Summary

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

Published: March 21, 2020
doi:

Summary

Мутации в леуцине богатые повторить киназы 2 гена (LRRK2) вызывают наследственное заболевание Паркинсона. Мы разработали простой и надежный метод оценки lRRK2 контролируемого фосфорилирования Rab10 в нейтрофилов периферической крови человека. Это может помочь определить людей с повышенной активностью пути киназы LRRK2.

Abstract

Лейцин богатый повторить киназу 2 (LRRK2) является наиболее часто мутировавшим геном в наследственной болезни Паркинсона (PD) и все патогенные мутации LRRK2 привести к гиперактивации его функции киназы. Здесь мы описываем простой и надежный анализ для количественной оценки lRRK2 киназы пути деятельности в нейтрофилов периферической крови человека путем измерения LRRK2 контролируемых фосфорилирования одного из своих физиологических субстратов, Rab10 на threonine 73. Описанный анализ иммуноблоттинга требует полностью селективного и фосфоспецифического антитела, которое распознает эпитопные фосфоры Rab10, такие как моноклональные антитела кролича MJFF-pRab10. Он использует нейтрофилы периферической крови человека, потому что периферическая кровь легко доступна и нейтрофилы являются обильным и однородным компонентом. Важно отметить, что нейтрофилы выражают относительно высокий уровень как LRRK2, так и Rab10. Потенциальным недостатком нейтрофилов является их высокая внутренняя активность протеазы серин, что требует использования очень мощных ингибиторов протеазы, таких как органофосфор нейротоксин diisopropylfluophosphate (DIFP) как часть буфера лизиса. Тем не менее, нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования активности пути киназы LRRK2 в vivo и должны быть рассмотрены для включения в коллекции PD биопозиторий.

Introduction

Попытки замедлить или остановить болезнь Паркинсона (PD) до сих пор не увенчались успехом. Открытие гиперактивации мутаций в лейцине богатых повторить киназу 2 (LRRK2), которые вызывают и / или увеличить риск для PD привело к развитию ингибиторов киназы LRRK21,2,3. Они уже вступили клинических испытаний4. Точная функция LRRK2 неясна, но основным прогрессом стало выявление подмножества белков Rab GTPase, включая Rab10, как первые добросовестные физиологические субстраты киназы LRRK25,6,7. Ключевыми проблемами в эпоху болезнеязычной терапии являются биохимические маркеры статуса активации активации LRRK2 и целевое участие ингибиторов киназы LRRK2.

До сих пор основным фармакокинетическим маркером для ингибиторов LRRK2 in vivo был кластер составно фосфорилированных остатков серина LRRK2, в частности, serine 935, которые становятся дефосфорилированными в ответ на различные ингибиторы LRRK28,9. Тем не менее, серин 935 фосфорилирования не коррелирует с внутренней клеточной активности киназы LRRK2, потому что это непосредственно не фосфорилируется LRRK2 и до сих пор фосфорилируется в киназе неактивных LRRK210. Активность киназы LRRK2 хорошо коррелирует с аутофосфорилированием серина 1292, но в практическом плане это не подходит для эндогенной активности киназы LRRK2 путем иммуноблотного анализа экстрактов цельных клеток из-за отсутствия надежных и фосфоспецифических антител для этого сайта10,11.

Мы разработали надежный и простой анализ для количественной оценки LRRK2 киназы пути деятельности в человеческих периферических клеток крови, что меры LRRK2 контролируемых фосфорилирования своего физиологического целевого белка Rab10 на threonine 7311. Периферическая кровь легко доступна с помощью шпинесекции, которая является низким риском и быстрой процедурой, которая вызывает минимальный дискомфорт. Мы фокусируемся на нейтрофилах периферической крови человека, потому что они составляют обильные (37-80% всех белых кровяных клеток) и однородную популяцию клеток, которая выражает относительно высокий уровень lRRK2 и Rab1011. Кроме того, периферийные нейтрофилы крови могут быть изолированы быстро и эффективно, используя иммуномагнитный негативный подход. Для обеспечения того, чтобы последующее наблюдаемое фосфорилирование Rab10 опосредовано LRRK2, каждая партия нейтрофилов инкубируется с или без мощного и селективного ингибитора киназы LRRK2 (мы используем и рекомендуем MLi-2)2,12. Затем следует клеточный лизис в буфере, содержащем ингибитор протеазы diisopropyl фторфосфат (DIFP), который необходим для подавления внутренней активности протеазы серина, которая, как известно, с высоким содержанием нейтрофилов13. Для окончательного анализа по количественному иммуноблоттингу, мы рекомендуем использовать моноклональное антитело кролика MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает Rab10 Thr73-фосфоэпитоп и не перекрестно реагирует с другими фосфорилированными белками Rab14. Избирательность и специфика этого антитела была подтверждена в моделях переэкспрессии различных белков Rab и A549 Rab10 нокаут омичи клеточной линии14. Таким образом, мы измеряем разницу в фосфорилировании Rab10 в нейтрофильных лизатах, которые лечились с мощным и селективным ингибитором киназы LRRK22. Кроме того, образцы могут быть проанализированы с помощью других методов, таких как количественная масс-спектрометрия.

В заключение, LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования является превосходным маркером LRRK2 киназы деятельности LRRK2 фосфорилирования на serine 935 и человека периферической крови нейтрофилов являются ценным ресурсом для ИССЛЕДОВАНИЯ PD в LRRK2. Наш протокол обеспечивает надежный и простой анализ для допроса LRRK2 пути деятельности в периферической крови нейтрофилов и позволяет биохимического стратификации лиц с повышенной активностью LRRK2 киназы15. Важно отметить, что такие люди могут извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.

Protocol

Согласно местному регулированию Великобритании, все манипуляции и пайпетирование человеческой крови проводятся в кабинете биологической безопасности категории 2. Все процедуры проводились в соответствии с местным советом по рассмотрению этики, и все участники дали информированное ?…

Representative Results

Наш анализ позволяет проводить допрос активации PD-ассоциированной киназы LRRK2 в нейтрофилах периферической крови человека с фосфорилированием LRRK2 в качестве считывания. Нейтрофилы являются однородной и обильной периферической популяции белых кровяных клеток, которая выражает высоки?…

Discussion

Принудительные клинические, генетические и биохимические данные указывают на важную роль для LRRK2 и, в частности, его функции киназы при болезни Паркинсона7. LRRK2 ингибиторы киназы были разработаны и вступают клинических испытаний2,,4,<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим здоровых добровольцев, которые любезно сдали кровь для настоящего исследования. Мы благодарим Фонд Майкла Джей Фокса по исследованию Паркинсона (MJFF) и руководство исследования Fox BioNet (FBN) за их поддержку и вклад в составление письменного протокола и видео. Мы благодарим профессора Александра Цимфрича из Венского университета в Австрии за тестирование нашего протокола и сотрудничество. Мы ценим вклад Пола Дэвиса в проект (генеральный менеджер MRC PPU). Мы также признаем отличную техническую поддержку MRC Protein Фосфорилирование и Ubiquitylation Unit (PPU), а именно химический синтез (Наталья Шпиро для синтеза MLi-2), MRC PPU реагентов и услуг иочистки антител групп (координируется Хилари Маклаухлан и Джеймс Хэсти). Мы благодарим Mhairi Towler и Фрейзера Мердока из Vivomotion за их помощь в создании видео и анимации. Мы благодарим Стива Соаве из 81 фильма за помощь в окончательной доработке. Эстер Саммлер поддерживается шотландским старшим клиническим академическим стипендией и получила финансирование от Великобритании Паркинсона (K-1706).

Materials

1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 MJFF-total Rab10 mouse antibody

References

  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).

Play Video

Cite This Article
Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson’s Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

View Video