Summary
Questo articolo introduce un protocollo sperimentale utilizzando la tecnologia di scansione 3D che collega due scale spaziali: la scala spaziale macroscopica dell'anatomia dell'intero cervello immagine della risonanza magnetica a >100 m e la scala spaziale microscopica delle distribuzioni neuronali utilizzando colorazione immunohistochimica e un sistema di array multielettrodi e altri metodi (10 m).
Abstract
Il cervello umano, essendo un sistema multiscala, ha sia segnali elettrici macroscopici, che scorrono globalmente lungo spessi fasci di fibre di materia bianca, sia microscopici picchi neuronali, che si propagano lungo assoni e dendriti. Entrambe le scale completano diversi aspetti delle funzioni cognitive e comportamentali umane. A livello macroscopico, la risonanza magnetica è stata l'attuale tecnologia di imaging standard, in cui la più piccola risoluzione spaziale, la dimensione del voxel, è di 0,1-1 mm3. Inoltre, a livello microscopico, precedenti studi fisiologici erano consapevoli di architetture neuronali non uniformi all'interno di tali voxel. Questo studio sviluppa un modo efficace per incorporare accuratamente i dati microscopici in una mappa macroscopica interfacciando la ricerca scientifica biologica con i progressi tecnologici nella tecnologia di scansione 3D. Dal momento che la tecnologia di scansione 3D è stata utilizzata principalmente per l'ingegneria e la progettazione industriale fino ad ora, è stata riproposta per la prima volta per incorporare microconnettomi in tutto il cervello, preservando i picchi naturali nelle cellule cerebrali viventi. Per raggiungere questo scopo, in primo luogo, abbiamo costruito un protocollo di scansione per ottenere immagini 3D accurate da bio-organismi viventi intrinsecamente difficili da immaginare a causa di superfici umide e riflettenti. In secondo luogo, abbiamo addestrato a mantenere la velocità per prevenire la degradazione del tessuto cerebrale vivente, che è un fattore chiave per mantenere condizioni migliori e la registrazione di picchi neuronali più naturali dai neuroni attivi nel tessuto cerebrale. Due immagini di superficie corticali, estratte in modo indipendente da due diversi moduli di imaging, vale a dire immagini di superficie rm . Questa precisione è paragonabile in scala alla risoluzione microscopica delle distanze intercellulari; inoltre, è stabile tra diversi topi singoli. Questo nuovo protocollo, il nuovo protocollo 3D che incorpora la sovrapposizione (3D-NEO), collega i livelli macroscopici e microscopici derivati da questo protocollo integrativo e accelera nuove scoperte scientifiche per studiare architetture di connettività complete (cioè, ponti microcongela).
Introduction
Architetture multiscala non uniformi in varie organizzazioni fisiche e biologiche si trovano comunemente1,2. Il cervello è anche un'organizzazione di rete molto non uniforme e multiscala3,4. Varie funzioni cognitive sono codificate in tali organizzazioni di rete, tenendo cambiamenti temporali dei modelli di picco elettrici delle popolazioni neuronali in risoluzioni temporali submillisecondi. Storicamente, le reti complesse tra i neuroni sono state strutturalmente osservate in dettaglio utilizzando le tecniche di colorazione di Santiago Ramàn y Cajal da oltre 150 anni fa5. Per osservare i comportamenti di gruppo dei neuroni attivi, i ricercatori hanno sviluppato varie tecnologie di registrazione6,7,8, e i recenti sviluppi significativi di tali tecnologie ci hanno permesso di registrare attività elettriche da un numero enorme di neuroni contemporaneamente. Inoltre, da tali attività funzionali, gli scienziati sono riusciti a ricostruire reti di interazioni causali tra un numero enorme di neuroni e hanno dichiarato l'architettura topologica delle loro complesse interazioni 'microconconnectoma'9 . Osservazioni macroscopiche del cervello consentono anche per quanto riguarda un intero cervello come un'organizzazione di rete, perché molte regioni del cervello sono collegati da più fibre-bundle. L'incorporazione di microconsomi nella mappa cerebrale globale ha ancora chiare limitazioni all'interno degli attuali progressi tecnologici, motivo per cui questo protocollo di incorporamento è così importante. Tuttavia, ci sono molte sfide per lo sviluppo del protocollo di incorporamento. Per esempio, al fine di osservare le attività di circuiti neuronali locali viventi in regioni del cervello puramente isolate, le fette di cervello devono essere prodotte per le registrazioni in vitro. Inoltre, le registrazioni da fette di cervello per le registrazioni in vitro sono ancora una scelta importante per almeno due motivi. In primo luogo, non è ancora facile osservare le attività di molti singoli neuroni viventi contemporaneamente da regioni cerebrali più profonde di 1,5 mm e in alta risoluzione temporale (<1 ms). In secondo luogo, quando speriamo di conoscere l'architettura interna di un circuito neuronale locale, dobbiamo fermare tutti gli input provenienti da regioni cerebrali esterne per eliminare i fattori di confusione. Al fine di identificare le direzioni e le posizioni delle fette di cervello prodotte, sarà ulteriormente necessario integrare le posizioni spaziali di queste fette di cervello prodotte utilizzando le coordinate. Ci sono, tuttavia, alcuni modi sistematici e affidabili per fare fette di cervello in modo organizzato10,11. Qui viene introdotto un nuovo protocollo di coregistrazione, utilizzando la tecnologia di scansione 3D per la ricerca neuroscientifica al fine di fornire un protocollo integrativo. Questo protocollo agisce per coordinare micro e macroscale e incorporare i microdati MEA (multielettrode array)12,13 e i dati di colorazione su uno spazio di risonanza magnetica macroscopico attraverso superfici di scansione 3D di cervelli estratti, cervelli non registrati in modo invasivo. Sorprendentemente, questo ha mostrato un errore di distanza di soli 50 dollari come valore di modalità dell'istogramma. Di conseguenza, i valori di modalità delle distanze minime tra due superfici tra la superficie della risonanza magnetica e la superficie 3D scansionata erano quasi 50 m per tutti e sei i topi, il che è un numero adatto durante il controllo della comunanza tra gli individui. La larghezza tipica della fetta ha avuto un'attività di picco registrata di circa 300 m.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Kyoto.
1. Animali (giorno 1)
- Preparare i topi c57BL/6J femminili (n - 6, di età compresa tra 3 e 5 settimane).
NOT: Questo protocollo è applicabile a tutte le specie di roditori.
2. Impostazioni RM (giorno 1)
- Mettere il mouse in una scatola di anestesia acrilica posta su un tappetino riscaldatore regolato a 37 gradi centigradi utilizzando un controller di smizzo riscaldatore.
- Anestesizzare il mouse con 2% isoflurane in aria che scorre attraverso la scatola ad una portata di 1,4 L/min utilizzando un sistema di anestesia, che è composto da un vaporizzatore isoflurane, misuratore di flusso d'aria, e compressore d'aria.
- Dopo l'induzione dell'anestesia, posizionare il topo in una culla compatibile con la risonanza magnetica nella posizione prona. Controllare se l'anestesia è sufficiente tagliando un dito del mouse con una pinzetta per vedere se non sente dolore.
- Fissare la testa del mouse con la barra dei denti e la maschera del viso dotata della culla. Mantenete quindi l'anestesia con l'1%-1,5% di isoflurane in aria a 1,4 L/min attraverso la maschera del viso.
- Inserire una sonda di temperatura tetrgama nel retto del mouse e posizionare un sensore di respirazione sensibile alla pressione sul retro del mouse.
- Trasferire la culla sul foro di un magnete di risonanza magnetica. Regolare la concentrazione dell'isoflurane a circa l'1%-1,5% per garantire una profondità stabile e riproducibile di anestesia. Monitorare se la temperatura corporea è controllata tra i 33,35 gradi centigradi e la frequenza respiratoria compresa tra 0,5,1,3 Hz durante l'intero periodo degli esperimenti di risonanza magnetica, utilizzando un sistema di monitoraggio (Tabella deimateriali) per i parametri fisiologici dei piccoli animali con software dedicato (Tabella dei Materiali).
- Utilizzando il valore misurato della temperatura rettale, regolare la temperatura corporea controllando la temperatura dell'aria calda fornita nel magnete foro da un sistema di riscaldamento dotato del sistema di monitoraggio.
3. Acquisizioni MRI (giorno 1)
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Preparativi per la risonanza magnetica 3D T2 ad alta risoluzione
- Acquisire tre immagini di risonanza magnetica (MR) in tre piani ortogonali (assiali, coronali e sagittale) per controllare la posizione del topo.
- Riferendosi a queste immagini, regolare la posizione del mouse spostando la culla in modo che il centro del cervello del mouse è posizionato al centro del risonatore così come al centro delle bobine di gradiente in direzione assiale.
- Regolare il sistema DI risonanza magnetica regolando l'omogeneità del campo magnetico statico (shimming) e la frequenza di base e calibrando la potenza della radiofrequenza (RF).
- Acquisire immagini a bassa risoluzione 2D multifetta T2 ponderate T2 (T2W) con orientamenti coronali e sagittali. Sulla base di queste immagini, determinare il campo visivo (FOV) per una scansione RM T2W 3DW ad alta risoluzione.
- Eseguire lo shimming localizzato utilizzando un algoritmo di shim automatico FASTMAP. Per il protocollo FASTMAP, selezionare un'area rettangolare che copra l'intero cervello. Dopo il completamento dello shimming localizzato, confermare l'inomogeneità del campo B0 all'interno dell'area del cervello mediante uno spettro localizzato di 1H utilizzando la spettroscopia risolta in punti (PRESS).
- Acquisire immagini T2W 3D a bassa risoluzione per assicurarsi che le impostazioni di scansione per la risonanza magnetica T2W 3D ad alta risoluzione siano appropriate controllando la posizione appropriata dell'FOV, l'assenza di artefatti avvolgenti (aliasing) e l'efficiente soppressione dei segnali di grasso.
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Sequenza di impulsi di imaging
- Dopo i preparativi descritti sopra, acquisire immagini T2W 3D ad alta risoluzione dell'intero cervello del mouse, utilizzando una rapida acquisizione con la sequenza di miglioramento del rilassamento (RARE).
NOT: In questo articolo sono stati condotti esperimenti di risonanza magnetica su un foro orizzontale 7 T, 210 mm, scanner preclinico, dotato di un sistema di gradiente di 440 mT/m al tempo di rampa 100 . Un risonatore del volume della quadratura con un diametro interno di 35 mm è stato utilizzato per l'eccitazione RF e la ricezione del segnale. I dati della risonanza magnetica sono stati acquisiti con un software di operazione dedicato. I parametri di acquisizione della sequenza di impulsi RARE 3D utilizzata in questo studio sono riassunti nella Tabella 1.
- Dopo i preparativi descritti sopra, acquisire immagini T2W 3D ad alta risoluzione dell'intero cervello del mouse, utilizzando una rapida acquisizione con la sequenza di miglioramento del rilassamento (RARE).
4. Preparazione di soluzioni sperimentali (giorno 2)
- Preparare 500 mL di una soluzione di taglio a freddo ghiaccio (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM di glucosio, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 11,6 m di sodio ascorbate, 3,1 mM di pyruvate di sodio e 100 mM di cloruro di colina, bollito con 95% O2 e 5% CO2). Regolare il pH a 7,3-7,4.
- Preparare 1 L del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 15 mM di glucosio, 25 mM NaHCO3e 2 mM CaCl2, bolla con 95% O2 e 5% CO2). Regolare il pH su 7.3–7.4.
5. Preparazione dell'attrezzatura (giorno 2)
- Preparare un magnete "anello" di 6,6 cm2 quadrati, 0,5 cm di spessore e, in primo luogo, posizionare nastro nero e, secondo, nastro chirurgico sull'anello (Figura 1c-2). Si noti che questo materiale è chiamato una base di blocco cerebrale (BBB), e tenerlo freddo su blocchi di ghiaccio.
NOT: Successivamente, i nastri saranno attaccati alla stazione di taglio con blocchi cerebrali per il vibratoma. L'anello quadrato viene utilizzato come base inferiore della BBB per soddisfare due scopi, vale a dire migrare i blocchi cerebrali senza problemi dalla stazione di scansione 3D a un vibratoma e misurare con precisione le altezze dei blocchi cerebrali nella fase di scansione. - Impostare il BBB con un giradischi automatico. Accendere lo scanner e il giradischi. Avviare il software di elaborazione delle immagini.
-
Precedendo tutti gli esperimenti, eseguire calibrazioni delle telecamere e il giradischi collegato di una proiezione di luce strutturata e scanner 3D desktop-tipo.
- Accendere il proiettore centrale, le due telecamere e il giradischi. Quindi, aprire il software. Nel software, fare clic su Configurazione ottica e selezionare l'area dell'immagine come 100 x 80 e i numeri della griglia come 100 x 100. Quindi, la calibrazione della fotocamera inizia secondo i seguenti quattro passaggi.
- Per l'impostazione del proiettore, posizionare il foglio di calibrazione sulla banchiera e posizionare la scheda di calibrazione sul foglio di calibrazione per regolare il punto di fissaggio dell'area di misura al centro del foglio e l'orientamento verso la parte anteriore. Regolare la distanza tra il proiettore e la scheda a circa 200 mm. Allentare le viti fissando le due manopole e ruotare le manopole per regolare la sensibilità della luce e la messa a fuoco delle due telecamere. Quindi, fare clic su freccia per andare al passaggio successivo.
- Per orientare le telecamere, allentare le viti fissando le due telecamere stesse e spostare le posizioni e le rotazioni per sovrapporsi alla linea centrale sulla scheda di calibrazione, la linea verticale e la croce gialla proiettata dal proiettore. Fissare le telecamere e fare di nuovo clic su Freccia. Quindi, lo schermo diventerà scuro.
- Per mettere a fuoco le telecamere, dopo aver allentato le viti di fissaggio delle manopole, aumentare la sensibilità della luce e regolare nuovamente la messa a fuoco. Quindi, fare clic su freccia per andare al passaggio successivo.
- Per il valore F e il grado di esposizione (della fotocamera), regolare nuovamente la sensibilità della luce appena sotto il punto in cui la regione rossa scompare. Quindi, fare di nuovo clic su freccia e fare clic su Inizio calibrazionee scegliere Sì se viene richiesto Hai completato l'impostazione ottica?
- Fare clic su Inizializza la calibrazionee verificare se i valori dei pixel sono normalizzati tra 0 e 255. Quindi, fare clic su Continua.
- Seguendo le posizioni suggerite, registrare le immagini di nove diverse angolazioni relative dello scanner e della scheda di calibrazione e terminare dopo aver confermato il processo di calibrazione e, infine, fare clic su Aggiorna della calibrazione.
- Sostituire la scheda di calibrazione per il giradischi e fare clic sulla calibrazione tavola girevole.
NOT: Ora, tutte le calibrazioni sono finite.
- Accendere il proiettore centrale, le due telecamere e il giradischi. Quindi, aprire il software. Nel software, fare clic su Configurazione ottica e selezionare l'area dell'immagine come 100 x 80 e i numeri della griglia come 100 x 100. Quindi, la calibrazione della fotocamera inizia secondo i seguenti quattro passaggi.
6. Scansione della superficie del cervello, affettatura e registrazione MEA (giorno 2)
- Anestesizza un topo con l'1%-1,5% di isoflurane e decapita il topo. Utilizzare un bisturi per aprire la pelle ed esporre il cranio.
- Tagliare il cuoio capelluto del topo anestetizzato lungo la sutura sagittale con un coltello chirurgico e tagliare il cranio in direzioni diagonali dal punto lambda ad un punto un po 'di fronte al bregma utilizzando forbici chirurgiche. Quindi, staccare delicatamente il cranio dal cervello utilizzando una pinzetta curva.
- Utilizzare una spatola per sollevare il cervello e trasferirlo in un piatto Petri (100 mm x 20 mm) con soluzione di taglio ghiacciato (preparata al punto 4.1). Aria di flusso contenente 95% O2 e 5% CO2 da una bomba a gas esterna con una velocità di rotazione controllata della pompa (4,0 rpm) per generare piccole bolle nella soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1a).
- Dopo 1–2 min, mettere il cervello su un panno in microfibra la cui superficie è leggermente coperta da un setaccio di farina e pulire il liquido dalla superficie del cervello, utilizzando delicatamente il panno in microfibra (Figura 1b).
- Mettere il cervello con il suo aspetto dorsale sul supporto campione sul BBB, e anche mettere la BBB al centro del giradischi automatico.
- Scurire la stanza durante la scansione 3D ed eseguire una scansione 3D sul giradischi. Per verificare se la scansione 3D funziona bene, fare clic su Scansione 3D selezionando l'angolo tra due scatti come 22,5, l'angolo iniziale come 0 e l'angolo finale come 360 (Figura 1c-1).
- Spostare il cervello a un piatto Petri, e bollo il cervello nella soluzione di taglio per circa 10 s.
- Tagliare il cervello in due blocchi al centro del piano coronale utilizzando un coltello chirurgico, e spostare i due blocchi cerebrali delicatamente sulla superficie piatta utilizzando una spatola chirurgica.
- Attaccare i blocchi cerebrali del BBB utilizzando colla istantanea, e delicatamente e con attenzione pulire il fluido dalla superficie del cervello entro 1–2 min, utilizzando di nuovo un panno in microfibra. Quindi, eseguire nuovamente una scansione 3D (Figura 1c-2).
- Fissare il nastro nero che copre il centro del BBB al centro della fase di taglio per un vibratome (Figura 1d).
- Versare la soluzione di taglio nella fase di taglio e impostare la fase di taglio sul vibratoma. Regolare la velocità di taglio e l'ampiezza. Fare 2-5 fette coronali (300 m di spessore) dai due blocchi cerebrali. Mantenere la soluzione nella fase di taglio bubbling, se possibile (Figura 1e).
- Fissare una lama al supporto della lama del vibratoma e ottimizzare la velocità di taglio, la frequenza e l'ampiezza delle vibrazioni del sistema impostandole come 12,7 mm/min per la velocità, 87-88 Hz per la frequenza e 0,8–1,0 mm per la larghezza dell'oscillazione. Quando è necessario un taglio attento, rallentare la velocità al livello 2–3.
- Durante il taglio delle fette di cervello, registrare la coordinata suddivisa nel formato, inclusa la coordinata anteriore-posteriore, l'emisfero e altre condizioni (Figura 2c).
- Trasferire delicatamente le fette di cervello in un becher pieno di ACSF preriscaldato (34 gradi centigradi) utilizzando una pipetta di plastica spessa, e incubarle nel becher a 34 gradi centigradi per 1 h. Durante questo periodo, eseguire una scansione 3D dei restanti blocchi cerebrali nella fase di taglio (Figura 1c-2).
- Impostare un chip MEA su un'unità di registrazione. Collegare il chip a una pompa peristaltica utilizzando due tubi. Utilizzare un tubo per guidare lo stesso ACSF nel chip MEA e nell'altro tubo per guidare ACSF fuori dal chip MEA.
- Attaccare due aghi (0,60 mm x 19 mm), collegati alle punte dei due tubi, alla parte superiore della parete del chip MEA, e fissare le loro posizioni con le loro punte seguendo la parete interna del chip MEA. Impostare la portata dell'ACSF su 4,1 rpm.
- Dopo 1 h è passato, spostare una fetta sul chip utilizzando una pipetta di plastica spessa, e impostare la posizione utilizzando un pennello morbido. Quindi, avviare il processo di registrazione delle attività neuronali (Figura 2-d).
7. Colorazione immunosofiche (giorni 3 e 4)
- Al termine della registrazione MEA, trasferire le fette a tubi da 1,5 mL riempiti con il 4% di paraformaldeide (PFA) in salina con buffer fosfato (PBS). Incubarli durante la notte a 4 gradi centigradi. Quindi, rimuovere la soluzione PFA 4% e lavare le fette 3x con PBS per un totale di 5 min.
NOT: Se necessario, incorporare le fette nel 20% gelatina/PBS e resezione la fetta per renderla più sottile di 50 m, utilizzando il vibratoma. - Preparare la soluzione di recupero dell'antigene (10 mM di citrato di sodio, pH 6.0). Rimuovere il PBS dall'ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione di recupero dell'antigene.
- Far bollire l'acqua in una pentola elettrica e incubare i tubi con le fette per 20 min a 95-98 gradi centigradi nella pentola, seguita dal raffreddamento naturale.
- Preparare una salina da 50 mM con buffer Tris e aggiungere l'1% di Na bisulfite (1% della soluzione Na bisulfite-Tris). Regolare il pH a 7,5. Quindi lavare le fette con la soluzione Na bisulfite-Tris dell'1% Per 5 min a temperatura ambiente .
- Preparare la soluzione di blocco aggiungendo il 4% del siero di capra normale e l'ethoxylalate dell'ottilfenolo dello 0,5% alla soluzione 1% Na bisulfite-Tris.
- Rimuovere la soluzione 1% Na bisulfite-Tris dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione di blocco. Incubare per 2 h a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione anticorpale primaria aggiungendo 1% siero di capra normale e 0,5% Triton X-100 alla soluzione 1% Na bisulfite-Tris e diluendo gli anticorpi primari. Utilizzare le seguenti concentrazioni di anticorpi primari: 1:800 di topo anti-GAD67 e 1:500 di coniglio anti-NeuN.
- Rimuovere la soluzione 1% Na bisulfite-Tris dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione anticorpale primaria. Incubarlo per una notte a 4 gradi centigradi.
- Preparare una salina da 50 mM con buffer Tris e aggiungere 8,5 g/L NaCl (soluzione Tris-NaCl). Dissacrare il pH a 7,5. Quindi, lavare le fette 3x con la soluzione Tris-NaCl (20-25 gradi centigradi) per un totale di 5 min.
- Preparare la seconda soluzione anticorpale aggiungendo il 3% del siero di capra normale e lo 0,3% Triton X-100 alla soluzione Tris-NaCl e diluindo gli anticorpi secondari. Utilizzare le seguenti concentrazioni di anticorpi secondari: 1:500 di capra anti-topo e 1:500 di capra anti-coniglio.
- Rimuovere la soluzione Tris-NaCl dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione anticorpale secondaria. Incubarlo per 2 h a temperatura ambiente. Quindi, lavare le fette 3x con la soluzione Tris-NaCl per 5 min in totale.
- Posizionare le fette sulla diapositiva utilizzando un pennello piccolo e applicare supporti di montaggio e un coverslip. Esaminare i vetrini con un microscopio confocale. Scattare immagini della superficie di una sezione (Figura 2e).
8. Elaborazione dei dati RM per estrarre volumi corticali
- Installare il software libero FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Preparare le immagini RM acquisite nella sezione 3.
- Modificare il formato dell'immagine utilizzando il comando fslchfiletype NIFTI_PAIR_G. Espandere l'immagine del cervello per renderla grande come un cervello umano utilizzando il comando fslcreatehd e, se necessario, modificare l'orientamento utilizzando fslorient con l'opzione -setqformcode 1. Dopodiché, recuperare il formato di file originale utilizzando fslchfiletype NIFTI_G Il comando esatto è il seguente.
fslchfiletype NFTI_PAIR [immagine di input].nii.gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [immagine di input].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [immagine di input].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_G - Digitare fsl per aprire il software FSL. Estrarre i cervelli utilizzando il comando di scommessa dall'interfaccia utente grafica (GUI), ma non sbucciare troppo. Quindi, controllare attentamente le soglie di intensità frazionaria, ... e le coordinate del centro della sfera iniziale della superficie cerebrale. I valori ottimali sono diversi per i singoli dati.
- Ridimensionare l'immagine del cervello alla dimensione originale del cervello del mouse, utilizzando la stessa procedura come nel passaggio 8.2. Il comando esatto è come segue:
fslchfiletype NFTI_PAIR [immagine di input].nii.gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 0 4 [immagine di input].hdr.gz
fslorient –setqformmcode 1 [immagine di input].hdr.gz
fslchfiletype NIFTI_G - Coregistrare tutte le immagini del cervello utilizzando il comando flirt, e produrre un'immagine media del cervello utilizzando l'opzione -add e l'opzione -div del comando fslmaths.
fslmaths [immagine del cervello 1] –aggiungere ... –aggiungere [immagine del cervello N] –div N [nome immagine mediata] –odt float - Rendere il cervello medio più pulito utilizzando l'opzione -thr del comando fslmaths. Selezionare quindi un valore soglia ottimale adattivo ai singoli casi.
fslmaths [nome immagine media] –thr [valore, ad esempio 5000] [immagine media con soglia] - Infine, rimodella l'immagine media del cervello nella coordinata di un individuo usando di nuovo il comando flirt. Quindi, preparare corteccia estratti abbastanza pulite (Figura 2a).
NOTA: Purtroppo, il bulbo olfattivo e il cervelletto non saranno perfetti nella superficie cerebrale ricostruita dai volumi di risonanza magnetica a causa delle limitazioni essenziali del software FSL per sbirciare tutte le parti del cervello, tra cui bulbo olfattivo e cervelletto.
9. Elaborazione dell'immagine RMA su superfici corticali a strisce
- Scaricare un altro software gratuito, 3D Slicer (https://download.slicer.org/).
- Aprire le immagini MR dei cervelli estratti (fare clic su File e selezionare Aggiungidati) prodotte in base alla sezione 8, utilizzando i moduli Volume Rendering e Editor in 3D Slicer.
- Modificare la modalità da Editor a Rendering volumee fare clic su un pulsante di destinazione per fare in modo che l'immagine del cervello arrivi al centro dello schermo.
- Selezionare la modalità MR-T2-cervello e regolare la soglia spostando la barra Maiusc. Quindi, tornare da Rendering volume a Editor e fare clic sul pulsante Soglia effetto.
- Applicare l'etichetta 41. La corteccia cerebrale e salva i dati della superficie cerebrale come file .stl. Quindi, modificare il formato del file da .vtk a .stle salvare il file controllando il modulo.
10. Pre-elaborazione dei dati di scansione 3D
-
Eseguire una coregistrazione automatica tra 8 o 16 immagini scattate da 8 o 16 diverse angolazioni all'interno di una sequenza di una scansione per correggere piccole mancate corrispondenze tra di esse facendo clic su Registrazione globale inclusa nell'opzione Allineamento e integrarle. Ripetere le scansioni da diverse angolazioni per ottenere l'intera superficie del cervello (Figura 2b).
- Se l'integrazione tra immagini digitalizzate da diverse angolazioni non è riuscita, fare clic su Allineamento manuale e selezionare una coppia di un'immagine fissa e un'immaginein movimento .
- Fare clic su Avvia per avviare l'allineamento manuale delle immagini selezionando tre o quattro punti comuni in immagini diverse. Quindi, fare clic su OK. L'algoritmo di ottimizzazione è l'algoritmo iterativo del punto più vicino (ICP)10. Non include una deformazione non lineare.
- Creare una mesh di tutte le immagini allineate (cioè dei set di dati dei punti) selezionando tutte le immagini e facendo clic sul pulsante Generazione mesh. Quindi, selezionare l'opzione Piccolo oggetto artistico per ottenere la mesh con la risoluzione più alta. Quindi, salvare l'immagine come binario .stl o in formato ASCII.
11. Registrazione della superficie RM e della superficie di scansione 3D
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Aprire la superficie RM e unirla alla superficie di scansione 3D utilizzando il software di elaborazione della superficie. Quindi, eseguire un processo di allineamento manuale utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 10.1.1 e 10.1.2. Quindi, salvare nuovamente queste immagini di superficie coregistrate (Figura 2a,b).
- Se necessario, pulire i singoli dati di superficie, ad esempio, cancellando piccoli rumori che circondano la regione del cervello, in particolare nel caso dei dati della risonanza magnetica, e riempiendo i fori se esistono, soprattutto nel caso dei dati di scansione 3D.
- Infine, aprire i dati di superficie con un software di analisi dei dati, ad esempio MATLAB, ed eseguire e valutare gli istogrammi delle distanze minime tra le due superfici.
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Representative Results
Abbiamo valutato le distanze tra le superfici corticali, prodotte dallo stripping del volume della risonanza magnetica, e le superfici ottenute da scansioni 3D di cervelli estratti. I valori di modalità dell'istogramma delle distanze sono solo 55 m (Figura 3a). Inoltre, quando si accumula l'istogramma dal punto in cui la distanza è uguale a zero, il valore accumulato raggiunge il 90% dei numeri di campione totali a 300 m (Figura 3b). L'istogramma finale delle distanze tra due superfici ha mostrato un picco tipico di circa 50 m. Se interpretiamo questo valore da un punto di vista macroscopico, è interessante notare che la precisione, il valore della modalità, 50 m, corrisponde al limite geometrico, che ci si aspettava dalle dimensioni voxel delle risonanze magnetiche (Figura 3a), vale a dire, 100 m. Questo punto suggerisce indirettamente che l'algoritmo sovrapposto, ICP, tra la risonanza magnetica e la scansione 3D ha funzionato superbamente bene e che i livelli di rumore sia della risonanza magnetica che della scansione 3D sono stati soppressi come valore basso (Figura 2a, b)14.
Figura 1: Il flusso sperimentale. (a) In primo luogo, dopo aver estratto un cervello da un topo, il cervello è stato rilasciato in una soluzione di taglio bollente. (b) Dopo aver pulito la soluzione di taglio con un asciugamano morbido e altamente assorbente, (c) il cervello è stato scansionato su un giradischi. (d) Nel fare fette (passaggio 8 del processo), i blocchi cerebrali sono stati scansionati su un BBB perché è facile spostare i blocchi cerebrali alla base per un vibratoma (passaggi 7 e 8 del processo). (e) Dopo aver ottenuto un numero sufficiente di fette per la registrazione delle attività elettriche o per la colorazione delle distribuzioni cellulari e di altri metodi, i restanti blocchi cerebrali sono stati nuovamente scansionati (passaggio 10 del processo). Lo spessore dei restanti blocchi cerebrali ha fornito ulteriori importanti informazioni di supporto di dove sono state prelevate le fette. (f) Infine, abbiamo registrato le attività funzionali o le architetture strutturali utilizzando MEA o metodi di colorazione e altri metodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pipeline di elaborazione dati. (a) Esempio di superficie corticale prodotta dalla corteccia stripping dai volumi di risonanza magnetica, come spiegato nelle sezioni 8 e 9 del protocollo. (b) Esempio di superficie corticale scansionata direttamente da un sistema di scanner 3D. (c) Esempio di memo utilizzato per riassumere la regione del cervello da cui sono state estratte le singole fette di cervello. (d) Un esempio di quando la fetta corticale si trova su un piatto di elettrodi. (e) Un esempio di una fetta corticale del cervello macchiata di NeuN (rosso) e GAD67 (verde). Tutte le informazioni verranno ora raccolte in un database unificato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Precisione di sovrapposizione tra risonanza magnetica e scansioni 3D. (a) Istogrammi delle distanze tra le superfici estratte dal peeling dai volumi di risonanza magnetica. Le superfici provenivano da registrazioni di scansione 3D. Il grafico a barre principale è l'istogramma medio per tutti gli individui, e altre linee colorate sono risultati per i singoli topi (N - 6, di età compresa tra 21 e 40 giorni, tutti erano topi di sesso femminile). Si potrebbe trovare una tendenza generale, stabile per tutti gli individui. (b) Il valore accumulato dell'istogramma viene visualizzato come grafico a barre. La percentuale accumulata ha raggiunto il 90% a 300 m (linee tratteggiate). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine concettualizzata di due scale di informazioni integrate in un'unica interfaccia utente grafica (GUI). Sia l'anatomia macroscopica del cervello che le informazioni microscopiche del circuito neuronale sono state integrate in un sistema rappresentato da una rete. L'elevato grado di precisione, illustrato nella Figura3, ci ha permesso di integrare queste due scale in modo realistico. L'immagine macroscopica qui presentata proviene da un atlante cerebrale scalabile15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametri | Valori |
| Tempo di ripetizione (TR) | 2.000 ms |
| Tempo di eco (TE) | 9 ms |
| TE efficace: | 45 ms |
| Fattore RARE | 16 |
| Dimensioni della matrice di acquisizione | 196 x 144 x 144 |
| Campo visivo (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Larghezza di banda acquisizione | 75 kHz |
| orientamento | Assia (orientamento coronale nell'impostazione dello scanner) |
| Parametri di soppressione del grasso | |
| frequenza dei grassi | Impulso a forma di 2,6 ms-gaussian a forma di/2 con larghezza di banda 1051 Hz |
| gradiente spoiler | |
| scansioni fittizie | 2 volte |
| Numero di medie | 3 (COM del nome |
| Tempo di acquisizione | 2 h 42 min |
Tabella 1: I parametri di acquisizione della sequenza di impulsi RARE 3D utilizzata in questo studio.
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Discussion
Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo chiamato protocollo 3D-NEO per colmare scale spaziali macroscopiche e microscopiche sovrapponendo due superfici cerebrali in modo più accurato rispetto a prima. Originariamente, c'erano due sfide nella creazione di questo protocollo che ha reso possibile la sovrapposizione accurata di due immagini di superficie del cervello e la registrazione di attività neuronali sane da organismi viventi. In primo luogo, è stato necessario pulire efficacemente la soluzione di taglio che circonda il cervello estratto dopo averlo estratto dal cranio senza ferire l'organismo cerebrale (passaggio 6.2 del protocollo). In secondo luogo, poiché la prima e la terza condizione di secchezza e ritardo di tempo sono potenziali fattori negativi per l'organismo vivente, la finitura di tutte le fasi del processo di scansione dall'estrazione del cervello ai preparati a fette entro 10-15 min è stato necessario anche mantenere i neuroni attivi.
La capacità di registrare con successo le attività cerebrali utilizzando questo protocollo ha reso possibile il coordinamento non solo delle organizzazioni strutturali, ma anche delle attività funzionali sulla mappa dell'intero cervello. Un altro aspetto positivo di questo protocollo è che da quando è stato preparato un BBB, la calibrazione dallo scanner alla base del vibratoma è diventata molto più liscia.
Come accennato nei risultati rappresentativi, l'istogramma delle distanze tra due superfici ha mostrato un picco a circa 50 m. Anche se abbiamo eseguito il processo di sovrapposizione, come se vedendo dal punto di vista macroscopico. Se interpretiamo il risultato dal punto di vista microscopico, il 50 m è una scala spaziale comparabile nella distribuzione dei neuroni, poiché le probabilità di connettività tra coppie di neuroni corticali decadono entro 100 ,17, anche all'interno di diversi millimetri18. In pratica, gli studi di imaging MEA o calcio spesso utilizzano fette spesse 300-400 m. Così, la tecnica qui presentata fornirà una forte prova oggettiva se le fette sono correttamente incorporate nelle mappe originali dell'intero cervello. Dopo che la sovrapposizione è stata raggiunta con precisione, ulteriore precisione sarà acquisita esclusivamente dalle informazioni locali osservate al microscopio. Pertanto, eseguendo un processo di ottimizzazione in due fasi costituito da passaggi di ottimizzazione globale e locale, sarà possibile raggiungere una risoluzione spaziale equiparata semi-automaticamente alle dimensioni tipiche di un neurone in futuro.
Questo protocollo di integrazione accurata fornisce una tecnologia di base per generare vari atlanti cerebrali18,20,21 e anche per studiare più approfonditamente la risonanza magnetica di altri primati22,23 e umani cervelli post-mortem (anche se il cervello umano ha sulci, è possibile ottenere un numero sufficiente di punti di registrazione da gyri). Ora, stiamo anche sviluppando un'interfaccia visiva per integrare molti campioni di dati registrati in un'unica coordinata spaziale comune. Una figura immagine come questa è illustrata nella Figura 4. Nei casi di cervelli di mammiferi, l'integrazione tra scale quantitativamente diverse farà anche nuovi progressi qualitativamente nella comprensione degli stati della malattia e nella valutazione degli effetti della droga. In generale, questo sarà difficile da applicare a pesci, rettili e anfibi, perché i ricercatori troveranno difficile mantenere la forma del cervello sottile estratto stabile alla sua forma pre-estratta, e le immagini MRI dei loro cervelli più piccoli saranno anche relativamente più rumorose.
Il protocollo 3D-NEO è stato introdotto da questa ricerca in un campo di ricerca neuroscientifica o biologico cellulare, dimostrando con successo un'elevata precisione nel ponte tra anatomia macroscopica e distribuzione neuronale microscopica, architetture topologiche di macro e microconnettomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
M.S. è grata per il supporto di tutto il personale nel corso di ingegneria dell'informazione medica presso la Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, e vuole ringraziare il professor Tetsuya Takakuwa, il prof. Commenti. Questo studio è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa impegnativa e dal programma Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) a M.S. da MEXT (The Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology). Gli esperimenti di risonanza magnetica in questo lavoro sono stati eseguiti nella Divisione per la risonanza magnetica dei piccoli animali, Centro di supporto per la ricerca medica, Graduate School of Medicine, Università di Kyoto, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
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