Summary
Denna artikel introducerar ett experimentellt protokoll med 3D-scanning teknik överbrygga två rumsliga skalor: den makroskopiska rumsliga skalan av hela hjärnans anatomi avbildas av MRT vid > 100 μm och den mikroskopiska rumsliga skalan av neuronala distributioner med hjälp av immunohistokemi färgning och en multielektrod array system och andra metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den mänskliga hjärnan, som är ett flerskalig system, har både makroskopiska elektriska signaler, globalt flyter längs tjocka vita partiklar fiber buntar, och mikroskopiska neuronala spikar, förökningsmaterial längs axoner och dendriter. Båda skalorna kompletterar olika aspekter av människans kognitiva och beteendemässiga funktioner. Vid makroskopisk nivå har MRI varit den nuvarande standarden Imaging Technology, där den minsta rumsliga upplösningen, Voxel storlek, är 0,1-1 mm3. Även på mikroskopisk nivå, tidigare fysiologiska studier var medvetna om icke-enhetliga neuronala arkitekturer inom sådana voxels. Denna studie utvecklar ett kraftfullt sätt att korrekt bädda in mikroskopiska data i en makroskopisk karta genom att gränssnitt biologisk vetenskaplig forskning med tekniska framsteg i 3D-scanning teknik. Eftersom 3D-scanning teknik har mestadels använts för ingenjörskonst och industridesign fram till nu, det är återanvänt för första gången att bädda in microconnectomes i hela hjärnan och samtidigt bevara naturliga tillspikning i levande hjärnceller. För att uppnå detta syfte, först, konstruerade vi ett skannings protokoll för att få exakt 3D-bilder från levande bio-organismer till sin natur utmanande att bilden på grund av fuktiga och reflekterande ytor. För det andra, vi utbildade för att hålla hastigheten för att förhindra nedbrytning av levande hjärnvävnad, vilket är en nyckelfaktor för att behålla bättre villkor och registrera mer naturliga neuronala spikar från aktiva nervceller i hjärnvävnaden. Två kortikala yta bilder, oberoende ur två olika Imaging moduler, nämligen MRI och 3D-skanner yta bilder, överraskande Visa ett avstånds fel på endast 50 μm som läge värdet av histogrammet. Denna noggrannhet är jämförbar i skala till den mikroskopiska upplösningen av intercellulära avstånd; Dessutom är det stabilt bland olika enskilda möss. Detta nya protokoll, 3D-romanen bädda överlappande (3D-NEO) protokoll, broar makroskopiska och mikroskopisk nivåer som härrör från detta integrerande protokoll och påskyndar nya vetenskapliga rön att studera omfattande anslutning arkitekturer (dvs. mikroconnectome).
Introduction
Icke-enhetliga flerskaliga arkitekturer på olika fysiska och biologiska organisationer finns vanligtvis1,2. Hjärnan är också en mycket NonUniform och Multiscale knyter kontakt organisation3,4. Olika kognitiva funktioner kodas i sådana nätverk organisationer, hålla temporala förändringar av elektriska Spike mönster av neuronala populationer i submillisekund temporala resolutioner. Historiskt sett, de komplexa nätverken bland nervceller var strukturellt observerats i detalj med hjälp av färgning tekniker av Santiago Ramón y Cajal från över 150 år sedan5. För att observera grupp beteenden av aktiva nervceller, forskare har utvecklat olika inspelningsteknik6,7,8, och den senaste tidens betydande utvecklingen av sådan teknik har gjort det möjligt för oss att spela in elektriska aktiviteter från ett enormt antal nervceller samtidigt. Dessutom, från sådan funktionell verksamhet, har forskarna lyckats rekonstruera nätverk av kausala interaktioner mellan ett stort antal nervceller och har förklarat den topologiska arkitekturen i deras komplexa interaktioner "microconnectome"9 . Makroskopiska observationer av hjärnan också möjliggöra om en hel hjärna som en nätverksorganisation eftersom många hjärnregioner är anslutna med flera fiber-buntar. Inbäddning av microconnectomes i den globala hjärn kartan har fortfarande tydliga begränsningar inom nuvarande teknologiska framsteg, varför detta inbäddnings protokoll är så viktigt. Det finns dock många utmaningar för utvecklingen av inbäddnings protokollet. Till exempel för att observera aktiviteter av levande lokala neuronala kretsar i rent isolerade hjärnregioner, hjärn skivor måste produceras för in vitro-inspelningar. Dessutom är inspelningar från hjärn skivor för in vitro-inspelningar fortfarande ett viktigt val av minst två anledningar. För det första är det fortfarande inte lätt att observera aktiviteter för många levande enskilda nervceller samtidigt från hjärnregioner djupare än ~ 1,5 mm och i hög temporala upplösning (< 1 MS). För det andra, när vi hoppas att veta den interna arkitekturen i en lokal neuronala krets, måste vi stoppa alla ingångar som kommer från externa hjärnregioner för att eliminera confounding faktorer. För att identifiera riktningar och positioner av producerade hjärn skivor, kommer det att vara ytterligare nödvändigt att integrera de rumsliga positionerna för dessa producerade hjärn skivor med hjälp av koordinater. Det finns dock några systematiska och pålitliga sätt att göra hjärn skivor på ett organiserat sätt10,11. Här introduceras ett nytt coregistration Protocol, med hjälp av 3D-scanning teknik för neurovetenskaplig forskning för att ge ett integrativt protokoll. Detta protokoll fungerar för att samordna mikro-och macroscales och bädda in multielektrod array (MEA) mikrodata12,13 och färgning data på ett makroskopiskt MRI utrymme genom 3D Scan ytor av extraherade hjärnor, samt av noninvasivt inspelade hjärnor. Överraskande, detta visade ett avstånds fel på endast ~ 50 μm som läge värdet av histogrammet. Det innebär att läges värden för minsta avstånd mellan två ytor mellan MRI-ytan och den skannade 3D-ytan var nästan 50 μm för alla sex möss, vilket är ett lämpligt antal vid kontroll av gemensamhet bland individer. Den typiska segment bredden hade en inspelad spik aktivitet på cirka 300 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som beskrivs här har godkänts av Kyoto-universitetets djur vårds kommitté.
1. djur (dag 1)
- Förbered kvinnliga C57BL/6J möss (n = 6, åldrad 3 − 5 veckor).
Anmärkning: Detta protokoll är tillämpligt på alla gnagare arter.
2. MRI-inställningar (dag 1)
- Placera musen i en akryl anestesi låda placerad på en värmare matta justerad till 37 ° c med en värmare matta Controller.
- Anesthetize musen med 2% isofluran i luften rinner genom boxen med ett flöde på 1,4 L/min med hjälp av en anestesisystem, som består av en isofluran spridare, Luftflödesmätare, och luftkompressor.
- Efter induktion av anestesi, Placera musen i en MRI-kompatibel vagga i liggande läge. Kontrollera om anestesi är tillräcklig genom att klippa en tå av musen med pincett för att se om det inte känns smärta.
- Fixera musens huvud med tand listen och ansiktsmasken utrustad med vaggan. Sedan, underhålla anestesi med 1% − 1.5% isofluran i luften vid 1,4 L/min via ansiktsmasken.
- Sätt in en termistortemperatursond i ändtarmen på musen och placera en tryck känslig andnings sensor på bak med musen.
- Överför vaggan till hålet på en MRI-magnet. Justera isoflurankoncentrationen till cirka 1% − 1,5% för att säkerställa ett stabilt och reproducerbart djup av anestesi. Övervaka om kroppstemperaturen styrs mellan 33 − 35 ° c och andningsfrekvensen mellan 0,5 − 1,3 Hz under hela perioden av MRI-experiment, med hjälp av ett övervakningssystem (tabell över material) för de fysiologiska parametrarna hos små djur med dedikerad programvara (tabell över material).
- Med hjälp av det uppmätta värdet av rektaltemperaturen, reglera kroppstemperaturen genom att kontrollera temperaturen hos varm luft som levereras i magnet hålet från ett värmesystem utrustat i övervakningssystemet.
3. MRT-förvärv (dag 1)
-
Förberedelser för högupplöst 3D T2-vägd MRI-skanning
- Förvärva tre magnetisk resonans (MR) bilder i tre ortogonala (axiella, koronala och sagittal) flygplan för att kontrollera musens position.
- Med hänvisning till dessa bilder, justera placeringen av musen genom att flytta vaggan så att mitten av musen hjärnan är placerad i mitten av resonatorn samt i mitten av gradienten spolar i axiell riktning.
- Justera MRI-systemet genom att trimma resonatorn, justera det statiska magnetiska fältet homogenitet (shimming) och grundfrekvensen, och kalibrera radiofrekvens (RF) effekt.
- Förvärva lågupplösta 2D Multislice T2-viktade (T2W) bilder med koronala och sagittal riktningar. Baserat på dessa bilder, bestämma synfält (FOV) för en högupplöst 3D T2W MRI-skanning.
- Utför lokaliserad mellanlägg med hjälp av en fastmap automatisk shim-algoritm. För FASTMAP-protokollet, Välj en rektangulär region som täcker hela hjärnan. Efter slutförandet av lokaliserad shimming, bekräfta B0 fältet ohomogenitet inom hjärnregionen med ett lokaliserat 1H spektrum med hjälp av punkt-löst spektroskopi (Press).
- Förvärva lågupplöst 3D T2W bilder för att se till att skanningsinställningarna för högupplöst 3D T2W MRI är lämpliga genom att kontrollera lämplig position av FOV, frånvaron av wraparound (alias) artefakter, och effektiv dämpning av fett signaler.
-
Bild pulssekvens
- Efter förberedelserna som beskrivs ovan, förvärva högupplösta 3D T2W bilder av musens hela hjärnan, med hjälp av ett snabbt förvärv med avslappning Enhancement (sällsynt) sekvens.
Anmärkning: I denna artikel utfördes MRI-experiment på en 7 T, 210 mm horisontell borrning, preklinisk scanner, utrustad med ett gradientsystem på 440 mT/m vid Ramptid 100 μs. En kvadratur Volume resonator med en innerdiameter på 35 mm användes för RF excitation och signalmottagning. MRT-data förvärvades med en dedikerad driftprogram vara. Förvärvs parametrarna för den 3D-sällsynta pulssekvens som används i denna studie sammanfattas i tabell 1.
- Efter förberedelserna som beskrivs ovan, förvärva högupplösta 3D T2W bilder av musens hela hjärnan, med hjälp av ett snabbt förvärv med avslappning Enhancement (sällsynt) sekvens.
4. förberedelse av experimentella lösningar (dag 2)
- Förbered 500 mL av en iskall skär lösning (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 7 mm mgcl2, 15 mm glukos, 25 mm NaHCO3, 0,5 mm CaCl2, 11,6 mm natriumaskorbat, 3,1 mm natriumpyruvat och 100 mm kolinklorid, bubblade med 95% O2 och 5% Co2). Justera pH till 7,3 − 7,4.
- Förbered 1 L av den konstgjorda cerebrospinalvätskan (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 1 mm mgcl2, 15 mm glukos, 25 mm NaHCO3, och 2 mM CaCl2, BUBBLADE med 95% O2 och 5% Co2). Justera pH till 7,3 – 7,4.
5. beredning av utrustning (dag 2)
- Förbered en 6,6 cm2 kvadrat, 0,5 cm tjock magnet "Ring" och, först, placera svart tejp och, för det andra, kirurgisk tejp på ringen (figur 1c-2). Observera att detta material heter en Brain-block Base (BBB), och hålla det kallt på block av is.
Anmärkning: Senare kommer banden att fästas på skivning stationen med hjärn block för vibratome. Den fyrkantiga ringen används som botten bas av BBB att tillfredsställa två syften, nämligen att migrera hjärn block smidigt från 3D ScanStation till en vibratome och för att mäta exakt höjderna av hjärn blocken i scanning steg. - Ställ in BBB med en automatisk skivspelare. Slå på skannern och skivspelare. Starta programvaran för bildbehandling.
-
Före alla experiment, utför kalibreringar av kamerorna och den anslutna skivspelare av en strukturerad ljus projektion och Desktop-typ 3D-skanner.
- Slå på mittprojektorn, de två kamerorna och skivspelare. Öppna sedan programvaran. I programvaran klickar du på optisk inställning och väljer bildområdet som 100 x 80 och rutnäts numren som 100 x 100. Därefter startar kamera kalibreringen enligt följande fyra steg.
- För projektorns inställning, Lägg kalibrerings arket på skrivbordet och placera kalibreringskortet på kalibrerings plåten för att justera Mät områdets infästningspunkt till mitten av arket och orienteringen till fronten. Justera avståndet mellan projektorn och brädan till ca 200 mm. Lossa skruvarna som fixar de två rattarna och Vrid rattarna för att justera ljuskänsligheten och fokus för de två kamerorna. Klicka sedan på pilen för att gå till nästa steg.
- För att orientera kamerorna, lossa skruvarna fastställande de två kamerorna själva och flytta positioner och rotationer att överlappa med centrumlinjen på kalibreringskortet, den vertikala linjen, och det gula korset projiceras från projektorn. Fix kamerorna och klicka på pilen igen. Då blir skärmen mörk.
- För att fokusera kamerorna, efter att lossa fästskruvarna på rattarna, öka ljuskänsligheten och finjustera fokus igen. Klicka sedan på pilen för att gå till nästa steg.
- För F-värdet och graden av exponering (av kameran), justera ljuskänsligheten igen till strax under där den röda regionen försvinner. Klicka sedan på pilen igen och klicka på kalibrering start, och välj Ja om du frågade gjorde du avsluta den optiska inställningen?
- Klicka på initiera kalibreringenoch kontrollera om pixelvärdena är normaliserade mellan 0 – 255. Klicka sedan på Fortsätt.
- Genom att följa föreslagna positioner, spela in bilder av nio olika relativa vinklar av skannern och kalibreringskortet, och avsluta efter att ha bekräftat kalibreringsprocessen, och slutligen, klicka på uppdatering av kalibreringen.
- Växla kalibreringskortet för skivspelare och klicka på skivspelare kalibrering.
Anmärkning: Nu är alla kalibreringar färdiga.
- Slå på mittprojektorn, de två kamerorna och skivspelare. Öppna sedan programvaran. I programvaran klickar du på optisk inställning och väljer bildområdet som 100 x 80 och rutnäts numren som 100 x 100. Därefter startar kamera kalibreringen enligt följande fyra steg.
6. hjärn ytans skanning, skivning och MEA-inspelning (dag 2)
- Anesthetize en mus med 1% − 1.5% isofluran och halshugga musen. Använd en skalpell för att öppna huden och exponera skallen.
- Skär hårbotten av den sövda musen längs sagittal suturen med hjälp av en kirurgisk kniv, och skär skallen i diagonala riktningar från lambda punkt till en punkt lite framför bregma med kirurgisk sax. Dra sedan försiktigt av skallen från hjärnan med hjälp av böjda pincetter.
- Använd en spatel för att lyfta hjärnan och överför den till en petriskål (100 mm x 20 mm) med iskallt skär lösning (beredd i steg 4,1). Flödes luft som innehåller 95% O2 och 5% Co2 från en extern gas bomb med en kontrollerad roterande hastighet på pumpen (~ 4,0 rpm) för att generera små bubblor i den iskalla skär lösningen (figur 1a).
- Efter 1 – 2 min, placera hjärnan på en mikrofiberduk vars yta är något täckt av en Mjölsil, och torka vätska från hjärnans yta, försiktigt med hjälp av mikrofiberduken (figur 1b).
- Sätt hjärnan med sin rygg aspekt upp på provet stå på BBB, och även sätta BBB i mitten av den automatiska skivspelare.
- Gör rummet mörkare under 3D-skanningen och utför en 3D-skanning på skivspelare. Om du vill testa om 3D-skanningen fungerar bra klickar du på 3D-skanning genom att välja vinkeln mellan två bilder som 22,5, Startvinkeln som 0 och den slutgiltiga vinkeln som 360 (figur 1c-1).
- Flytta hjärnan till en petriskål, och bubbla hjärnan i skär lösningen för cirka 10 s.
- Skär hjärnan i två kvarter i mitten av det koronala planet med hjälp av en kirurgisk kniv, och flytta de två hjärn blocken försiktigt till den plana ytan med hjälp av en kirurgisk spatel.
- Fäst hjärn block av BBB med omedelbar lim, och mjukt och försiktigt torka vätskan från hjärnans yta inom 1 – 2 min, med hjälp av en mikrofiberduk igen. Utför sedan en 3D-skanning igen (figur 1c-2).
- Fäst den svarta tejpen som täcker mitten av BBB till mitten av skär stadiet för en vibratome (figur 1d).
- Häll skär lösningen i skär stadiet och Ställ in skärfasen på vibratome. Justera skärhastigheten och amplituden. Gör 2 – 5 koronala skivor (300 μm tjock) från de två hjärn blocken. Håll lösningen i skär stadiet bubblande om möjligt (figur 1e).
- Fäst ett blad på bladhållaren på vibratome och optimera systemets skärhastighet, frekvens och vibrations amplitud genom att ställa in dem som 12,7 mm/min för hastigheten, 87 – 88 Hz för frekvensen och 0,8 – 1,0 mm för sväng bredden. När noggrann skärning är nödvändig, sakta ner hastigheten till nivå 2 – 3.
- Medan skära hjärnan skivor, registrera den skivade koordinaten i formatet, inklusive främre-posterior koordinat, halvklotet, och andra villkor (figur 2C).
- Överför försiktigt hjärn skivorna till en bägare fylld med förvärmd (~ 34 ° c) ACSF med en tjock plastpipett, och inkubera dem i bägaren vid ~ 34 ° c för ~ 1 h. Under denna tid, utföra en 3D-skanning av de kvarvarande hjärn blocken på skär stadiet (figur 1c-2).
- Ställ in ett MEA-chip på en inspelningsenhet. Anslut chip till en Peristaltisk pump med två rör. Använd ett rör för att styra samma ACSF i MEA chip och det andra röret för att vägleda ACSF ur MEA chip.
- Fäst två nålar (0,60 mm x 19 mm), anslutna vid spetsarna på de två rören, till toppen av väggen av MEA chip, och fixa deras positioner med sina tips efter den inre väggen av MEA chip. Ställ in flödeshastigheten för ACSF till 4,1 RPM.
- Efter 1 h har passerat, flytta ett segment på chip med en tjock plastpipett, och Ställ in positionen med en mjuk borste. Starta sedan inspelningsprocessen för neuronala aktiviteter (figur 2-d).
7. immunohistokemi färgning (dag 3 och 4)
- När MEA-inspelningen är avslutad, överför skivorna till 1,5 mL-rör fyllda med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inkubera dem över natten vid 4 ° c. Ta sedan bort 4% PFA lösning, och tvätta skivorna 3x med PBS för 5 min totalt.
Anmärkning: Om det behövs, bädda in skivorna i 20% gelatin/PBS och resektion segmentet för att göra det tunnare än 50 μm, med hjälp av vibratome. - Bered antigen hämtnings lösning (10 mM natriumcitrat, pH 6,0). Ta bort PBS från den sista tvätten och tillsätt antigen hämtnings lösningen.
- Koka vatten i en elektrisk termos kruka och inkubera rören med skivorna i 20 min vid ~ 95-98 ° c i potten, följt av naturlig kylning.
- Förbered 50 mm Tris-buffrad saltlösning och tillsätt 1% na bisulfit (1% na natriumbisulfit-Tris lösning). Justera pH till 7,5. Tvätta sedan skivorna med 1% na bisulfite-Tris lösning i 5 min vid rumstemperatur (~ 20 – 25 ° c).
- Bered blockerande lösning genom att tillsätta 4% normalt get serum och 0,5% oktylfenoletoxiat till 1% na bisulfite-Tris lösning.
- Ta bort 1% na bisulfite-Tris lösning från rören med skivorna och tillsätt blockerande lösning. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Bered den primära antikroppslösningen genom att tillsätta 1% normalt get serum och 0,5% Triton X-100 till 1% na bisulfite-Tris lösning och späda primära antikroppar. Använd följande koncentrationer av primära antikroppar: 1:800 av mus anti-GAD67 och 1:500 av kanin anti-NeuN.
- Ta bort 1% na bisulfite-Tris lösning från rören med skivorna och tillsätt den primära antikroppslösningen. Inkubera den över natten vid 4 ° c.
- Förbered 50 mM Tris-buffrad saltlösning och tillsätt 8,5 g/L NaCl (Tris-NaCl-lösning). Titrera pH till 7,5. Tvätta sedan skivorna 3x med Tris-NaCl-lösningen (~ 20 – 25 ° c) i totalt 5 minuter.
- Bered den andra antikroppslösningen genom att tillsätta 3% normalt get serum och 0,3% Triton X-100 till Tris-NaCl-lösningen och späda sekundära antikroppar. Använd följande koncentrationer av sekundära antikroppar: 1:500 av get anti-Mouse och 1:500 getanti-kanin.
- Ta bort Tris-NaCl-lösningen från rören med sektorerna och tillsätt den sekundära antikroppslösningen. Inkubera det i 2 timmar vid rumstemperatur. Tvätta sedan skivorna 3x med Tris-NaCl-lösningen i totalt 5 minuter.
- Placera skivorna på bilden med en liten borste och applicera monteringsmaterial och en täckglas. Undersök bilderna med ett konfokalmikroskop. Ta bilder av ytan på en skiva (figur 2e).
8. MRT data behandling för att extrahera kortikala volymer
- Installera fri programvara FSL (https://fsl.fmrib.ox.AC.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation). Förbered MRI-bilderna som erhållits i avsnitt 3.
- Ändra bildformatet med kommandot fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ . Expandera hjärn bilden för att göra den så stor som en mänsklig hjärna med hjälp av kommandot fslcreatehd , och, om nödvändigt, ändra orienteringen med fslorient med option -setqformcode 1. Efter detta, återvinna det ursprungliga filformatet med hjälp av fslchfiletype NIFTI_GZ. Det exakta kommandot är följande.
fslchfiletype NFTI_PAIR [ingång bild]. nii. gz
fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [ingång bild]. HDR. gz
fslorient-setqformmcode 1 [ingång bild]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [ingång bild] - Skriv FSL för att öppna FSL-programvaran. Extrahera hjärnor med kommandot Bet från det grafiska användargränssnittet (GUI), men skala inte för mycket. Kontrollera sedan decimal intensitet trösklar,... och koordinater för centrum för den initiala hjärnans yta sfär noggrant. De optimala värdena är olika för enskilda data.
- Ändra storlek på hjärn bilden till den ursprungliga mus hjärn storleken, med samma procedur som i steg 8,2. Det exakta kommandot är som följer:
fslchfiletype NFTI_PAIR [ingång bild]. nii. gz
fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,08 0 0 0 0 4 [ingång bild]. HDR. gz
fslorient-setqformmcode 1 [ingång bild]. HDR. gz
fslchfiletype NIFTI_GZ [ingång bild] - Coregistrate all hjärna profilen användande den flirt befalla, och producera en genomsnitt hjärna bild användande den -tillägga valen och den -div valen om fslmaths befalla.
fslmaths [hjärna bild 1] – tillägga... – tillägga [hjärna bild N] – div N [genomsnitt bild namn] – ODT flyta - Gör den genomsnittliga hjärnan renare med -THR alternativet i fslmaths kommandot. Välj sedan ett optimalt tröskelvärde värde adaptiv till enskilda fall.
fslmaths [medelvärde Bildnamn]-THR [THR värde, till exempel 5000] [thresholded genomsnittlig bild] - Slutligen omforma den genomsnittliga hjärn bilden till en individs koordinat med hjälp av flirt -kommandot igen. Förbered sedan ganska rena extraherade cortexes (figur 2A).
Obs: Tyvärr, luktbulben och lillhjärnan kommer inte att vara perfekt i den rekonstruerade hjärn ytan från MRI volymer på grund av FSL Softwares väsentliga begränsningar för Peal alla hjärn delar inklusive luktbulben och lillhjärnan.
9. MRI bildbehandling till stripe kortikala ytor
- Ladda ner en annan fri programvara, 3D slicer (https://Download.slicer.org/).
- Öppna MR-bilder av den extraherade hjärnor (klicka på filen och välj Lägg till data) som produceras enligt avsnitt 8, med hjälp av volym återgivning och redaktör moduler i 3D slicer.
- Ändra läge från redaktör till volym rendering, och klicka på en mål-knappen för att göra bilden av hjärnan kommer till mitten av skärmen.
- Välj Mr-T2-Brain -läget och justera tröskeln genom att flytta Shift -fältet. Flytta sedan tillbaka från volym återgivningen till redigeraren och klicka på knappen tröskeleffekt .
- Applicera etiketten 41. Hjärnbarken och spara hjärnans ytdata som en . stl -fil. Ändra sedan filformatet från . VTK till . stloch spara filen genom att kontrollera formuläret.
10. förbehandling för 3D Scan data
-
Utför en automatisk samregistrering bland 8 eller 16 bilder tagna från 8 eller 16 olika vinklar inom en sekvens av en skanning för att korrigera små felmatchningar bland dem genom att klicka på global registrering som ingår i justeringsalternativet och integrera dem. Upprepa skanningar från olika vinklar för att få hela hjärn ytan (figur 2b).
- Om integreringen mellan bilder som skannats från olika vinklar inte lyckades klickar du på manuell justering och väljer ett par med en fast bild och en rörlig bild.
- Klicka på Start för att starta manuell justering av bilderna genom att välja tre eller fyra vanliga punkter i olika bilder. Klicka sedan på OK. Optimeringsalgoritmen är den iterativa närmaste punkt (ICP) algoritm10. Det inkluderar inte en ickelinjär deformation.
- Gör ett nät av alla justerade bilder (dvs. av prickar datauppsättningar) genom att välja alla bilder och genom att klicka på knappen mesh generation . Välj sedan alternativet litet konstnärligt objekt för att få nätet som den högsta upplösningen. Spara sedan bilden som. stl-binär eller i ASCII-format.
11. samtidig registrering av MRI-ytan och 3D-skanningsytan
-
Öppna MRI-ytan och slå ihop den med 3D-skanningsytan med hjälp av ytbehandlings programvaran. Utför sedan en manuell justerings process med samma procedur som beskrivs i steg 10.1.1 och 10.1.2. Spara sedan de här coregistered Surface-bilderna igen (figur 2A, b).
- Om det behövs rengör du de enskilda ytdata, till exempel genom att radera små ljud som omger hjärnregionen, särskilt när det gäller MRI-data, och genom att fylla hål om det finns några, särskilt när det gäller 3D-skanningsdata.
- Slutligen, öppna ytan data med en dataanalysprogram vara, till exempel, MATLAB, och utföra och utvärdera histogrammen av minsta avstånd mellan de två ytorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utvärderade avstånd mellan kortikala ytor, producerad av strippning MRI volym, och ytor som erhållits från 3D-skanningar av extraherade hjärnor. Funktionsläget värderar av histogrammet av distanserar är endast 55 μm (figurera 3a). Dessutom, när du ackumulerar histogrammet från den punkt där avståndet är lika med noll, uppnår det ackumulerade värdet 90% av de totala prov numren på ~ 300 μm (figur 3b). Final histogrammet av distanserar mellan två ytbehandlar visade en typisk topp runt om 50 μm. Om vi tolkar detta värde från en makroskopisk synvinkel, intressant, noggrannhet, läge värde ~ 50 μm, motsvarar den geometriska begränsningen, som förväntades från Voxel storlek MRIs (figur 3a), nämligen, 100 μm. Denna punkt tyder indirekt på att den överlappande algoritmen, ICP, mellan MRI och 3D-skanning fungerade utmärkt väl och att ljudnivåerna för både MRI och 3D-skanningen dämpades som lågt värde (figur 2A, b)14.
Figur 1: experimentellt flöde. (a) först, efter att extrahera en hjärna från en mus, var hjärnan föll i en bubblade skär lösning. (b) efter avtorkning av skär lösningen med en mjuk och mycket absorberande handduk, (c) hjärnan skannades på en skivspelare. (d) i att göra skivor (steg 8 i processen), var hjärn blocken skannas på en BBB eftersom det är lätt att flytta hjärn block till basen för en vibratome (steg 7 och 8 i processen). (e) efter att ha fått tillräckligt med skivor för att registrera elektriska aktiviteter eller för färgning av cell fördelningar och andra metoder, de återstående hjärn blocken skannades igen (steg 10 i processen). Tjockleken på de kvarvarande hjärn blocken gav ytterligare viktig supportinformation om var skivorna togs ifrån. (f) Slutligen noterade vi funktionella aktiviteter eller strukturella arkitekturer med hjälp av MEA-eller infärgnings metoder och andra metoder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: databehandling pipeline. a) ett exempel på en kortikal yta som framställts genom strippning av cortexer från MRI-volymer enligt beskrivningen i avsnitten 8 och 9 i protokollet. (b) ett exempel på en kortikal yta som direkt skannas av ett 3D-Skannersystem. (c) ett exempel på ett memo som används för att sammanfatta hjärnregionen varifrån de enskilda hjärn skivorna extraherades. (d) ett exempel på när den kortikala segmentet är på en elektrod skålen. (e) ett exempel på en fläckig hjärn kortikal skiva av Neun (röd) och GAD67 (grön). All information kommer nu att samlas i en enhetlig databas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: överlappande noggrannhet mellan MRIs och 3D-skanningar. a) histogram av avstånd mellan ytor som extraheras genom peeling från MRI-volymer. Ytorna kom från 3D Scan inspelningar. Huvudstapeldiagrammet är det genomsnittliga histogrammet för alla individer, och andra färgade linjer är resultat för enskilda möss (N = 6, 21 – 40 dagar, alla var honmöss). En generell trend, stabil för alla individer, kunde hittas. (b) histogrammets ackumulerade värde visas som stapeldiagram. Den ackumulerade procentsatsen nådde 90% vid ~ 300 μm (prickade linjer). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: konceptualiserad bild av två skalor av information integreras i ett grafiskt användargränssnitt (GUI). Både den makroskopiska hjärn anatomin och den mikroskopiska neuronala krets informationen integrerades i ett system som representeras av en webb. Den höga graden av noggrannhet, som visas i figur 3, gjorde det möjligt för oss att integrera dessa två skalor realistiskt. Den makroskopiska bilden som presenteras här är från en skalbar Brain Atlas15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Parametrar | Värden |
| Repetitionstid (TR) | 2 000 MS |
| ECHO-tid (TE) | 9 MS |
| Effektiv TE: | 45 MS |
| SÄLLSYNT faktor | 16 |
| Storlek på anskaffnings mat ris | 196 x 144 x 144 |
| Synfält (FOV) | 19,6 x 14,4 x 14,4 mm3 |
| Bandbredd för förvärv | 75 kHz |
| Orientering | Axiell (koronalt orientering i skanner inställning) |
| Fett dämpning parammeters | |
| fett frekvens | 2,6 MS-Gaussian-formad π/2 puls med 1051 Hz bandbredd |
| Spoiler gradient | |
| dummy-skanningar | 2 gånger |
| Antal medelvärden | 3 |
| Förvärvs tid | 2 h 42 min |
Tabell 1: förvärvs parametrarna för den 3D-sällsynta pulssekvens som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklade ett nytt protokoll som kallas 3D-NEO-protokollet för att överbrygga makroskopiska och mikroskopisk rumsliga skalor genom att överlappa två hjärn ytor mer exakt än tidigare. Ursprungligen fanns det två utmaningar i att skapa detta protokoll som gjorde det möjligt att exakt överlappning av två hjärnan yta bilder och inspelning friska neuronala aktiviteter från levande organismer. Först var det nödvändigt att effektivt torka skär lösning som omger den extraherade hjärnan efter extrahering av den från skallen utan att skada hjärnorganismen (steg 6,2 i protokollet). För det andra, eftersom den första och tredje villkor för torrhet och tidsfördröjning är potentiella negativa faktorer för den levande organismen, avslutar alla steg i skanningsprocessen från hjärnan utvinning till segmentet preparat inom 10 – 15 min var också nödvändigt att hålla nervceller aktiva.
Förmågan att framgångsrikt registrera hjärnaktiviteter med hjälp av detta protokoll har nu möjliggjort samordningen inte bara av strukturella organisationer utan också av funktionella aktiviteter på hela-hjärn kartan. En annan positiv aspekt av detta protokoll är att eftersom en BBB var beredd, kalibreringen från skannern till basen av vibratome blev mycket smidigare.
Som nämnts i representativa resultat, histogrammet av avstånd mellan två ytor visade en topp på runt 50 μm. Även om vi utförde den överlappande processen, som om genom att se från den makroskopiska synvinkel. Om vi tolkar resultatet från mikroskopiska synvinkel, 50 μm är en jämförbar spatial skala i fördelningen av nervceller, eftersom Connectivity sannolikheter mellan par kortikala neuroner förfall inom ~ 100 μm16,17, även inom flera millimetrar18. Praktiskt, MEA eller kalcium avbildning studier använder ofta 300 – 400 μm tjocka skivor. Så, den teknik som presenteras här kommer att ge starka objektiva bevis om skivorna är ordentligt inbäddade i original hela hjärnan kartor. Efter överlappning är korrekt uppnås, ytterligare noggrannhet kommer att uppnås enbart från den lokala information som observerats under ett mikroskop. Därför, genom att utföra en två-stegs optimeringsprocess bestående av globala och lokala optimerings steg, kommer det att vara möjligt att nå en rumslig upplösning som motsvarar semi-automatiskt till den typiska storleken på en neuron i framtiden.
Denna noggranna integrations protokollet ger grundläggande teknik för att generera olika Brain atlaser18,20,21 och även att studera mer djupgående MRI av andra primater22,23 och mänskliga efter döden hjärnor (även om den mänskliga hjärnan har sulci, är det möjligt att få ett tillräckligt antal inspelningsplatser från gyri). Nu utvecklar vi också ett visuellt gränssnitt för att integrera många inspelade data prover i en gemensam rumslig koordinat. En bild figur som denna visas i figur 4. När det gäller hjärnor från däggdjur kommer integrationen mellan kvantitativt olika skalor också att göra nya framsteg kvalitativt för att förstå sjukdomstillstånd och för att utvärdera läkemedels effekter. Generellt kommer detta att vara svårt att tillämpa på fiskar, reptiler och amfibier, eftersom forskarna kommer att finna det svårt att hålla formen av den extraherade tunna hjärnan stabil till sin pre-extraherade form, och MRI bilder av deras mindre hjärnor kommer också att vara relativt bullrigare.
3D-NEO-protokollet har införts genom denna forskning i en neurovetenskaplig eller Cellbiologisk forskning fält, framgångsrikt visar hög noggrannhet i överbrygga mellan makroskopisk anatomi och mikroskopisk neuronala distribution, inklusive topologiska arkitekturer av makro-och microconnectomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
MS är tacksam för stöd från alla anställda i medicinsk information Engineering kurs i forskarskolan för medicin och medicinska fakulteten, och vill tacka prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto, och Doris Zakian för deras hjälpsamma Kommentarer. Denna studie stöddes av ett bidrag-in-Aid för utmanande undersökande forskning och av det ledande initiativet för utmärkt unga forskare (LEADER) program till MS från MEXT (ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik). MRI-experimenten i detta arbete utfördes i avdelningen för små djur MRI, Medical Research Support Center, forskarskolan i medicin, Kyoto University, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| Curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| Scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
References
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , Oxford University Press. (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of Neural Science. , McGraw-Hill. New York, NY. (2013).
- Pine, J. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. Taketani, M., Baudry, M. , Springer. New York, NY. 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. , Springer-Verlag. 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
