Summary
Мутации в леуцине богатые повторить киназы 2 гена (LRRK2) вызывают наследственное заболевание Паркинсона. Мы разработали простой и надежный метод оценки lRRK2 контролируемого фосфорилирования Rab10 в нейтрофилов периферической крови человека. Это может помочь определить людей с повышенной активностью пути киназы LRRK2.
Abstract
Лейцин богатый повторить киназу 2 (LRRK2) является наиболее часто мутировавшим геном в наследственной болезни Паркинсона (PD) и все патогенные мутации LRRK2 привести к гиперактивации его функции киназы. Здесь мы описываем простой и надежный анализ для количественной оценки lRRK2 киназы пути деятельности в нейтрофилов периферической крови человека путем измерения LRRK2 контролируемых фосфорилирования одного из своих физиологических субстратов, Rab10 на threonine 73. Описанный анализ иммуноблоттинга требует полностью селективного и фосфоспецифического антитела, которое распознает эпитопные фосфоры Rab10, такие как моноклональные антитела кролича MJFF-pRab10. Он использует нейтрофилы периферической крови человека, потому что периферическая кровь легко доступна и нейтрофилы являются обильным и однородным компонентом. Важно отметить, что нейтрофилы выражают относительно высокий уровень как LRRK2, так и Rab10. Потенциальным недостатком нейтрофилов является их высокая внутренняя активность протеазы серин, что требует использования очень мощных ингибиторов протеазы, таких как органофосфор нейротоксин diisopropylfluophosphate (DIFP) как часть буфера лизиса. Тем не менее, нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования активности пути киназы LRRK2 в vivo и должны быть рассмотрены для включения в коллекции PD биопозиторий.
Introduction
Попытки замедлить или остановить болезнь Паркинсона (PD) до сих пор не увенчались успехом. Открытие гиперактивации мутаций в лейцине богатых повторить киназу 2 (LRRK2), которые вызывают и / или увеличить риск для PD привело к развитию ингибиторов киназы LRRK21,2,3. Они уже вступили клинических испытаний4. Точная функция LRRK2 неясна, но основным прогрессом стало выявление подмножества белков Rab GTPase, включая Rab10, как первые добросовестные физиологические субстраты киназы LRRK25,6,7. Ключевыми проблемами в эпоху болезнеязычной терапии являются биохимические маркеры статуса активации активации LRRK2 и целевое участие ингибиторов киназы LRRK2.
До сих пор основным фармакокинетическим маркером для ингибиторов LRRK2 in vivo был кластер составно фосфорилированных остатков серина LRRK2, в частности, serine 935, которые становятся дефосфорилированными в ответ на различные ингибиторы LRRK28,9. Тем не менее, серин 935 фосфорилирования не коррелирует с внутренней клеточной активности киназы LRRK2, потому что это непосредственно не фосфорилируется LRRK2 и до сих пор фосфорилируется в киназе неактивных LRRK210. Активность киназы LRRK2 хорошо коррелирует с аутофосфорилированием серина 1292, но в практическом плане это не подходит для эндогенной активности киназы LRRK2 путем иммуноблотного анализа экстрактов цельных клеток из-за отсутствия надежных и фосфоспецифических антител для этого сайта10,11.
Мы разработали надежный и простой анализ для количественной оценки LRRK2 киназы пути деятельности в человеческих периферических клеток крови, что меры LRRK2 контролируемых фосфорилирования своего физиологического целевого белка Rab10 на threonine 7311. Периферическая кровь легко доступна с помощью шпинесекции, которая является низким риском и быстрой процедурой, которая вызывает минимальный дискомфорт. Мы фокусируемся на нейтрофилах периферической крови человека, потому что они составляют обильные (37-80% всех белых кровяных клеток) и однородную популяцию клеток, которая выражает относительно высокий уровень lRRK2 и Rab1011. Кроме того, периферийные нейтрофилы крови могут быть изолированы быстро и эффективно, используя иммуномагнитный негативный подход. Для обеспечения того, чтобы последующее наблюдаемое фосфорилирование Rab10 опосредовано LRRK2, каждая партия нейтрофилов инкубируется с или без мощного и селективного ингибитора киназы LRRK2 (мы используем и рекомендуем MLi-2)2,12. Затем следует клеточный лизис в буфере, содержащем ингибитор протеазы diisopropyl фторфосфат (DIFP), который необходим для подавления внутренней активности протеазы серина, которая, как известно, с высоким содержанием нейтрофилов13. Для окончательного анализа по количественному иммуноблоттингу, мы рекомендуем использовать моноклональное антитело кролика MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает Rab10 Thr73-фосфоэпитоп и не перекрестно реагирует с другими фосфорилированными белками Rab14. Избирательность и специфика этого антитела была подтверждена в моделях переэкспрессии различных белков Rab и A549 Rab10 нокаут омичи клеточной линии14. Таким образом, мы измеряем разницу в фосфорилировании Rab10 в нейтрофильных лизатах, которые лечились с мощным и селективным ингибитором киназы LRRK22. Кроме того, образцы могут быть проанализированы с помощью других методов, таких как количественная масс-спектрометрия.
В заключение, LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования является превосходным маркером LRRK2 киназы деятельности LRRK2 фосфорилирования на serine 935 и человека периферической крови нейтрофилов являются ценным ресурсом для ИССЛЕДОВАНИЯ PD в LRRK2. Наш протокол обеспечивает надежный и простой анализ для допроса LRRK2 пути деятельности в периферической крови нейтрофилов и позволяет биохимического стратификации лиц с повышенной активностью LRRK2 киназы15. Важно отметить, что такие люди могут извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Согласно местному регулированию Великобритании, все манипуляции и пайпетирование человеческой крови проводятся в кабинете биологической безопасности категории 2. Все процедуры проводились в соответствии с местным советом по рассмотрению этики, и все участники дали информированное согласие.
1. Подготовка
- Подготовьте 0,1 мл edTA Stock Solution 1, содержащего 100 мМ EDTA в фосфатно-буферном сольне (PBS).
- Подготовьте 60 мл EDTA Stock Solution 2, содержащего 1 мМ EDTA в PBS.
- Подготовка лисис буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 1% (v/v) Тритон X-100, 1 мМ EGTA, 1 мМ Na3VO4, 50 mM NaF, 10 мМ -глицерофосфат, 5 мМ пирофосфат натрия, 0,27 М сахароза, 0,1% (v/v) - меркаптоэтанол, 1x ингибитор ный диптестовый коктейль, 1 мкг/мЛ микроцизтин-LR и 0,5 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обычно используют продукт без ЭДТА, но ЭДТА-содержащий препарат ингибитор протеазы также должен работать. Буфер лизиса можно сделать заранее без q-mercaptoethanol, ингибиторы протеазы, microcystin-LR, и DIFP, и храниться при 4 градусах Цельсия до использования. Убедитесь, что ингибиторы протеазы, микроцистин-LR и DIFP добавляются только непосредственно перед использованием.
ВНИМАНИЕ: DIFP является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью в дым капот после местной оценки риска для здоровья и безопасности. DIFP можно добавить в буфер лисиса и использовать немедленно. Кроме того, полный буфер лисиса, содержащий все другие компоненты, включая DIFP, может быть алицитирован и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующего использования в течение не менее 4 недель.
2. Нейтрофил изоляция от цельной крови
- Соберите 10 мл крови в трубку для сбора крови. Аккуратно перемешайте, перевернув трубки 7'8x.
- Перенесите 10 мл крови в коническую трубку 50 мл.
- Добавьте в кровь 100 л EDTA Stock Solution 1. Смешайте осторожно.
- Добавьте 500 кЛ изоляционных коктейлей (50 л/мл) из комплекта изоляции нейтрофилов(Таблица материалов)к всему образцу крови.
- Vortex магнитные бусы из нейтрофилов изоляции комплект для 30 s перед использованием для того, чтобы resuspend очень тонкие магнитные бусы.
- Добавьте 500 л магнитных бусинок в образец крови и аккуратно перемешайте, несколько раз инвертируя трубку.
- Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Заполните трубку до 50 мл с EDTA Stock Solution 2. Смешайте очень мягко pipetting вверх и вниз 2-3x.
- Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения трубки.
- Инкубировать в течение 10 минут на RT.
- Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом и избежать сбора и возмущения красных кровяных телец в нижней части трубки. Оставьте примерно 10 мл суспензии красных кровяных телец позади в нижней части трубки. - Vortex магнитные бусы для 30 s перед использованием и добавить 0,5 мл магнитных бусин в трубку, содержащую обогащенных нейтрофилов. Смешайте осторожно, инвертируя трубку.
- Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения.
- Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая содержит нейтрофилов в новую 50 мл конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки. - Для обеспечения полного удаления магнитных бусин из клеточной смеси поместите трубку, содержащую обогащенные клетки, в магнит.
- Инкубировать в течение 10 минут на RT.
- Тщательно pipette обогащенной подвески клетки, которая в настоящее время содержит чистые нейтрофилы в новую 50 мл конической трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около 5 мл подвески в нижней части трубки. - Смешайте изолированные ячейки с 1 мМ EDTA Stock Solution 2 до конечного объема около 41 мл. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
- Разделите раствор поровну на две трубки примерно по 20 мл в каждой трубке.
- Центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 мин.
- Во время этой центрифугации вынимайте запас ингибитора МЛИ-2 (концентрация 200 мкм/1000х) из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и оставляйте на РТ для последующего использования.
- Сразу после шага центрифугации и без агитации труб, слить супернатант, не нарушая нейтрофил гранулы. Resuspend каждой клетки гранулы в 10 мл клеточной культуры средств массовой информации (Таблица материалов) на RT, мягко pipetting клеток вверх и вниз 4x.
3. Ингибитор ингибитора киназы LRRK2 для лечения чистых нейтрофилов
- Этикетка одна трубка "DMSO" и другая трубка "MLi-2".
- К "DMSO" помечены трубки, добавить 10 зл ИЛ DMSO и аккуратно перемешать, пайпеттинг вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки. К "MLi-2" помечены трубки, добавить 10 зл и л из 200 ММ МЛи-2 бульонный раствор (окончательная концентрация 200 нм) и аккуратно перемешать, трубавверхи вверх и вниз 2x с 10 мл пипетки.
- Инкубировать образцы в течение 30 минут на RT. Смешайте осторожно инверсии каждые 10 минут во время инкубации.
- В инкубационный период удалите 0,5 M DIFP из морозильной камеры -80 градусов и поместите в капот дыма на льду. Удалить 1 мг/мЛ микроцизтин-LR бульонраствора из морозильной камеры -80 градусов и оставить на РТ оттаивать. Возьмите аликот (0,25 мл) из буфера лисиса из морозильной камеры, дайте ему разморозить на RT, а затем поместите его на лед для последующего использования.
- Подготовьте 1 мл среды клеточной культуры, содержащей 1 зл ИДСО, и назовите этот буфер повторной блокировки DMSO. Подготовьте 1 мл медиа-носителя RPMI, содержащего 1 кЛ из 200 ММ МЛи-2, и назовите этот буфер повторной подвески MLi-2.
- После 30 мин инкубационного периода, центрифуга обе трубы на 335 х г в течение 5 минут.
- Тщательно отбросьте супернатант в каждой трубке, не нарушая нейтрофил гранулы.
- Для DMSO помечены образца осторожно resuspend гранулы в 1 мл буфера перезагрузки DMSO и для MLi-2 помечены трубки, resuspend гранулы в 1 мл буфера resuspension MLi-2.
- Перенесите перекрываемые клеточные гранулы на соответствующие центрифугировые трубки с пометками "DMSO" и "MLi-2" и центрифугу обе трубы на 335 х г в течение 3 мин.
- Во время шага центрифугации подготовьте буфер лиза. В дымовый капот тщательно добавляйте 0,25 л раствора DIFP 0,5 М, а также 0,25 л 1 мг/мл микроцистина-LR в буфер излизы 0,25 мл. Смешайте и оставьте на льду до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте DIFP в буфер лисиса в пределах 15 минут клеточного лиза, потому что DIFP относительно нестабилен в водной растворе. - Сразу после центрифугации тщательно и полностью удалите весь супернатант пипеткой, не нарушая нейтрофильные гранулы, и помещайте трубки на лед.
- Немедленно добавьте 100 юаней буфера lysis содержа DIFP и microcystine-LR к каждой пробке. Используя пипетку 100-200 л, resuspend клеточные гранулы труба вверх и вниз около 5-10x.
- Вылеждь клетки на льду в течение 10 минут.
- Центрифуги трубки на 20000 х г в течение 15 минут при 4 кв КС, чтобы удалить мусор клеток.
- Перенесите супернационты «ДМСО» и «МЛи-2», содержащие нейтрофильные лизаты, в новые центрифугиваемые трубки. Отбросьте гранулы мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: лизаты нейтрофилов теперь готовы к использованию или могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию для будущего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наш анализ позволяет проводить допрос активации PD-ассоциированной киназы LRRK2 в нейтрофилах периферической крови человека с фосфорилированием LRRK2 в качестве считывания. Нейтрофилы являются однородной и обильной периферической популяции белых кровяных клеток, которая выражает высокий уровень как LRRK2 и Rab10 белков (Рисунок 1). Единственная другая популяция клеток среди оставшихся периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) с большим количеством копий обоих белков являются моноцитами, но они составляют лишь 2-12% белых кровяных клеток. Это указывает на то, что периферической крови нейтрофилов являются более подходящим и биоматрицы для изучения LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования.
При изоляции периферической крови нейтрофилов из 10 мл крови с нашей процедурой, между 0,5-0,75 мг общего белка лизата на одного донора был получен (Рисунок 2A), что достаточно для значительного количества иммуноблот анализа, для которых только 10 мкг на гель переулок не требуется. Проверка чистоты и жизнеспособности клеток не выполняется регулярно, мы продемонстрировали для трех здоровых доноров, что чистота изолированных нейтрофилов составляет от 94-98% и жизнеспособность клеток 99%, как это определено циклциометрического анализа потока с помощью CD66b-Fluorescein изоооциол нейтрофил маркер и 4',6-Diamidine-2'-phenydole dihydrochride(DAPI).
Хотя в центре внимания данной публикации является изоляция и обработка нейтрофилов из периферической крови, а не анализ количественного западного промокания, Рисунок 2B показывает, что моноклональное антитело MJFF-pRab10, которое специально обнаруживает фосфорилированный Rab10 при молотинове 73, выявило надежные сигналы в образцах нейтрофилов, которые были заметно подавлены лечением мощным и специфическим ингибитором киназы LRRK2, в данном случае MLi-2.
Нейтрофилы содержат высокие уровни протеаз ырин, которые могут повлиять на последующий западный анализ помок. В то время как DIFP эффективно подавляет высокую активность протеазы у нейтрофилов, это мощный нейротоксин органофосфора и было бы желательно заменить его не менее эффективным, но менее токсичным ингибитором протеазы, таким как фенилметилсульфонил фторид (PMSF). Мы обнаружили, что Фосфорилирование Rab10 было одинаково хорошо сохранилось, когда DIFP был заменен PMSF в концентрации 2,5 мМ(рисунок 2C). Тем не менее, целостность белка LRRK2 была нарушена при использовании PMSF по сравнению с DIFP, предполагая, что более крупный белок LRRK2 более восприимчив к деградации(рисунок 2C).
Ранее мы показали, что другой PD-причиной гена мутации VPS35 D620N приводит к гиперактивации kinase LRRK2 еще неизвестным механизмом15. Нейтрофилы из трех человек с PD укрывательство болезнетворных гетерозиготных VPS35 D620N мутации были изолированы с помощью метода, описанного в этой статье (Рисунок 3). Образцы нейтрофилов из девяти здоровых доноров были изолированы как контроль15. Иммуноблотный анализ с использованием моноклонального антитела MJFF-pRab10 демонстрирует значительное, 3-кратный рост фосфорилирования Rab10 при thr 73 у нейтрофилов у пациентов Паркинсона с мутацией VPS35 D620N по сравнению с элементами управления. Общее выражение белка Rab10 аналогично во всех 12 образцах нейтрофилов.
Рисунок 1: Изобилие белков LRRK2 и Rab10 в иммунных клетках, изолированных от крови человека, используя данные, которые общедоступны в базе данных immprot (http://www.immprot.org)16. На графике показано количество белковых копий на клетку для LRRK2 и Rab10 в диапазоне периферических клеток иммунной крови, включая подмножества Т-клеток, В-клеток, моноцитов, НК-клеток, дендритных клеток и нейтрофилов гранулоцитов, базофилов и эозинофилов. Эта цифра была изменена с Fan et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Характеристика и анализ нейтрофилов периферической крови человека и важность DIFP для профилактики протеолитической деградации у нейтрофилов. (A) Нейтрофилы были выделены из всей крови трех здоровых доноров (A, B и C), показывающих чистоту, жизнеспособность и общий выход белка после лизиса клеток. (B) Нейтрофилы лечились с ингибитором киназы LRRK2 (MLi-2), затем лисицировали и подвергли количественному иммуноблоанализу с указанными антителами с помощью флуоресценции ближнего инфракрасного (NIR). (C) Нейтрофилы были выделены из двух здоровых доноров и лечение с 100 нМ МЛИ-2 в течение 30 мин. Клетки были лисицированы в присутствии либо 0,5 мМ DIFP или 2,5 мм PMSF блокировать активность протеазы серин у нейтрофилов. A и B были изменены из Мира и др.15, в то время как C был изменен с Fan et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Увеличение активности пути киназы LRRK2 у пациентов с болезнью Паркинсона, укрывающих гетерозигеоусную мутацию VPS35 D620N. Нейтрофилы были изолированы от девяти невозрастных здоровых элементов управления и трех пациентов PD с гетерозигойской мутацией VPS35 D620N. Клетки лечились с помощью или без 200 нм МЛи-2 в течение 30 минут до клеточного лиза. (A) В общей сложности 10 мкг цельного экстракта клеток подвергаются количественного иммуноблотного анализа с указанными антителами через ближне-инфракрасное (NIR) флуоресценции изображений. Иммуноблоты были количественно фосфо-Thr73 Rab10: общее соотношение Rab10 (B). Данные были проанализированы односторонней ANOVA с помощью многократного теста сравнения Туки. Данные, представленные в качестве средств и SD; р Злт; 0.0001. Эта цифра была изменена с Мир и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Принудительные клинические, генетические и биохимические данные указывают на важную роль для LRRK2 и, в частности, его функции киназы при болезни Паркинсона7. LRRK2 ингибиторы киназы были разработаны и вступают клинических испытаний2,,4,12. Таким образом, существует необходимость в использовании LRRK2 в качестве биомаркера для целевого взаимодействия, а также терпеливого расслоения. Наш протокол описывает надежный и простой анализ для анализа активации пути киназы LRRK2, отраженного фосфорилированием его физиологического субстрата Rab10 в однородном пуленейтрофиловпериферической крови человека 11,14. Для анализа с помощью количественного иммуноблоттинга мы настоятельно рекомендуем использовать высокоселективные фосфоспецифические антитела Rab10 (моноклональные антитела MJFF-pRab10)14,17.
Мы используем человека нейтрофилов, потому что они представляют собой однородное подмножество периферических клеток крови, которые составляют доминирующей популяции лейкоцитов17,18. Что еще более важно, нейтрофилы также имеют высокий уровень экспрессии белка LRRK2 и его подсостояние Rab10 (Рисунок 1)16. В отличие от этого, остальные подмножества лейкоцитов, которые составляют пул ПБМК, неоднородны с переменным и преимущественно низким выражением LRRK2 и Rab10. Моноциты и дендритные клетки имеют высокий уровень экспрессии, но являются низкими в общем изобилии16.
Хотя мы рекомендуем использовать EDTA vacutainer трубки для сбора крови, антикоагулянт, кроме ЭДТА может быть использован. Тем не менее, наличие EDTA имеет важное значение для производительности нейтрофилов изоляции комплекта. Поэтому мы рекомендуем добавить ЭДТА ко всему образцу крови, чтобы окончательная концентрация 1 мМ EDTA достигается, даже если используется альтернативный антикоагулянт. Использование нейтрофилов изоляционный комплект позволяет очищать нейтрофилов непосредственно из всей крови человека путем иммуномагнитного отрицательного отбора в относительно быстрый и простой способ. Количество доступных магнитов определяет, сколько образцов крови может быть обработано параллельно. Легко изолировать нейтрофилов от до шести образцов крови параллельно с помощью шести магнитов. Потенциальным недостатком является связанная с этим стоимость коммерческих комплектов изоляции нейтрофилов и требуемого магнита. Альтернативные методы изоляции нейтрофилов от цельной крови были описаны и полагаются на разделение градиента плотности или флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), которые имеют значительные недостатки. Первый значительно больше времени и трудоемких и по крайней мере в наших руках не так надежно и эффективно. Последний требует FACS машины и дополнительные шаги обработки должны быть введены, в том числе истощение красных кровяных телец и окрашивания клеток, добавив время в процессе изоляции клеток. В целом, иммуномагнитная изоляция быстро, генерирует очень чистый образец, и позволяет избежать чрезмерного обращения с клетками. Что касается обработки образцов, мы ранее показали, что задержка между сбором крови и нейтрофильной изоляции, по крайней мере до 24 ч не приводит к значительным изменениям или изменениям в результатах нашего анализа, который обеспечивает гибкость для будущей клинической эксплуатации11.
Процедура изоляции нейтрофилов сама по себе очень проста. Мы рекомендуем вихрь магнитных бусин перед каждым использованием. Важно также не беспокоить магнит, как только трубка находится внутри магнита, чтобы избежать турбулентности и выбивание магнитных бусин. Нейтрофилы обогащаются в подвеске несколькими раундами иммуномагнитного удаления всех нежелательных клеток. Следует позаботиться о том, чтобы не касаться стороны трубки, которая находится в контакте с магнитом и во время первого раунда изоляции (шаг 2.11), чтобы не возмущать красные кровяные тельца в нижней части трубки. После заключительного раунда пипетки обогащенной клеточной подвески в новую коническую трубку (шаг 2.24), нейтрофилы сразу же доступны для дальнейшей обработки. Если нейтрофилы используются для оценки активности LRRK2 в клетках, нейтрофилы затем делятся на две партии и после гранул центрифугации, повторно в любой ингибитор киназы LRRK2 (здесь, MLi-2) или DMSO, содержащий среду клеточной культуры. Как дефосфорилирование в присутствии и рефосфорилирования при отсутствии lRRK2 киназы ингибирование относительно быстрых событий, необходимо принять меры для обеспечения того, чтобы MLi-2 лечение нейтрофил фракции остается подвержены ингибитор киназы LRRK2 (например, MLi-2) до клеточного лиза (шаги 3.8-3.10).
В этом протоколе есть несколько этапов центрифугации с использованием конических труб 15 и 50 мл. В то время как мы регулярно используем указанные скорости центрифугирования в протоколе, можно увеличить скорость центрифугирования до 400 х г без негативного влияния на жизнеспособность клеток. Это приводит к немного более твердые нейтрофильные клеточные гранулы, которые могли бы помочь уменьшить любую потенциальную потерю нейтрофилов материала во время декантирования и пайпеттинга от супернатантных шагов во время этого протокола. Это, вероятно, увеличит урожайность с точки зрения общего количества полученного белка. Потенциальная проблема заключается в том, что более высокая сила центрифугации может активировать нейтрофилов и потенциально влиять на последующий анализ. Наша общая рекомендация заключается в том, чтобы обрабатывать нейтрофилов на каждом этапе протокола как можно более мягко.
Наш протокол использует сильнодействующий ингибитор протеазы серина DIFP (0,5 мМ) как часть буфера лизиса нейтрофила. DIFP является мощным нейротоксином органофосфора, и, хотя мы исследовали альтернативные соединения, его добавление к буферу лизиса имеет важное значение для анализа LRRK2 контролируемых Rab10 фосфорилирования в человека нейтрофилов иммуноблоттинг. Например, замена DIFP с 1% (w/v) SDS была использована для лизи нейтрофилов в других исследованиях19 и привела к значительной деградации белка до такой степени, что иммуноблоттинг для LRRK2, Rab10, и даже КОНТРОЛЬ загрузки GAPDH не дали сигнала, тем самым подчеркивая важность в том числе очень мощный протеазис в лисисе). При замене DIFP с менее мощным, но и менее токсичными ингибитором протеазы серина PMSF на 2,5 мм, фоспорирование Rab10 хорошо сохранилось, но более крупный белок LRRK2 подвергся значительной деградации(рисунок 2C). Для того, чтобы свести к минимуму обработку раствора запаса DIFP, буфер лисиса, содержащий DIFP, может быть подготовлен партиями, алицитированным и хранящимся при -20 градусах по Цельсию или -80 градусов по Цельсию11. Что касается анализа с помощью количественного иммуноблоттинга, то крайне важно использовать фосфоспецифическое антитело, которое, как было доказано, избирательно подходит только для одного фосфорилированного белка Rab LRRK2, такого как антитела MJFF-pRab10, используемые для наших исследований14.
Протокол также может быть масштабирован с использованием максимального объема цельной крови до 25 мл, что является пределом, который может быть обработан в одной изоляционной процедуры с помощью одного магнита, который способен удерживать 50 мл конических труб. Единственными шагами, которые потребуюткорректировки, являются шаг 2.4 (добавляя 50 qL изоляционных коктейлей на мл крови), шаги 2.6 и 2.12 (добавляя 50 л магнитных шариков на мл крови), и пропорциональное увеличение объема буфера лизиса для нейтрофиловиса в шаге 3.12. Все остальные шаги могут быть идентичны.
Таким образом, наш протокол описывает простой и надежный метод изоляции нейтрофилов человека от периферической крови. Нейтрофилы могут быть обработаны с и без мощного и конкретного ингибитора киназы LRRK2, чтобы позволить количественной оценки LRRK2 контролируемых фосфорилирования Rab10 in vivo. Это может быть полезно для стратации лиц в соответствии с LRRK2 киназы пути деятельности и для выявления тех, с гиперактивации пути, которые могли бы извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2. Хотя это будет маловероятно, в случае для большинства людей с PD, в частности, идиопатический PD, наш анализ уже был успешно развернут в лицах, несущих редкие, гетерозиготные мутации в другом PD-ассоциированных генов, VPS35 D620N, где LRRK2 киназы путь активность значительно увеличивается на еще неизвестный механизм15. Мы ранее рассмотрели LRRK2 контролируемых Rab 10 фосфорилирования уровней в небольшом количестве лиц, несущих более распространенные LRRK2 G2019S мутации, которая, как известно, активировать LRRK2 киназы деятельности лишь скромно в разы около двух без обнаружения существенной разницы по сравнению с контроля и пациентов с идиопатической PD с нашей анализ11,14. Это и дальнейшие неопубликованные данные свидетельствуют о том, что LRRK2 киназы деятельности, вероятно, требует увеличения йgt;3x для того, чтобы дать значительный результат с помощью количественного иммуноблоттинга. Тем не менее, чувствительность для обнаружения активации пути киназы LRRK2, вероятно, может быть увеличена при развертывании современной технологии масс-спектрометрии.
Мы предполагаем, что нейтрофилы являются ценным ресурсом для исследования болезни Паркинсона в LRRK2 киназы пути деятельности и может помочь выявлению лиц, которые могли бы извлечь выгоду из будущего лечения ингибитора киназы LRRK2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим здоровых добровольцев, которые любезно сдали кровь для настоящего исследования. Мы благодарим Фонд Майкла Джей Фокса по исследованию Паркинсона (MJFF) и руководство исследования Fox BioNet (FBN) за их поддержку и вклад в составление письменного протокола и видео. Мы благодарим профессора Александра Цимфрича из Венского университета в Австрии за тестирование нашего протокола и сотрудничество. Мы ценим вклад Пола Дэвиса в проект (генеральный менеджер MRC PPU). Мы также признаем отличную техническую поддержку MRC Protein Фосфорилирование и Ubiquitylation Unit (PPU), а именно химический синтез (Наталья Шпиро для синтеза MLi-2), MRC PPU реагентов и услуг иочистки антител групп (координируется Хилари Маклаухлан и Джеймс Хэсти). Мы благодарим Mhairi Towler и Фрейзера Мердока из Vivomotion за их помощь в создании видео и анимации. Мы благодарим Стива Соаве из 81 фильма за помощь в окончательной доработке. Эстер Саммлер поддерживается шотландским старшим клиническим академическим стипендией и получила финансирование от Великобритании Паркинсона (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
