Här beskriver vi en kvantitativ metod att bestämma fördelningen av ett synaptic protein i förhållande till en markör protein med hjälp av immunofluorescens färgning, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys.
Den närvaro, frånvaro eller nivåer av specifika synaptic proteiner kan allvarligt påverka synaptisk transmission. Förutom att belysa funktionen av ett protein, är det viktigt att även kartlägga dess utbredning. Här beskriver vi ett protokoll som sysselsätter immunofluorescens, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys för att bestämma fördelningen av proteinet synaptiskt Mover (även kallad TPRGL eller SVAP30). Vi jämför fördelningen av Mover som den synaptiska vesikelproteinet protein synaptophysin, därmed att bestämma fördelningen av Mover på ett kvantitativt sätt i förhållande till överflödet av synaptiska vesikler. Särskilt, skulle denna metod potentiellt kunna genomföras för att möjliggöra jämförelse av fördelningen av proteiner med olika antikroppar eller Mikroskop eller mellan olika studier. Vår metod kringgår det inneboende variabilitet av Immunofluorescerande infärgning av ger förhållandet snarare än absoluta fluorescens nivåer. Dessutom, den metod som vi beskriver gör det möjligt för forskaren att analysera fördelningen av ett protein på olika nivåer: från hela hjärnan skivor till hjärnan till olika delområden i en hjärna området, såsom de olika lagren av hippocampus eller sensoriska cortices. Mover är ett ryggradsdjur-specifika protein som associeras med synaptic blåsor. Med den här metoden visar vi att Mover fördelas ojämnt över hjärnområden, med höga nivåer i den ventrala pallidum, septal atomkärnor och amygdala, och även inom enda hjärnan, såsom hippocampus olika lager.
Kommunikationen mellan nervceller händer på specialiserade kontakt webbplatser kallas synapser. Synapser innehåller en myriad av olika proteiner som orkestrera synaptisk transmission. Några av dessa proteiner visar en heterogen fördelning i hela nervsystemet och är inte närvarande i varje synaps1. Ett exempel för ett sådant protein är Munc13, som är involverat i processen priming av synaptiska vesikler. Det finns olika isoformer av Munc13, som är heterogent fördelat i hela hjärnan2, och närvaron eller frånvaron av särskilda isoformer kan påverka kortsiktiga synaptisk plasticitet och synaptiskt vesikelprotein dynamics3, 4 , 5. det är därför av avgörande betydelse för att kunna identifiera förekomsten av olika synaptic proteiner över hjärnområden.
Metoderna av val för kvantifiering av synaptic proteiner – hittills – är masspektrometri och Western blotting, i stället för immunohistokemi6,7,8,9. I vissa fall metoderna flera kompletterar varandra för att bedöma både kvantiteten och lokalisering av specifika proteiner (dvs, det Wilhelm o.a. 10). den metod som vi beskriver här tillåter för lokalisering och kvantifiering av proteiner av intresse utan att behöva använda någon biokemisk metod, helt enkelt anställa Immunofluorescerande infärgning. En annan fördel här är att kvantifiering kan göras över områden mycket mindre och därför mer specifika, än de som uppnås med andra metoder. Dock måste man beakta att en tillförlitlig referens protein behövs för att bedöma fördelningen av proteinet av intresse.
Fluorescerande färgning av immunohistokemi tillåter oss att rutinmässigt identifiera lokaliseringen av proteiner i hjärnområden samt inom olika neuronala fack. För att identifiera de olika fack, används specifika markörer. Antikroppar mot synapsin och synaptophysin11 kan vanligtvis användas att märka synaptic vesicles, medan antikroppar mot fagott etikett den aktiva zonen av en presynaptiska terminal12. Vesikulär transportörer, såsom vesikulär glutamat transportörer (vGluT) eller vesikulär GABA transportör (vGAT), används för att märka excitatoriska13 och hämmande14 presynaptiska terminaler, respektive. På postsynaptiska sida, kan antikroppar mot Homer proteinet användas för att markera postsynaptiska terminaler och antikroppar mot postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan märka retande eller hämmande postsynaptiska terminaler, respektive. Med hjälp av antikroppar mot ett protein av intresse och markörer såsom de som beskrivs ovan, kan man bestämma localizationen av sådant protein. Många studier hittills har gjort i en kvalitativ sätt21. Dock för att tillförlitligt avgöra differentiell fördelningen av ett specifikt synaptic protein, måste man inte bara bestämma dess närvaro eller frånvaro men också dess relativa koncentration. Heterogenitet i storlekar och täthet av synapser gör det viktigt att fastställa en kvot mellan den synaptiska markören och proteinet av intresse. Annars, synaps-rika regioner såsom icke-pyramidal lager av hippocampus och det molekylära lagret av lillhjärnan visar en hög täthet av synaptic proteiner, endast på grund av den högre tätheten av synapser men inte på grund av en stark närvaro av det proteinet i varje synaps (t.ex., Wallrafen och Dresbach1). Å andra Visa proteiner i de neuronala soma (t.ex., TGN3822) vanligtvis stark närvaro i hippocampus pyramidal cellager eller Hippocampus eller cerebellär granule cellager på grund av den höga koncentrationen av neuronala cellen organ i dessa områden. Därför denna icke-homogen fördelning av strukturer, i detta fall synapser, kan leda till en falsk uppskattning av fördelningen av proteinet av intresse själv. Dessutom finns det en inneboende variabilitet i färgning stödnivåer över prover i immunhistokemiska färgningar. Protokollet beskrivs här tar hänsyn till detta och undviker sådana fördomar, liksom andra varningar som uppstår från immunohistokemiska metoder.
I vår senaste studie, vi har använt denna metod för att beskriva differentiell uttrycket av Mover (även kallad TPRGL23 eller SVAP3024) över 16 olika hjärnan områden1. Mover är ett ryggradsdjur-specifika synaptic protein som finns i föreningen till synaptic blåsor och påverkar signalsubstansen pressmeddelande25,26,27. Vi har släkt Mover uttrycket att överflödet av synaptiska vesikler, genom färgning för synaptophysin som synaptiskt vesikelprotein referens markör. Vi hittade höga halter av Mover särskilt i septal atomkärnor, den ventrala pallidum och amygdala. Inom hippocampus hittade vi en heterogen fördelning av Mover, med höga nivåer i samband med intra-Hippocampus uträkningen, och låga nivåer i in- och utdata lager lager.
Metoden presenteras här syftar till att kvantifiera distribution av ett protein av intresse i förhållande till överflödet av ett protein som markör med en känd fördelning. Immunofluorescens färgning kan visa en hög variabilitet av färgning stödnivåer mellan olika skivor. Metoden kvantifiering beskrivs här kringgår detta problem genom att bestämma förhållandet mellan proteinet av intresse för genomsnittet över halvklotet. Därför olika färgning intensiteter över segment ställs och möjliggöra en k…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Irmgard Weiss för utmärkt tekniskt bistånd. Författarna erkänner stöd av Hermes Pofantis och Andoniya Petkova. Författarna vill även tacka Europeiska neurovetenskap Institutet för användning av LSM800 och tekniskt bistånd, särskilt genom Dr Nils Halbsgut. Detta arbete finansierades av vid University Medical Center Göttingen. JSV erkänner stöd av Center för nanoskala mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB).
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
Stereoscope | Leica | ||
LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
freezing microtome | Leica | ||
PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
PFA | Sigma | P6148-1kg | |
NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
FIJI | ImageJ | Analysis software | |
Microsoft Excel | Microsoft |