों के लिए अनुकूली एक इष्टतम थ्रेशोल्ड मान का चयन करें।
    fslmaths [औसत छवि नाम] -thr [thr मान, उदाहरण के लिए, 5000] [thresholded औसत छवि]
  7. अंत में, एक व्यक्ति के समन्वय में एक व्यक्ति के समन्वय में औसत मस्तिष्क छवि नयी आकृति प्रदान इश्कबाज आदेश फिर से. फिर, काफी साफ निकाले प्रांतस्था तैयार (चित्र 2a).
    नोट: दुर्भाग्य से, घ्राण बल्ब और सेरिबैलम एमआरआई संस्करणों से पुनर्निर्माण मस्तिष्क की सतह में सही नहीं होगा क्योंकि एफएसएल सॉफ्टवेयर की आवश्यक सीमाओं के कारण घ्राण बल्ब और सेरिबैलम सहित सभी मस्तिष्क भागों के लिए peal.

9. एमआरआई छवि प्रसंस्करण धारी Cortical सतहों के लिए

  1. डाउनलोड एक और मुफ्त सॉफ्टवेयर,3 डी स्लाइसर (https://download.slicer.org/)।
  2. निकाले गए दिमाग के एमआर छवियों को खोलें (फ़ाइल क्लिक करें और डेटा जोड़ेंका चयन करें) अनुभाग 8 के अनुसार उत्पादित, 3 डी स्लाइसर में वॉल्यूम प्रतिपादन और संपादक मॉड्यूल का उपयोग कर।
  3. वॉल्यूम रेंडरिंगके लिए संपादक से मोड बदलें, और मस्तिष्क की छवि स्क्रीन के केंद्र में आने के लिए एक लक्ष्य बटन पर क्लिक करें।
  4. MR-T2-मस्तिष्क मोड का चयन करें और शिफ्ट पट्टी ले जाकर सीमा धुन. उसके बाद, संपादक के लिए वॉल्यूम रेंडरिंग से वापस ले जाएँ और थ्रेशहोल्ड प्रभाव बटन क्लिक करें।
  5. लेबल 41 लागू करें. सेरेब्रल कॉर्टेक्स और एक .stl फ़ाइल के रूप में मस्तिष्क की सतह डेटा को बचाने के. फिर, फ़ाइल स्वरूप को .vtk से .stlमें परिवर्तित करें, और प्रपत्र चेक करके फ़ाइल सहेजें.

10. 3 डी स्कैन डेटा के लिए पूर्व संसाधन

  1. संरेखण विकल्प में शामिल वैश्विक पंजीकरण पर क्लिक करके उनके बीच छोटे बेमेल को सही करने के लिए एक स्कैन के अनुक्रम के भीतर 8 या 16 विभिन्न कोणों से ली गई 8 या 16 छवियों के बीच एक स्वत: coregistration प्रदर्शन, और उन्हें एकीकृत. पूरे मस्तिष्क की सतह प्राप्त करने के लिए विभिन्न कोणों से स्कैन दोहराएँ (चित्र 2ब)।
    1. यदि विभिन्न कोणों से स्कैन की गई छवियों के बीच एकीकरण सफल नहीं था, तो मैन्युअल संरेखण क्लिक करें और किसी निश्चित छवि और चल छविकी एक जोड़ी का चयन करें।
    2. विभिन्न छवियों में तीन या चार सामान्य बिंदुओं का चयन करके छवियों का मैन्युअल संरेखण प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें क्लिक करें. उसके बाद, ठीकक्लिक करें. अनुकूलन एल्गोरिथ्म पुनरावर्ती निकटतम बिंदु (आईसीपी) एल्गोरिथ्म10है। यह एक nonlinear विरूपण शामिल नहीं है.
  2. सभी छवियों का चयन करके और मेष पीढ़ी बटन पर क्लिक करके सभी गठबंधन छवियों (यानी, डॉट्स डेटा सेट के) का एक जाल बनाओ. फिर, उच्चतम संकल्प के रूप में जाल प्राप्त करने के लिए विकल्प छोटे कलात्मक वस्तु का चयन करें। उसके बाद, छवि को .stl बाइनरी, या ASCII स्वरूप में सहेजें।

11. एमआरआई सतह और 3 डी स्कैन सतह के सह पंजीकरण

  1. एमआरआई सतह खोलें और सतह प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी स्कैन सतह के साथ विलय। उसके बाद, चरण 10.1.1 और 10.1.2 में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर कोई मैन्युअल संरेखण प्रक्रिया निष्पादित करें। फिर, इन सहपंजीकृत सतह छवियों को फिर से सहेजें (चित्र 2क,ब)।
    1. यदि आवश्यक हो, व्यक्तिगत सतह डेटा साफ, उदाहरण के लिए, मस्तिष्क क्षेत्र के आसपास के छोटे शोर मिटा कर, विशेष रूप से एमआरआई डेटा के मामले में, और छेद भरने के द्वारा यदि कोई मौजूद है, विशेष रूप से 3 डी स्कैन डेटा के मामले में.
  2. अंत में, एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ सतह डेटा खोलें, उदाहरण के लिए, MATLAB, और प्रदर्शन और दो सतहों के बीच न्यूनतम दूरी के हिस्टोग्राम का मूल्यांकन.

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Representative Results

हम cortical सतहों के बीच दूरी का मूल्यांकन, एमआरआई मात्रा अलग करना द्वारा उत्पादित, और निकाले गए दिमाग के 3 डी स्कैन से प्राप्त सतहों. दूरियों के हिस्टोग्राम के विधा मान केवल 55 उ हैं (चित्र 3क) । इसके अतिरिक्त, उस बिंदु से हिस्टोग्राम जमा करते समय जहां दूरी शून्य के बराबर होती है, संचित मान कुल नमूना संख्याओं का 90% तक पहुँच जाता है $300 उ (चित्र3ब)। दो सतहों के बीच की दूरी के अंतिम हिस्टोग्राम में लगभग 50 उ. यदि हम इस मान की व्याख्या स्थूल दृष्टिसे से करते हैं, तो रोचक बात यह है कि विवेष् ठ माप ,50 उ, ज्यामितीय सीमा से मेल खाता है, जिसकी अपेक्षा एमआरआई के वोसेल आकार से की गई थी (चित्र 3क)अर्थात् 100 डिग्री उ. इस बिंदु परोक्ष रूप से पता चलता है कि ओवरलैपिंग एल्गोरिथ्म, आईसीपी, एमआरआई और 3 डी स्कैन के बीच शानदार अच्छी तरह से काम किया और दोनों एमआरआई और 3 डी स्कैन के शोर के स्तर को कम मूल्य के रूप में दबा दिया गया (चित्र 2a, ख)14.

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रवाह. (क) सबसे पहले, एक माउस से एक मस्तिष्क निकालने के बाद, मस्तिष्क एक bubbled काटने समाधान में गिरा दिया गया था. (ख) काटने के समाधान को एक नरम और अत्यधिक शोषक तौलिया से पोंछने के बाद , (ग) मस्तिष्क को टर्नटेबल पर स्कैन किया गया था। (घ) स्लाइस बनाने में (प्रक्रिया के चरण 8), मस्तिष्क ब्लॉक एक BBB पर स्कैन किया गया क्योंकि यह एक vibratome के लिए आधार करने के लिए मस्तिष्क ब्लॉक ले जाने के लिए आसान है (चरण 7 और प्रक्रिया के 8). (ई) विद्युत गतिविधियों की रिकॉर्डिंग के लिए पर्याप्त स्लाइस प्राप्त करने के बाद या सेल वितरण और अन्य विधियों को धुंधला करने के लिए, शेष मस्तिष्क ब्लॉकों को फिर से स्कैन किया गया (प्रक्रिया के चरण 10)। शेष मस्तिष्क ब्लॉकों की मोटाई जहां स्लाइस से लिया गया था की अतिरिक्त महत्वपूर्ण समर्थन जानकारी प्रदान की. (च) अंत में, हमने एमईए या धुंधला विधियों और अन्य विधियों का उपयोग करके कार्यात्मक गतिविधियों या संरचनात्मक संरचनाओं को रिकॉर्ड किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: डेटा संसाधन पाइपलाइन. (क) प्रोटोकॉल के अनुभाग 8 और 9 में स्पष्ट अनुसार एमआरआई संस्करणों से कॉर्टेज को अलग करके उत् पन् न एक cortical सतह का एक उदाहरण। (ख) एक cortical सतह का एक उदाहरण सीधे एक 3 डी स्कैनर प्रणाली द्वारा स्कैन. (ग) मस्तिष्क क्षेत्र को सारांशित करने के लिए प्रयुक्त एक ज्ञापन का एक उदाहरण जहां से व्यक्तिगत मस्तिष्क स्लाइस निकाले गए थे। (घ) जब cortical टुकड़ा एक इलेक्ट्रोड डिश पर है का एक उदाहरण है. (ई) NeuN (लाल) और GAD67 (हरा) द्वारा एक दाग मस्तिष्क cortical टुकड़ा का एक उदाहरण है. सभी जानकारी अब एक एकीकृत डेटाबेस में इकट्ठा किया जा रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: MRIs और 3D स्कैन के बीच सटीकता ओवरलैपिंग. (क) एमआरआई संस्करणों से छीलने से निकाली गई सतहों के बीच की दूरी के हिस्टोग्राम। सतहों 3 डी स्कैन रिकॉर्डिंग से आया था. मुख्य बार ग्राफ सभी व्यक्तियों के लिए औसत हिस्टोग्राम है, और अन्य रंगीन लाइनों व्यक्तिगत चूहों के लिए परिणाम हैं (N $ 6, आयु वर्ग 21-40 दिन, सभी महिला चूहों थे). एक सामान्य प्रवृत्ति, सभी व्यक्तियों के लिए स्थिर, पाया जा सकता है. (ख) हिस्टोग्राम का संचित मान एक छड़ ग्राफ के रूप में दर्शाया गया है। संचित प्रतिशत $300 डिग्री (डॉटेड लाइनों) पर 90% तक पहुँच गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: की संकल्पनात्मक छवि सूचना के दो तराजू एक चित्रमय यूजर इंटरफेस (GUI) में एकीकृत. दोनों स्थूल मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान और सूक्ष्म न्यूरॉन सर्किट जानकारी एक वेब द्वारा प्रतिनिधित्व प्रणाली में एकीकृत किया गया. चित्र 3में दर्शाए गए सटीकता की उच्च डिग्री ने हमें इन दो पैमानों को वास्तविक रूप से एकीकृत करने में सक्षम बना दिया। यहाँ प्रस्तुत स्थूल प्रतिबिंब एक स्केलेबल मस्तिष्क एटलस15से है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पैरामीटर मान
पुनरावृत्ति समय (TR) 2,000 एमएस
इको समय (टीई) 9 एमएस
प्रभावी टीई: 45 एमएस
दुर्लभ कारक 16
अधिग्रहण मैट्रिक्स आकार 196 x 144 x 144
दृश्य के क्षेत्र (FOV) 19.6 x 14.4 x 14.4 मिमी3
अधिग्रहण बैंडविड्थ 75 kHz
उन्मुखीकरण अक्षीय (स्कैनर सेटिंग में कोरोनल अभिविन्यास)
वसा दमन पैरामीटर
वसा आवृत् ति 2.6 एमएस-गाऊसी के आकार का $/2 पल्स 1051 हर्ट्ज बैंडविड्थ के साथ
खराब प्रवणता
मूक स्कैन 2 बार
औसत की संख्या 3
अधिग्रहण समय 2 ज 42 मिनट

तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल किया 3 डी दुर्लभ पल्स अनुक्रम के अधिग्रहण मानकों.

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Discussion

हमने पहले की तुलना में अधिक सही दो मस्तिष्क सतहों को ओवरलैप करके स्थूल और सूक्ष्म स्थानिक तराजू को पाटने के लिए 3D-NEO प्रोटोकॉल नामक एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया है। मूल रूप से, इस प्रोटोकॉल जो संभव दो मस्तिष्क सतह छवियों का सटीक ओवरलैपिंग और जीवित जीवों से स्वस्थ न्यूरॉन गतिविधियों रिकॉर्डिंग बनाने में दो चुनौतियों थे. सबसे पहले, यह प्रभावी ढंग से मस्तिष्क जीव को घायल किए बिना खोपड़ी से निकालने के बाद निकाले गए मस्तिष्क के आसपास के समाधान को साफ करने के लिए आवश्यक था (प्रोटोकॉल के चरण 6.2).। दूसरा, के बाद से सूखापन और समय देरी की पहली और तीसरी शर्तों जीवित जीव के लिए संभावित नकारात्मक कारक हैं, मस्तिष्क निष्कर्षण से टुकड़ा तैयारी के लिए स्कैनिंग प्रक्रिया के सभी चरणों को खत्म 10-15 मिनट के भीतर भी रखने के लिए आवश्यक था न्यूरॉन्स सक्रिय.

सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का उपयोग मस्तिष्क गतिविधियों रिकॉर्ड करने की क्षमता अब न केवल संरचनात्मक संगठनों के समन्वय लेकिन यह भी पूरे मस्तिष्क के नक्शे पर कार्यात्मक गतिविधियों के संभव बना दिया है. इस प्रोटोकॉल का एक और सकारात्मक पहलू यह है कि के बाद से एक BBB तैयार किया गया था, vibratome के आधार करने के लिए स्कैनर से अंशांकन बहुत आसान हो गया.

जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में बताया गया है, दो सतहों के बीच की दूरी का हिस्टोग्राम लगभग 50 उ पर एक शिखर दिखाई दिया। यद्यपि हमने अधिव्याप्त प्रक्रिया का प्रदर्शन किया, मानो स्थूल दृष्टिकोण से देखकर. यदि हम सूक्ष्म दृष्टिकोण से परिणाम की व्याख्या करते हैं, तो 50 डिग्री उ न्यूरॉन्स के वितरण में एक तुलनीय स्थानिक पैमानेपर होता है, क्योंकि $100 डिग्री 16,17 के भीतर कॉर्टिकल न्यूरॉन्स क्षय के जोड़े के बीच कनेक्टिविटी संभावनाओं के कारण ,17, यहां तक कि कई मिलीमीटर के भीतर18| व्यावहारिक रूप से, MEA या कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन अक्सर 300-400 0 m मोटी स्लाइस का उपयोग करें. तो, यहाँ प्रस्तुत तकनीक मजबूत उद्देश्य सबूत प्रदान करेगा अगर स्लाइस ठीक से मूल पूरे मस्तिष्क नक्शे में एम्बेडेड हैं. ओवरलैपिंग के बाद सही हासिल की है, अतिरिक्त सटीकता विशुद्ध रूप से एक माइक्रोस्कोप के तहत मनाया स्थानीय जानकारी से प्राप्त किया जाएगा. इसलिए, वैश्विक और स्थानीय अनुकूलन चरणों से मिलकर एक दो कदम अनुकूलन प्रक्रिया प्रदर्शन करके, यह भविष्य में एक न्यूरॉन के विशिष्ट आकार के लिए अर्द्ध स्वचालित रूप से बराबर एक स्थानिक संकल्प तक पहुँचने के लिए संभव हो जाएगा.

यह सटीक एकीकरण प्रोटोकॉल विभिन्न मस्तिष्क atlases उत्पन्न करने के लिए बुनियादी प्रौद्योगिकी प्रदान करता है18,20,21 और यहां तक कि अधिक गहराई से अन्य primates के एमआरआई का अध्ययन करने के लिए22,23 और मानव पोस्टमार्टम दिमाग (हालांकि मानव मस्तिष्क sulci है, यह gyri से रिकॉर्डिंग अंक की पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए संभव है). अब, हम भी एक आम स्थानिक समन्वय में कई दर्ज डेटा नमूनों को एकीकृत करने के लिए एक दृश्य इंटरफ़ेस विकसित कर रहे हैं. इस तरह के रूप में एक छवि आंकड़ा चित्र 4में दिखाया गया है। स्तनधारी दिमाग के मामलों में, मात्रात्मक रूप से अलग-अलग तराजू के बीच एकीकरण भी रोग राज्यों को समझने और दवा प्रभावों के मूल्यांकन में गुणात्मक रूप से नई प्रगति करेगा। आम तौर पर, यह मछलियों, सरीसृप, और उभयचरों के लिए लागू करने के लिए मुश्किल हो जाएगा, क्योंकि शोधकर्ताओं को यह मुश्किल निकाले पतले मस्तिष्क के रूप में अपने पूर्व निकाले फार्म के लिए स्थिर रखने के लिए मिल जाएगा, और उनके छोटे दिमाग की एमआरआई छवियों को भी अपेक्षाकृत noisier हो जाएगा.

3 डी-NEO प्रोटोकॉल एक neuroवैज्ञानिक या सेल जैविक अनुसंधान क्षेत्र में इस अनुसंधान द्वारा पेश किया गया है, सफलतापूर्वक स्थूल शरीर रचना विज्ञान और सूक्ष्म न्यूरॉन वितरण के बीच ब्रिजिंग में उच्च सटीकता का प्रदर्शन, सहित मैक्रो और माइक्रोकनेक्टोम के स्थलाकृतिक आर्किटेक्चर।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एम.एस. चिकित्सा और चिकित्सा संकाय के ग्रेजुएट स्कूल में चिकित्सा सूचना इंजीनियरिंग पाठ्यक्रम में कर्मचारियों के सभी से समर्थन के लिए आभारी है, और प्रो Tetsuya Takakuwa, प्रो Nobukatsu Sawamoto, और डोरिस ज़कियान उनके सहायक के लिए धन्यवाद देना चाहता है टिप्पणियाँ. इस अध्ययन को चुनौतीपूर्ण अन्वेषणात्मक अनुसंधान के लिए एक अनुदान-इन-एड द्वारा और उत्कृष्ट युवा शोधकर्ताओं (लीडर) कार्यक्रम के लिए एम.एस. से MEXT (शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी मंत्रालय) के लिए अग्रणी पहल द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम में एमआरआई प्रयोगों लघु पशु एमआरआई, चिकित्सा अनुसंधान सहायता केंद्र, चिकित्सा के ग्रेजुएट स्कूल, क्योटो विश्वविद्यालय, जापान के लिए प्रभाग में प्रदर्शन किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air compressor Kimura Medical KA-100 Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscope KEYENCE BZ-X710
Anesthesia box Bio Research Center RIC-01 Animal preparation for MRI
Anesthesia system ACOMA Medical Industry NS-5000A Animal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2 Merk Millipore MAB5406 For immunostaining
Calcium Chrolide nacalai tesque 06729-55 aCSF
Choline Chloride nacalai tesque 08809-45 aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpel Kai 10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) nacalai tesque For immunostaining
D(+)-Glucose Wako 049-31165 aCSF
Gelatin nacalai tesque 16605-42 re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32723 For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 Invitrogen A32732 For immunostaining
Heater mat Bio Research Center HM-10 Animal preparation for MRI
Heater mat controller Bio Research Center BWT-100A Animal preparation for MRI
Heater system SA Instruments MR-compatible Small Animal Heating System Animal preparation for MRI
Isoflurane AbbVie Animal preparation for MRI
Isoflurane vaporizer ACOMA Medical Industry MKIIIai Animal preparation for MRI
Linear Slicer DOSAKA Neo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Wako 196-01252 aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate Wako 135-00165 aCSF
MaxOne Single-Well MEA MaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring system SA Instruments Model 1025 Animal preparation for MRI
Monitoring software SA Instruments PC-SAM V.5.12 Animal preparation for MRI
MRI compatible cradle Bruker BioSpin T12812 Animal preparation for MRI
MRI coil Bruker BioSpin T9988 For MRI
MRI operation software Bruker BioSpin ParaVision 5.1 For MRI
Neo LinearSlicer MT D.S.K. NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb Cell Signaling 24307 For immunostaining
Normal Goat Serum Wako 143-06561 For immunostaining
Potassium Chloride Wako 163-03545 aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether nacalai tesque 12967-45 For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensor SA Instruments RS-301 Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scanner Bruker BioSpin BioSpec 70/20 USR For MRI
Pyruvic Acid Sodium Salt nacalai tesque 29806-54 aCSF
SCAN in a BOX Open Technologies srl
Scissors
Sieve bottle TIGERCROWN 81 For 3D scan
SlowFade Gold Antifade Mountant Invitrogen S36937 For immunostaining
Sodium Chloride Wako 191-01665 aCSF
Sodium Dihydrogenphosphate Wako 197-09705 aCSF
Sodium Hydrogen Carbonate Wako 191-01305 aCSF
Sodium Hydrogensulfite nacalai tesque 31220-15 For immunostaining
Thermistor temperature probe SA Instruments RTP-101-B, PLTPC-300 Animal preparation for MRI
Tooth bar Bruker BioSpin T10146 Animal preparation for MRI
Winged intravenous needle TERUMO SV-23CLK For perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution nacalai tesque 35436-01 For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acid nacalai tesque 37314-15 For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15710 For immunostaining

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References

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Ide, S., Kajiwara, M., Imai, H., Shimono, M. 3D Scanning Technology Bridging Microcircuits and Macroscale Brain Images in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol. J. Vis. Exp. (147), e58911, doi:10.3791/58911 (2019).

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