Summary
Dit artikel introduceert een experimenteel protocol met behulp van 3D-scantechnologie die twee ruimtelijke schalen overbrugt: de macroscopische ruimtelijke schaal van de anatomie van de gehele hersenen die wordt afgebeeld door een MRI op > 100 μm en de microscopische ruimtelijke schaal van neuronale verdelingen met behulp van Immunohistochemie-kleuring en een multi elektrode-array systeem en andere methoden (~ 10 μm).
Abstract
Het menselijk brein, zijnde een Multi-Scale systeem, heeft zowel macroscopische elektrische signalen, wereldwijd stroomt langs dikke witte vezelbundels, en microscopische neuronale pieken, propageren langs axonen en dendrieten. Beide weegschalen vullen verschillende aspecten van menselijke cognitieve en gedragsfuncties aan. Op macroscopisch niveau is MRI de huidige standaard beeldvormingstechnologie, waarbij de kleinste ruimtelijke resolutie, Voxel-grootte, 0,1 – 1 mm3is. Ook, op microscopisch niveau, eerdere fysiologische studies waren op de hoogte van niet-uniforme neuronale architecturen binnen dergelijke voxels. Deze studie ontwikkelt een krachtige manier om nauwkeurig microscopische gegevens in te bedden in een macroscopische kaart door interfacing biologisch wetenschappelijk onderzoek met technologische vooruitgang in 3D-scantechnologie. Aangezien 3D-scantechnologie is meestal gebruikt voor engineering en industrieel ontwerp tot nu toe, het is voorzien voor de eerste keer om microconnectomes in de hele hersenen insluiten terwijl het behoud van natuurlijke steking in levende hersencellen. Om dit doel te bereiken, hebben we eerst een scan protocol gebouwd om nauwkeurige 3D-beelden te verkrijgen van levende bio-organismen die inherent uitdagend zijn voorbeeld door vochtige en reflecterende oppervlakken. Ten tweede, we getraind om de snelheid te houden om te voorkomen dat de afbraak van levende hersenweefsel, dat is een belangrijke factor in het behoud van betere omstandigheden en het opnemen van meer natuurlijke neuronale pieken van actieve neuronen in het hersenweefsel. Twee corticale oppervlakte beelden, onafhankelijk geëxtraheerd uit twee verschillende Imaging modules, namelijk MRI en 3D scanner oppervlakte beelden, verrassend Toon een afstand fout van slechts 50 μm als modus waarde van het histogram. Deze nauwkeurigheid is vergelijkbaar in schaal met de microscopische resolutie van intercellulaire afstanden; ook is het stabiel onder verschillende individuele muizen. Dit nieuwe protocol, de 3D-roman Embedding overlappende (3D-NEO) protocol, overbrugt macroscopische en microscopische niveaus afgeleid door dit integratieve protocol en versnelt nieuwe wetenschappelijke bevindingen om uitgebreide connectiviteits architecturen te bestuderen (d.w.z. microconnectome).
Introduction
Niet-uniforme Multi-Scale architecturen op verschillende fysieke en biologische organisaties worden vaak gevonden1,2. De hersenen is ook een zeer niet-uniforme en Multi-Scale netwerkorganisatie3,4. Verschillende cognitieve functies zijn gecodeerd in dergelijke netwerk organisaties, het houden van tijdelijke veranderingen van de elektrische Spike patronen van neuronale populaties in de submilliseconde tijdelijke resoluties. Historisch gezien werden de complexe netwerken onder neuronen in detail structureel waargenomen met behulp van de kleurings technieken van Santiago Ramón y Cajal van meer dan 150 jaar geleden5. Om het groepsgedrag van actieve neuronen te observeren, hebben onderzoekers verschillende opname technologieën ontwikkeld6,7,8, en de recente belangrijke ontwikkelingen van dergelijke technologieën hebben ons in staat om op te nemen elektrische activiteiten van enorme aantallen neuronen tegelijk. Bovendien, uit dergelijke functionele activiteiten, wetenschappers zijn erin geslaagd om te reconstrueren netwerken van causale interacties tussen enorme aantallen neuronen en hebben uitgeroepen tot de topologische architectuur van hun complexe interacties ' microconnectome '9 . Macroscopische waarnemingen van de hersenen zorgen ook voor een hele hersenen als een netwerkorganisatie, omdat veel hersengebieden zijn verbonden door meerdere vezelbundels. Het insluiten van microconnectomes in de wereldwijde hersen kaart heeft nog steeds duidelijke beperkingen binnen de huidige technologische vooruitgang, daarom is dit insluitings protocol zo belangrijk. Er zijn echter veel uitdagingen voor de ontwikkeling van het insluitings protocol. Bijvoorbeeld, om activiteiten van levende lokale neuronale circuits in puur geïsoleerde hersengebieden observeren, hersenen segmenten moeten worden geproduceerd voor in vitro opnames. Bovendien zijn opnames uit hersen segmenten voor in vitro opnames nog steeds een belangrijke keuze voor ten minste twee redenen. Ten eerste is het nog steeds niet gemakkelijk om activiteiten van vele levende individuele neuronen tegelijkertijd te observeren uit hersengebieden die dieper zijn dan ~ 1,5 mm en in hoge temporele resolutie (< 1 MS). Ten tweede, wanneer we hopen te weten de interne architectuur van een lokale neuronale circuit, we moeten stoppen met alle inputs afkomstig uit externe hersengebieden om verstorende factoren te elimineren. Om de richtingen en posities van geproduceerde hersen sneden te identificeren, zal het verder nodig zijn om de ruimtelijke posities van deze geproduceerde hersen segmenten te integreren met behulp van coördinaten. Er zijn echter een paar systematische en betrouwbare manieren om hersen sneden op een georganiseerde manier te maken10,11. Hier wordt een nieuw coregistration-protocol geïntroduceerd, met behulp van 3D-scantechnologie voor neurowetenschappelijk onderzoek om een integratief protocol te bieden. Dit protocol werkt aan de coördinatie van micro-en macro weegschalen en insluiten van multi-elektrode array (MEA) microdata12,13 en kleurings gegevens op een macroscopische MRI-ruimte via 3D-scan oppervlakken van geëxtraheerde hersenen, evenals van niet-invasief opgenomen hersenen. Verrassend genoeg toonde dit een afstand fout van slechts ~ 50 μm als de modus waarde van het histogram. Als gevolg hiervan waren de modus waarden van de minimale afstanden tussen twee oppervlakken tussen het MRI-oppervlak en het gescande 3D-oppervlak bijna 50 μm voor alle zes muizen, wat een geschikt getal is bij het controleren op gemeenschappelijkheid bij individuen. De typische segment breedte had een opgenomen Spike-activiteit van ongeveer 300 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Dierenzorg Comité van de Universiteit van Kyoto.
1. dieren (dag 1)
- Bereid vrouwelijke C57BL/6J muizen (n = 6, leeftijd 3 − 5 weken).
Opmerking: Dit protocol is van toepassing op alle soorten knaagdieren.
2. MRI-instellingen (dag 1)
- Zet de muis in een acryl verdoving box geplaatst op een kachel mat aangepast aan 37 ° c met behulp van een kachel mat controller.
- Anesthetiseer de muis met 2% Isofluraan in de lucht stroomt door de doos met een debiet van 1,4 L/min met behulp van een verdoving systeem, die is samengesteld uit een Isofluraan vaporizer, luchtdebiet meter en luchtcompressor.
- Na de inductie van anesthesie, plaats de muis in een MRI-compatibele wieg in de liggende positie. Controleer of de anesthesie volstaat door het clippen van een teen van de muis met een pincet om te zien of het geen pijn voelt.
- Bevestig het hoofd van de muis met de tand balk en het gezichtsmasker uitgerust met de wieg. Onderhoud vervolgens de anesthesie met 1% − 1,5% Isofluraan in lucht bij 1,4 L/min via het gezichtsmasker.
- Steek een thermistor temperatuursonde in het rectum van de muis en plaats een drukgevoelige Ademhalings sensor op de achterkant van de muis.
- Breng de houder over in de boring van een MRI-magneet. Stel de Isofluraan concentratie in op ongeveer 1% − 1,5% om een stabiele en reproduceerbare anesthesie diepte te garanderen. Monitor als de lichaamstemperatuur wordt geregeld tussen 33 − 35 °C en de ademhalingssnelheid tussen 0,5 − 1,3 Hz gedurende de hele periode van MRI-experimenten, met behulp van een bewakingssysteem (tabel met materialen) voor de fysiologische parameters van kleine dieren met speciale software (tabel met materialen).
- Gebruik de gemeten waarde van de rectale temperatuur om de lichaamstemperatuur te reguleren door de temperatuur van de warme lucht die in de magneet boring wordt geleverd te regelen via een verwarmingssysteem dat is uitgerust in het bewakingssysteem.
3. MRI-overnames (dag 1)
-
Voorbereidingen voor de 3D T2-gewogen MRI-scan met hoge resolutie
- Verkrijg drie magnetische resonantie (MR) beelden in drie orthogonale (axiaal, coronale en Sagittaal) vliegtuigen om de positie van de muis te controleren.
- Verwijzend naar deze beelden, pas de positie van de muis door het verplaatsen van de wieg zodat het midden van de muis hersenen wordt gepositioneerd in het midden van de resonator, alsmede in het midden van de gradiënt spoelen in axiale richting.
- Pas het MRI-systeem aan door de resonator aan te passen, de statische magnetische veld homogeniteit (shimming) en de basisfrequentie aan te passen en het RF-vermogen (Radio Frequency) te kalibreren.
- Verkrijg lage resolutie 2D tomograaf T2-gewogen (T2W) beelden met coronale en sagittale oriëntaties. Bepaal op basis van deze beelden het gezichtsveld (FOV) voor een 3D T2W MRI-scan met hoge resolutie.
- Voer gelokaliseerde shimming uit met een FASTMAP Automatic Shim-algoritme. Selecteer voor het FASTMAP-protocol een rechthoekig gebied dat de hele hersenen bedekt. Na de voltooiing van de gelokaliseerde shimming, bevestig de B0 veld inhomogeniteit binnen het hersengebied door een gelokaliseerd 1H spectrum met behulp van punt-opgeloste spectroscopie (Press).
- Verkrijg 3D T2W-afbeeldingen met lage resolutie om ervoor te zorgen dat de scaninstellingen voor 3D-T2W MRI met hoge resolutie geschikt zijn door de juiste positie van de FOV, de afwezigheid van wraparound (aliasing)-artefacten en de efficiënte onderdrukking van vetsignalen te controleren.
-
Imaging Pulse sequence
- Na de voorbereidingen hierboven beschreven, verwerven van hoge-resolutie 3D T2W beelden van de hele hersenen van de muis, met behulp van een snelle overname met ontspanning Enhancement (zeldzame) sequentie.
Opmerking: In dit artikel werden MRI-experimenten uitgevoerd op een 7 T, 210 mm horizontale boring, preklinische scanner, uitgerust met een gradiënt systeem van 440 mT/m bij oprit 100 μs. Een Quadrature volume resonator met een inwendige diameter van 35 mm werd gebruikt voor RF-excitatie en signaalontvangst. MRI-gegevens werden verkregen met een speciale operatie software. De acquisitie parameters van de in deze studie gebruikte 3D RARE Pulse-sequentie worden samengevat in tabel 1.
- Na de voorbereidingen hierboven beschreven, verwerven van hoge-resolutie 3D T2W beelden van de hele hersenen van de muis, met behulp van een snelle overname met ontspanning Enhancement (zeldzame) sequentie.
4. bereiding van experimentele oplossingen (dag 2)
- Bereid 500 mL van een ijskoude snij oplossing (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2po4, 7 mm MgCl2, 15 mm glucose, 25 mM NaHCO3, 0,5 mm CACL2, 11,6 mm Natriumascorbaat, 3,1 mm natrium pyruvate, en 100 mm choline chloride, borrelen met 95% O2 en 5% Co2). Stel de pH in op 7,3 − 7,4.
- Bereid 1 L van de kunstmatige cerebrospinale vloeistof (acsf; 127 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 1,25 mm Nah2po4, 1 mm MgCl2, 15 mm glucose, 25 mm NaHCO3, en 2 mm CACL2, geborreld met 95% O2 en 5% Co2). Stel de pH in op 7,3 – 7,4.
5. voorbereiding van de apparatuur (dag 2)
- Bereid een 6,6 cm2 vierkant, 0,5 cm dikke magneet "ring" en, eerste, plaats zwarte tape en, tweede, chirurgische tape op de ring (afbeelding 1c-2). Merk op dat dit materiaal wordt genoemd een Brain-Block base (BBB), en houd het koud op blokken ijs.
Opmerking: Later worden de tapes bevestigd aan het snijden station met hersen blokken voor de vibratome. De vierkante ring wordt gebruikt als de bodem basis van de BBB om twee doeleinden te bevredigen, namelijk om hersen blokken soepel van het 3D-scanstation naar een vibratome te migreren en nauwkeurig de hoogten van de hersen blokken in de scan stap te meten. - Stel de BBB in met een automatische draaitafel. Schakel de scanner en de draaitafel in. Start de beeldverwerkingssoftware.
-
Voorafgaand aan alle experimenten, voer kalibraties van de camera's en de aangesloten draaitafel van een gestructureerde lichtprojectie en desktop-type 3D-scanner.
- Schakel de middelste projector, de twee camera's en de draaitafel in. Open vervolgens de software. Klik in de software op optische instellingen en selecteer het afbeeldingsgebied als 100 x 80 en de raster nummers als 100 x 100. Vervolgens start de camerakalibratie volgens de volgende vier stappen.
- Voor de projector opstelling legt u het kalibratieblad op het Bureau en zet u het kalibratie bord op het kalibratieblad om het bevestigingspunt van het meetgebied aan te passen aan het midden van het blad en de oriëntatie naar voren. Stel de afstand tussen de projector en het bord in op ongeveer 200 mm. Draai de schroeven los die de twee knoppen bevestigen en draai aan de knoppen om de lichtgevoeligheid en de focus van de twee camera's aan te passen. Klik vervolgens op pijl om naar de volgende stap te gaan.
- Om de camera's te oriënteren, maak de schroeven die de twee camera's bevestigen zelf los en verplaats de posities en de rotaties om te overlappen met de middellijn op het kalibratie bord, de verticale lijn en het gele kruis geprojecteerd vanuit de projector. Corrigeer de camera's en klik nogmaals op pijl . Dan zal het scherm donker worden.
- Om de camera's te focussen, na het losdraaien van de bevestigingsschroeven van de knoppen, verhoogt u de lichtgevoeligheid en stemt u de focus opnieuw af. Klik vervolgens op pijl om naar de volgende stap te gaan.
- Voor de F-waarde en de mate van belichting (van de camera), pas de lichtgevoeligheid opnieuw aan net onder waar het rode gebied verdwijnt. Klik vervolgens nogmaals op pijl en klik op kalibratie starten kies Ja als u wordt gevraagd of u de optische instelling hebt voltooid?
- Klik op de kalibratie initialiserenen controleer of de pixelwaarden zijn genormaliseerd tussen 0 – 255. Klik vervolgens op Doorgaan.
- Door de voorgestelde posities te volgen, beelden van negen verschillende relatieve hoeken van de scanner en het kalibratie bord op te nemen en na bevestiging van het kalibratieproces te voltooien, en ten slotte op Update van de kalibratie teklikken.
- Wissel het kalibratie bord voor de draaitafel en klik op de draaitafel kalibratie.
Opmerking: Nu zijn alle kalibraties voltooid.
- Schakel de middelste projector, de twee camera's en de draaitafel in. Open vervolgens de software. Klik in de software op optische instellingen en selecteer het afbeeldingsgebied als 100 x 80 en de raster nummers als 100 x 100. Vervolgens start de camerakalibratie volgens de volgende vier stappen.
6. hersen oppervlak scan-, slicing-en MEA-opname (dag 2)
- Anesthetiseer een muis met 1% − 1,5% Isofluraan en onthoode de muis. Gebruik een scalpel om de huid te openen en de schedel bloot te leggen.
- Snijd de hoofdhuid van de verdoofd Mouse langs de sagittale hechting met behulp van een chirurgisch mes, en snijd de schedel in diagonale richtingen van het Lambda punt naar een punt een beetje voor de bregma met behulp van chirurgische schaar. Schil vervolgens de schedel voorzichtig van de hersenen met behulp van gebogen pincet.
- Gebruik een spatel om de hersenen op te tillen en over te brengen naar een Petri schaaltje (100 mm x 20 mm) met ijskoude snij oplossing (bereid in stap 4,1). Luchtstroom met 95% O2 en 5% Co2 van een externe gasbom met een gecontroleerde roterende snelheid van de pomp (~ 4,0 rpm) om kleine bubbels in de ijskoude snij oplossing te genereren (Figuur 1a).
- Na 1 – 2 min, zet de hersenen op een microfiber doek waarvan het oppervlak is lichtjes bedekt met een meel zeef, en veeg vloeistof uit het hersen oppervlak, zachtjes met behulp van de microvezeldoek (Figuur 1b).
- Zet de hersenen met zijn rugaspect omhoog op de sample stand op de BBB, en zet ook de BBB in het midden van de automatische draaitafel.
- Maak de ruimte donkerder tijdens de 3D-scan en voer een 3D-scan uit op de draaitafel. Als u wilt testen of de 3D-scan goed werkt, klikt u op 3D-scan door de hoek tussen twee opnamen te selecteren als 22,5, de beginhoek als 0 en de laatste hoek als 360 (afbeelding 1c-1).
- Verplaats de hersenen naar een Petri schaaltje en bel de hersenen in de snij oplossing voor ongeveer 10 sec.
- Snijd de hersenen in twee blokken in het midden van het coronale vlak met behulp van een chirurgisch mes, en verplaats de twee hersen blokken zachtjes naar het vlakke oppervlak met behulp van een chirurgische spatel.
- Bevestig de hersen blokken van de BBB met behulp van Instant lijm, en veeg voorzichtig de vloeistof af van het hersen oppervlak binnen 1 – 2 minuten, met behulp van een microvezeldoek opnieuw. Voer vervolgens opnieuw een 3D-scan uit (afbeelding 1c-2).
- Bevestig de zwarte tape die het midden van de BBB bedekt met het midden van de snij fase voor een vibratome (figuur 1d).
- Giet de snij oplossing in de snij fase en zet de snij fase op de vibratome. Pas de snijsnelheid en amplitude aan. Maak 2 – 5 coronale schijfjes (300 μm dik) uit de twee hersen blokken. Houd de oplossing zo mogelijk in de snij fase (Figuur 1e).
- Bevestig een blad aan de meshouder van de vibratome en Optimaliseer de snijsnelheid, frequentie en trillingsamplitude van het systeem door ze in te stellen als 12,7 mm/min voor de snelheid, 87 – 88 Hz voor de frequentie en 0,8 – 1,0 mm voor de swing breedte. Wanneer voorzichtig snijden nodig is, vertragen de snelheid naar niveau 2 – 3.
- Terwijl het snijden van de hersenen segmenten, noteer de gesegmenteerd coördinaat in het formaat, met inbegrip van de anterieure-posterior coördinaat, halfrond, en andere voorwaarden (figuur 2c).
- Breng de hersen sneden voorzichtig over in een bekerglas gevuld met voorverwarmde (~ 34 °C) ACSF met een dikke plastic pipet en inbroed ze in het bekerglas bij ~ 34 °C gedurende ~ 1 uur. Voer gedurende deze tijd een 3D-scan uit van de overgebleven hersen blokken op de snij fase (figuur 1c-2).
- Stel een MEA chip in op een opname-eenheid. Sluit de chip aan op een peristaltische pomp met behulp van twee buizen. Gebruik één buis om dezelfde ACSF naar de MEA chip en de andere buis te leiden om ACSF uit de MEA chip te begeleiden.
- Bevestig twee naalden (0,60 mm x 19 mm), aangesloten op de uiteinden van de twee buizen, aan de bovenkant van de muur van de MEA chip, en bevestig hun posities met hun tips na de binnenwand van de MEA chip. Stel de stroomsnelheid van de ACSF in op 4,1 rpm.
- Beweeg na 1 uur een schijfje op de chip met een dikke plastic pipet en stel de positie in met een zachte borstel. Start vervolgens het opnameproces van neuronale activiteiten (Figuur 2-d).
7. immunohistochemie-kleuring (dagen 3 en 4)
- Nadat de MEA-opname is voltooid, moet u de segmenten overbrengen naar 1,5 mL tubes gevuld met 4% Paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Inincuberen ze 's nachts bij 4 °C. Verwijder vervolgens de 4% PFA-oplossing en was de segmenten 3x met PBS gedurende 5 minuten in totaal.
Opmerking: Indien nodig, insluiten de segmenten in 20% gelatine/PBS en resectie het segment te maken het dunner dan 50 μm, met behulp van de vibratome. - Oplossing voor het ophalen van antigeen (10 mM Natriumcitraat, pH 6,0). Verwijder de PBS uit de laatste wasbeurt en voeg de antigeen-ophaal oplossing toe.
- Kook het water in een elektrische Thermos pot en inbroed de buisjes met de schijfjes gedurende 20 minuten bij ~ 95 – 98 °C in de pot, gevolgd door natuurlijke koeling.
- Bereid 50 mm tris-gebufferde zoutoplossing voor en voeg 1% na natriumbisulfiet (1% na natriumbisulfiet-tris) toe. Stel de pH in op 7,5. Was vervolgens de schijfjes met 1% na bisulfite-tris-oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (~ 20 – 25 °C).
- Bereid blokkerende oplossing door toevoeging van 4% normaal geit serum en 0,5% octylfenol ethoxylaat aan de 1% na bisulfite-tris oplossing.
- Verwijder de 1% na bisulfite-tris-oplossing uit de buisjes met de schijfjes en voeg blokkerende oplossing toe. Inincuberen voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de primaire antilichaam oplossing voor door 1% normaal geiten serum en 0,5% Triton X-100 toe te voegen aan de 1% na bisulfite-tris-oplossing en primaire antilichamen te verdunen. Gebruik de volgende concentraties primaire antilichamen: 1:800 van de muis anti-GAD67 en 1:500 van konijn anti-NeuN.
- Verwijder de oplossing 1% na bisulfite-tris uit de buisjes met de schijfjes en voeg de primaire antilichaam oplossing toe. Inincuberen het 's nachts bij 4 °C.
- Bereid 50 mM tris-gebufferde zoutoplossing voor en voeg 8,5 g/L NaCl (tris-NaCl Solution) toe. Tiveren de pH naar 7,5. Was vervolgens de plakjes 3x met de Tris-NaCl-oplossing (~ 20 – 25 °C) gedurende 5 min in totaal.
- Bereid de tweede antilichaam oplossing voor door 3% normaal geiten serum en 0,3% Triton X-100 toe te voegen aan de Tris-NaCl-oplossing en secundaire antilichamen te verdunten. Gebruik de volgende concentraties secundaire antilichamen: 1:500 van geit anti-muis en 1:500 van geit anti-konijn.
- Verwijder de Tris-NaCl-oplossing uit de buisjes met de schijfjes en voeg de secundaire antilichaam oplossing toe. Inincuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de sneetjes 3x met de Tris-NaCl-oplossing gedurende 5 min in totaal.
- Plaats de segmenten op de dia met een klein penseel en pas de montage media en een dekglaasje toe. Bekijk de dia's met een confocale Microscoop. Maak afbeeldingen van het oppervlak van een segment (figuur 2e).
8. MRI-gegevensverwerking om corticale volumes te extraheren
- Installeer de gratis software FSL (https://fsl.fmrib.Ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Bereid de in rubriek 3 verworven MRI-beelden voor.
- Wijzig de afbeeldingsindeling met de opdracht fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ . Breid het hersen beeld uit om het zo groot te maken als een menselijk brein met behulp van de fslcreatehd -opdracht, en wijzig indien nodig de oriëntatie met fslorient met de optie -setqformcode 1. Na deze, herstellen van de oorspronkelijke bestandsformaat met behulp van fslchfiletype NIFTI_GZ. De exacte opdracht is als volgt.
fslchfiletype NFTI_PAIR [invoerafbeelding]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [invoerafbeelding]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [invoerafbeelding]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [invoerafbeelding] - Typ fsl om de fsl-software te openen. Uittreksel hersenen met behulp van de weddenschap commando van de grafische gebruikersinterface (GUI), maar niet te veel schil. Vervolgens, controle van de fractionele intensiteit drempels,... en coördinaten van het centrum van de initiële hersenen oppervlak bol zorgvuldig. De optimale waarden zijn verschillend voor afzonderlijke gegevens.
- Het formaat van de hersenen beeld naar de oorspronkelijke muis hersenen grootte, met behulp van dezelfde procedure als in stap 8,2. De exacte opdracht is als volgt:
fslchfiletype NFTI_PAIR [invoerafbeelding]. NII. gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,08 0 0 0 0 4 [invoerafbeelding]. HDR. gz
fslorient – setqformmcode 1 [invoerafbeelding]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [invoerafbeelding] - Coregistreren alle beelden van de hersenen met behulp van de flirt commando, en produceren een gemiddeld hersen beeld met behulp van de -add optie en de -div optie van de fslmaths commando.
fslmaths [Brain image 1] – toevoegen... – toevoegen [Brain image N] – div N [averaged image name] – ODT float - Maak de gemiddelde hersen reiniger met behulp van de optie -thr van de opdracht fslmaths . Selecteer vervolgens een optimale drempelwaarde adaptief voor individuele gevallen.
fslmaths [gemiddelde afbeeldingsnaam] – thr [thr-waarde, bijvoorbeeld 5000] [thresholded gemiddeld beeld] - Tot slot, Hervorm het gemiddelde hersen beeld in de coördinaat van een individu met behulp van de flirt -opdracht opnieuw. Bereid vervolgens vrij schone geëxtraheerde cortexes (Figuur 2a).
Opmerking: Helaas zullen de olfactorische gloeilamp en het cerebellum niet perfect zijn in het gereconstrueerde hersen oppervlak van de MRI-volumes vanwege de essentiële beperkingen van de FSL-software om alle hersendelen te Peal, inclusief olfactorische gloeilamp en cerebellum.
9. MRI-beeldverwerking tot Stripe corticale oppervlakken
- Download een andere gratis software, 3D slicer (https://download.Slicer.org/).
- Open de MR-afbeeldingen van de uitgepakte hersenen (Klik op bestand en selecteer gegevens toevoegen) geproduceerd volgens sectie 8, met behulp van de volume rendering en editor modules in 3D Slicer.
- Verander de modus van Editor naar Volume renderingen klik op een doel knop om het beeld van de hersenen naar het midden van het scherm te laten komen.
- Selecteer de Mr-T2-Brain- modus en stem de drempel af door de SHIFT -balk te verplaatsen. Ga vervolgens terug van Volume rendering naar Editor en klik op de drempel effect knop.
- Breng het label 41. Cerebrale cortex en sla de gegevens van het hersen oppervlak op als een . stl -bestand. Wijzig vervolgens de bestandsindeling van . vtk in . stlen sla het bestand op door het formulier te controleren.
10. voor verwerking voor 3D-scan gegevens
-
Voer een automatische coregistratie uit tussen 8 of 16 beelden uit 8 of 16 verschillende hoeken binnen een reeks van een scan om kleine mismatches tussen hen te corrigeren door te klikken op globale registratie opgenomen in de uitlijningsoptie en deze te integreren. Herhaal scans vanuit verschillende hoeken om het gehele hersen oppervlak te verkrijgen (Figuur 2b).
- Als de integratie tussen beelden die vanuit verschillende invalshoeken zijn gescand, niet lukt, klikt u op handmatige uitlijning en selecteert u een paar vaste afbeeldingen en een bewegende afbeelding.
- Klik op Start om de handmatige uitlijning van de afbeeldingen te starten door drie of vier gemeenschappelijke punten in verschillende afbeeldingen te selecteren. Klik vervolgens op OK. Het algoritme voor optimalisatie is de iteratieve dichtstbijzijnde punt (ICP) algoritme10. Het bevat geen niet-lineaire vervorming.
- Maak een mesh van alle uitgelijnde afbeeldingen (d.w.z. van de gegevenssets van de stippen) door alle afbeeldingen te selecteren en door op de knop mesh-generatie te klikken. Selecteer vervolgens de optie klein artistiek object om het net als de hoogste resolutie te krijgen. Sla de afbeelding vervolgens op als. stl-binair of in ASCII-indeling.
11. coregistratie van het MRI-oppervlak en het 3D-scan oppervlak
-
Open het MRI-oppervlak en voeg het samen met het 3D-scan oppervlak met behulp van de oppervlakte Verwerkingssoftware. Voer vervolgens een handmatig uitlijnings proces uit volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 10.1.1 en 10.1.2. Vervolgens slaat u deze gecorrelde oppervlakte-afbeeldingen opnieuw op (afbeelding 2a, b).
- Reinig indien nodig de individuele oppervlakte gegevens, bijvoorbeeld door kleine geluiden rond het hersengebied te wissen, vooral in het geval van de MRI-gegevens, en door gaten te vullen indien aanwezig, vooral in het geval van de 3D-scangegevens.
- Open ten slotte de oppervlakte gegevens met een gegevensanalyse software, bijvoorbeeld MATLAB, en voer en evalueer de histogrammen van de minimale afstanden tussen de twee oppervlakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beoordeelden afstanden tussen corticale oppervlakken, geproduceerd door het strippen van MRI-volume, en oppervlakken verkregen uit 3D-scans van geëxtraheerde hersenen. De modus waarden van het histogram van de afstanden zijn slechts 55 μm (Figuur 3a). Bovendien bereikt de gecumuleerde waarde bij het accumuleren van het histogram vanaf het punt waar de afstand gelijk is aan nul, 90% van de totale monster aantallen bij ~ 300 μm (Figuur 3b). Het laatste histogram van de afstanden tussen twee oppervlakken toonde een typische piek rond 50 μm. Als we deze waarde vanuit een macroscopisch oogpunt interpreteren, interessant, de nauwkeurigheid, de waarde van de modus ~ 50 μm, komt overeen met de geometrische beperking, die werd verwacht van de grootte van de Voxel van MRIs (Figuur 3a), namelijk 100 μm. Dit punt indirect suggereert dat de overlappende algoritme, ICP, tussen de MRI en 3D-scan uitstekend werkte goed en dat de geluidsniveaus van zowel de MRI en de 3D-scan werden onderdrukt als lage waarde (Figuur 2a, b)14.
Figuur 1: de experimentele stroming. (a) eerst, na het uitpakken van een brein van een muis, de hersenen werd gedropt in een borrelende snij-oplossing. (b) na het afvegen van de snij oplossing met een zachte en sterk absorberende handdoek, (c) de hersenen werden gescand op een draaitafel. (d) bij het maken van plakjes (stap 8 van het proces) werden de hersen blokken gescand op een BBB omdat het gemakkelijk is om hersen blokken naar de basis te verplaatsen voor een vibratome (stappen 7 en 8 van het proces). e) na het verkrijgen van voldoende plakjes voor het opnemen van elektrische activiteiten of voor het kleuren van de celverdelingen en andere methoden, werden de overgebleven hersen blokken opnieuw gescand (stap 10 van het proces). De dikte van de overgebleven hersen blokken verschafte extra belangrijke ondersteuningsinformatie over waar de segmenten vandaan kwamen. (f) ten slotte registreerden we de functionele activiteiten of structurele architecturen met behulp van mea of kleurings methoden en andere methoden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: de pijplijn voor gegevensverwerking. a) een voorbeeld van een corticale oppervlak dat wordt geproduceerd door het strippen van cortexen uit MRI-volumes, zoals uiteengezet in de punten 8 en 9 van het protocol. b) een voorbeeld van een corticale oppervlak dat direct door een 3D-scanner systeem wordt gescand. c) een voorbeeld van een memo die wordt gebruikt om het hersengebied te samenvatten van waaruit de afzonderlijke hersen segmenten zijn geëxtraheerd. d) een voorbeeld van wanneer het corticale segment zich op een elektrode schaaltje bevindt. e) een voorbeeld van een gekleurd hersen corticale segment door neun (rood) en GAD67 (groen). Alle informatie zal nu worden verzameld in een uniforme database. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: overlappende nauwkeurigheid tussen MRIs en 3D-scans. a) histogrammen van afstanden tussen oppervlakken die worden geëxtraheerd door peeling van MRI-volumes. De oppervlakken zijn afkomstig van 3D scan opnames. De hoofdstaaf grafiek is het gemiddelde histogram voor alle individuen, en andere gekleurde lijnen zijn resultaten voor individuele muizen (N = 6, 21 – 40 dagen oud, alle waren vrouwelijke muizen). Een algemene trend, stabiel voor alle individuen, kon worden gevonden. b) de geaccumuleerde waarde van het histogram wordt weergegeven als staafdiagram. Het samengevoegde percentage bereikte 90% bij ~ 300 μm (gestippelde lijnen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Conceptualized beeld van twee schalen van informatie die zijn geïntegreerd in één grafische gebruikersinterface (GUI). Zowel de macroscopische hersen anatomie als de informatie van het microscopische neuronale circuit werden geïntegreerd in één systeem dat wordt vertegenwoordigd door een web. De hoge mate van nauwkeurigheid, zoals weergegeven in Figuur 3, stelde ons in staat om deze twee weegschalen realistisch te integreren. De macroscopische afbeelding die hier wordt gepresenteerd, is van een schaalbare hersenen Atlas15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Parameters | Waarden |
| Herhalings tijd (TR) | 2.000 MS |
| ECHO tijd (TE) | 9 MS |
| Effectieve TE: | 45 MS |
| ZELDZAME factor | 16 |
| Grootte van acquisitie matrix | 196 x 144 x 144 |
| Gezichtsveld (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Acquisitie bandbreedte | 75 kHz |
| Oriëntatie | Axiaal (coronale oriëntatie in scanner instelling) |
| Parameters voor onderdrukking van vet | |
| vetfrequentie | 2,6 MS-Gaussiaanse-vormige π/2-puls met 1051 Hz bandbreedte |
| Spoiler gradiënt | |
| Dummy scans | 2 keer |
| Aantal gemiddelden | 3 |
| Acquisitie tijd | 2 h 42 min |
Tabel 1: de acquisitie parameters van de 3D zeldzame pulssequentie die in deze studie wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een nieuw protocol genaamd het 3D-NEO protocol om macroscopische en microscopische ruimtelijke schalen te overbruggen door twee hersen oppervlakken nauwkeuriger te overlappen dan voorheen. Oorspronkelijk waren er twee uitdagingen bij het maken van dit protocol dat de nauwkeurige overlapping van twee beelden van het hersen oppervlak mogelijk maakte en gezonde neuronale activiteiten van levende organismen vastlegt. Eerste, het was noodzakelijk om effectief te vegen snij oplossing rond de geëxtraheerde hersenen na het uitpakken van de schedel zonder het verwonden van de hersenen organisme (stap 6,2 van het Protocol). Ten tweede, aangezien de eerste en derde voorwaarden van droogheid en tijdsvertraging potentiële negatieve factoren zijn voor het levende organisme, is het ook noodzakelijk om alle stappen van het scanproces van hersen extractie naar de segment preparaten binnen 10 – 15 minuten te houden. de neuronen actief.
De mogelijkheid om met succes opnemen van hersenactiviteiten met behulp van dit protocol heeft nu de coördinatie mogelijk niet alleen van de structurele organisaties, maar ook van functionele activiteiten op de hele-hersenen kaart. Een ander positief aspect van dit protocol is dat sinds een BBB werd voorbereid, de kalibratie van de scanner naar de basis van de vibratome veel soepeler werd.
Zoals vermeld in de representatieve resultaten, toonde het histogram van afstanden tussen twee oppervlakken een piek bij ongeveer 50 μm. Hoewel we het overlappende proces hebben uitgevoerd, alsof door vanuit het macroscopische gezichtspunt te zien. Als we het resultaat uit het microscopische oogpunt interpreteren, is de 50 μm een vergelijkbare ruimtelijke schaal in de verdeling van neuronen, omdat connectiviteit waarschijnlijkheden tussen paren van corticale neuronen verval binnen ~ 100 μm16,17, zelfs binnen enkele millimeter18. Praktisch, MEA of calciumbeeldvormings studies gebruiken vaak 300 – 400 μm dikke plakjes. De hier gepresenteerde techniek zal dus een sterk objectief bewijs leveren als de plakjes goed zijn ingebed in originele Whole-Brain Maps. Nadat de overlapping nauwkeurig is bereikt, zal de aanvullende nauwkeurigheid worden verkregen louter uit de lokale informatie die onder een microscoop wordt waargenomen. Daarom, door het uitvoeren van een tweestapsoptimalisatie proces bestaande uit globale en lokale optimalisatie stappen, het zal mogelijk zijn om te bereiken een ruimtelijke resolutie gelijk semi-automatisch aan de typische grootte van een neuron in de toekomst.
Dit accurate integratie protocol biedt basistechnologie voor het genereren van verschillende hersen atlassen18,20,21 en zelfs om meer diepgaand te bestuderen van de MRI van andere primaten22,23 en Human Postmortem hersenen (hoewel het menselijk brein sulci heeft, is het mogelijk om een voldoende aantal opname punten van Gyri te krijgen). Nu ontwikkelen we ook een visuele interface om veel opgenomen data samples te integreren in één gemeenschappelijke ruimtelijke coördinaat. Een afbeelding zoals deze wordt weergegeven in Figuur 4. In het geval van zoogdier hersens zal de integratie tussen kwantitatief verschillende weegschalen ook kwalitatief nieuwe vooruitgang maken bij het begrijpen van ziektetoestanden en het evalueren van de effecten van geneesmiddelen. Over het algemeen is dit moeilijk toe te passen op vissen, reptielen en amfibieën, omdat onderzoekers het moeilijk vinden om de vorm van de geëxtraheerde dunne hersenen stabiel te houden op de vooraf geëxtraheerde vorm, en MRI-beelden van hun kleinere hersenen zullen ook relatief luidruchtiger zijn.
Het 3D-NEO-protocol is door dit onderzoek geïntroduceerd in een neurowetenschappelijk of cel biologisch onderzoeksveld, met succes een hoge nauwkeurigheid aangetoond bij het overbruggen van de macroscopische anatomie en de microscopische neuronale verdeling, inclusief de topologische architecturen van macro-en microconnectomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
M.S. is dankbaar voor de steun van al het personeel in de medische informatie engineering cursus in Graduate School of Medicine en Faculteit der Geneeskunde, en wil Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto en Doris Zakian bedanken voor hun nuttige Opmerkingen. Deze studie werd gesteund door een subsidie-in-Aid voor uitdagend verkennend onderzoek en door het leidende initiatief voor excellent Young onderzoekers (LEADER) programma om te M.S. van MEXT (het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie). De MRI-experimenten in dit werk werden uitgevoerd in de divisie voor kleine dierlijke MRI, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
