Summary
Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.
Abstract
A rica incidência de quinase 2 (LRRK2) é o gene mais frequentemente mutado na doença hereditária de Parkinson (DP) e todas as mutações lRRK2 patogênicas resultam na hiperativação de sua função quinase. Aqui, descrevemos um ensaio fácil e robusto para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em neutrófilos de sangue periférico sénior humano medindo a fosforilação controlada por LRRK2 de um de seus substratos fisiológicos, Rab10 at threonine 73. A análise imunoblotting descrita requer um anticorpo totalmente seletivo e fosforespecífico que reconhece o rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como o anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10. Ele usa neutrófilos de sangue periféricos humanos, porque o sangue periférico é facilmente acessível e os neutrófilos são um constituinte abundante e homogêneo. É importante ressaltar que os neutrófilos expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10. Uma desvantagem potencial dos neutrófilos é sua alta atividade protease serinica intrínseca, que requer o uso de inibidores de protease muito potentes, como o organophosphorus neurotoxin diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte do tampão de lise. No entanto, os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa sobre a atividade da via de quinase LRRK2 in vivo e devem ser considerados para inclusão em coleções biorepositórias de DP.
Introduction
As tentativas de retardar ou parar a doença de Parkinson (DP) falharam até agora. A descoberta de mutações hiperativanas na rica incidência repetição quinase 2 (LRRK2) que causam e/ou aumentam o risco de DP levou ao desenvolvimento de inibidores de quinase LRRK21,2,3. Estes já entraram em ensaios clínicos4. A função exata do LRRK2 não é clara, mas um grande avanço tem sido a identificação de um subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluindo Rab10, como os primeiros substratos fisiológicos de boa fé da quinase LRRK25,6,7. Os principais desafios na era da terapêutica modificadora de doenças são marcadores bioquímicos do status de ativação da quinase LRRK2 e o engajamento alvo dos inibidores da quinase LRRK2.
Até agora, o principal marcador farmacocinético para inibidores LRRK2 in vivo tem sido um aglomerado de resíduos serinas constitutivamente fosforilados de LRRK2, em particular serino 935, que se tornam defosforilados em resposta aos diversos inibidores lRRK28,9. No entanto, a fosforilação serina 935 não se correlaciona com a atividade intrínseca celular LRRK2 quinase porque não é diretamente fosforilada por LRRK2 e ainda é fosforilada em quinase-inativa LRRK210. A atividade de quinase LRRK2 correlaciona-se bem com a autofosforilação de serina 1292, mas não é em termos práticos uma leitura adequada para a atividade endógena lRRK2 quinase por análise imunoblot de extratos celulares inteiros devido à atual falta de anticorpos confiáveis e fosfoespecíficos para este site10,11.
Desenvolvemos um ensaio robusto e fácil para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em células sanguíneas periféricas humanas que mede a fosforilação controlada por LRRK2 de sua proteína alvo fisiológica Rab10 em threonine 7311. O sangue periférico é facilmente acessível por venesection, que é um procedimento de baixo risco e rápido que causa desconforto mínimo. Focamos em neutrófilos de sangue periféricos humanos porque eles constituem uma população abundante (37-80% de todos os glóbulos brancos) e células homogêneas que expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab1011. Além disso, os neutrófilos sanguíneos periféricos podem ser isolados de forma rápida e eficiente, empregando uma abordagem negativa imunomagnética. Para garantir que a fosforilação rab10 subseqüente observada seja mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos é incubado com ou sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK2 (usamos e recomendamos MLi-2)2,12. Isso é seguido por lise celular em um tampão contendo o inibidor de protease fluorofosfato de diisopropílico (DIFP), que é necessário para suprimir a atividade de protease serina intrínseca que é conhecida por ser alta em neutrófilos13. Para a análise final por imunoblotação quantitativa, recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10 que detecta especificamente o Rab10 Thr73-phosphoepitope e não reage cruzadamente com outras proteínas rab fosforiladas14. A seletividade e especificidade deste anticorpo foi validada em modelos de superexpressão de diferentes proteínas Rab e uma linha de células knock-out A549 Rab1014. Assim, medimos a diferença na fosforilação rab10 em lisatos neutrófilos que foram tratados com e sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK22. Alternativamente, as amostras também poderiam ser analisadas por outros métodos, como espectrometria de massa quantitativa.
Em conclusão, a fosforilação rab10 controlada por LRRK2 é um marcador superior da atividade de quinase LRRK2 à fosforilação LRRK2 na serina 935 e os neutrófilos de sangue periféricos humanos são um recurso valioso para a pesquisa de PD em LRRK2. Nosso protocolo fornece um ensaio robusto e fácil para interrogar a atividade da via LRRK2 em neutrófilos sanguíneos periféricos e permite a estratificação bioquímica de indivíduos com aumento da atividade de quinase LRRK215. É importante ressaltar que esses indivíduos podem se beneficiar de futuros tratamentos inibidores de quinase LRRK2.
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Protocol
De acordo com a regulamentação local do Reino Unido, todas as manipulações e pipetting de sangue humano são realizadas em um gabinete de segurança biológica de categoria 2. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o conselho de ética local e todos os participantes forneceram consentimento informado.
1. Preparação
- Prepare 0,1 mL de EDTA Stock Solution 1 contendo EDTA de 100 mM em solução salina tamponada por fosfato (PBS).
- Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 contendo 1 mM EDTA em PBS.
- Prepare o tampão de lyse contendo 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerosfato, pirofosfato de sódio de 5 mM, 0,27 M sacarose, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol, 1x coquetel inibidor de protease, 1 μg/mL microcistona-LR e 0,5 mM de fluorofosfato diisopropyl (DIFP).
NOTA: Os autores usam rotineiramente um produto livre de EDTA, mas um coquetel inibidor de protease contendo EDTA também deve funcionar. O tampão de lyse pode ser feito com antecedência sem o β-mercaptoetanol, inibidores de protease, microcistina-LR e DIFP, e armazenado a 4 °C até o uso. Certifique-se de que o β-mercaptoetanol, inibidores de protease, microcistina-LR e DIFP só é adicionado imediatamente antes do uso.
ATENÇÃO: O DIFP é tóxico e deve ser tratado com cuidado em uma capa de fumaça após avaliação local de riscos de saúde e segurança. O DIFP pode ser adicionado ao buffer de lysis e usado imediatamente. Alternativamente, o buffer de lyse completo contendo todos os outros componentes, incluindo DIFP, pode ser alicitado e armazenado a -80 °C para uso subsequente por pelo menos 4 semanas.
2. Isolamento neutrophil de sangue total
- Coletar 10 mL de sangue em um tubo de coleta de sangue. Misture suavemente invertendo tubos 7-8x.
- Transfira 10 mL de sangue para um tubo cônico de 50 mL.
- Adicione 100 μL de EDTA Stock Solution 1 ao sangue. Misture delicadamente.
- Adicione 500 μL do coquetel de isolamento (50 μL/mL) do kit de isolamento neutrófilo(Table of Materials)à amostra de sangue completa.
- Vórtice as contas magnéticas do kit de isolamento de neutrófilos para 30 s antes de usar, a fim de resuspender as finas contas magnéticas.
- Adicione 500 μL das contas magnéticas à amostra de sangue e misture suavemente invertendo o tubo várias vezes.
- Incubar à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
- Encha o tubo a 50 mL com a solução de estoque EDTA 2. Misture muito suavemente pipetando para cima e para baixo 2-3x.
- Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar a agitação subseqüente do tubo.
- Incubar por 10 min no RT.
- Pipeette cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que contém os neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mL.
NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã e evite a coleta e perturbação dos glóbulos vermelhos na parte inferior do tubo. Deixe aproximadamente 10 mL da suspensão de glóbulos vermelhos para trás na parte inferior do tubo. - Vórtice as contas magnéticas para 30 s antes do uso e adicionar 0,5 mL das contas magnéticas ao tubo que contém os neutrófilos enriquecidos. Misture suavemente invertendo o tubo.
- Incubar no RT por 5 min.
- Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar agitação subseqüente.
- Incubar no RT por 5 min.
- Pipeette cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que contém os neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mL.
NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã. Deixe aproximadamente 5 mL da suspensão na parte inferior do tubo. - Para garantir a remoção completa das contas magnéticas da mistura celular, coloque o tubo contendo as células enriquecidas no ímã.
- Incubar por 10 min no RT.
- Cuidadosamente pipeette a suspensão celular enriquecida que agora contém neutrófilos puros em um novo tubo cônico de 50 mL.
NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã. Deixe aproximadamente 5 mL da suspensão na parte inferior do tubo. - Misture as células isoladas com a solução de estoque EDTA 2 de 1 mM para um volume final de aproximadamente 41 mL. Pipeta para cima e para baixo para misturar.
- Divida a solução igualmente em dois tubos com aproximadamente 20 mL em cada tubo.
- Centrifugar ambos os tubos a 335 x g por 5 min.
- Durante esta centrifugação, tire o estoque inibidor MLi-2 (concentração de 200 μM/1.000x) do congelador -80 °C e deixe no RT para uso subsequente.
- Imediatamente após o passo de centrifugação e sem agitação dos tubos, despeje o sobrenadante sem perturbar as pelotas de neutrófilos. Ressuspensão de cada pelota celular em 10 mL de mídia de cultura celular(Tabela de Materiais)em RT, encanando suavemente as células para cima e para baixo 4x.
3. Tratamento inibidor de quinase LRRK2 de neutrófilos puros
- Etiquetar um tubo "DMSO" e o outro tubo "MLi-2".
- Ao tubo rotulado "DMSO", adicione 10 μL de DMSO e misture suavemente, pipetando para cima e para baixo 2x com uma pipeta de 10 mL. Ao tubo rotulado "MLi-2", adicione 10 μL de 200 μM MLi-2 solução de estoque (concentração final 200 nM) e misture suavemente encanando para cima e para baixo 2x com uma pipeta de 10 mL.
- Incubar as amostras por 30 min em RT. Misture suavemente por inversão a cada 10 min durante a incubação.
- Durante o período de incubação, remova o estoque de 0,5 M DIFP do congelador -80 °C e coloque em uma coifa de fumaça no gelo. Remova a solução de estoque de microcistina-LR de 1 mg/mL do congelador -80 °C e deixe no RT para descongelar. Retire uma alíquota (0,25 mL) do tampão de lyse do congelador, deixe-o descongelar em RT e, em seguida, coloque-o no gelo para uso subsequente.
- Prepare 1 mL de meio de cultura celular contendo 1 μL de DMSO e chame este buffer de resuspensão DMSO. Prepare 1 mL de mídia RPMI contendo 1 μL de 200 μM MLi-2 e chame este buffer de resuspensão MLi-2.
- Após o período de incubação de 30 min, centrifuge ambos os tubos a 335 x g por 5 min.
- Descarte cuidadosamente o sobrenadante em cada tubo sem perturbar a pelota de neutrófilos.
- Para a amostra rotulada DMSO resuspender suavemente a pelota em 1 mL do tampão de resuspensão DMSO e para o tubo rotulado MLi-2, resuspenda a pelota em 1 mL do tampão de resuspensão MLi-2.
- Transfira as pelotas de células resuspensas para tubos de centrifugação correspondentes rotulados como "DMSO" e "MLi-2" e centrífugaambos ambos os tubos a 335 x g por 3 min.
- Durante a etapa de centrifugação, prepare o tampão de lyse. Na capa de fumaça adicione cuidadosamente 0,25 μL de solução DIFP de 0,5 M, bem como 0,25 μL de microcistina-LR de 1 mg/mL ao tampão de lyse de 0,25 mL. Misture e deixe no gelo até o uso.
NOTA: Adicione DIFP ao buffer de lyse dentro de 15 minutos de lyse celular, porque o DIFP é relativamente instável em uma solução aquosa. - Imediatamente após a centrifugação, remova cuidadosamente e completamente todo o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar a pelota de neutrófilos e coloque os tubos no gelo.
- Adicione imediatamente 100 μL de tampão de lyse contendo DIFP e microcistina-LR a cada tubo. Usando uma pipeta de 100-200 μL, resuspenda as pelotas celulares encantando para cima e para baixo cerca de 5-10x.
- Lyse as células no gelo por 10 min.
- Tubos de centrífuga a 20.000 x g por 15 min a 4 °C para remover detritos celulares.
- Transfira os supernatantes "DMSO" e "MLi-2" contendo os lisatos neutrófilos para novos tubos de centrifugação. Descarte a pelota de detritos.
NOTA: Os lisatos neutrófilos estão agora prontos para uso ou podem ser congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para análise futura.
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Representative Results
Nosso ensaio permite interrogar a ativação da quinase LRRK2 associada ao PD em neutrófilos de sangue periférico humano com a fosforilação Rab10 dependente de LRRK2 como leitura. Os neutrófilos são uma população homogênea e abundante de glóbulos brancos periféricos que expressa altos níveis tanto das proteínas LRRK2 quanto Rab10(Figura 1). A única outra população celular entre as células mononucleares periféricas remanescentes (PBMCs) com alto número de cópias de ambas as proteínas são monócitos, mas estes compõem apenas 2-12% dos glóbulos brancos. Isso indica que os neutrófilos sanguíneos periféricos são uma biomatriz mais adequada para estudar a fosforilação Rab10 controlada por LRRK2.
Ao isolar os neutrófilos de sangue periféricos de 10 mL de sangue com nosso procedimento, foi obtido entre 0,5-0,75 mg de lisato proteico total por doador (Figura 2A), o que é suficiente para um número significativo de análise de imunoblot para a qual são necessários apenas 10 μg por gel lane. Enquanto verificar a pureza e a viabilidade das células não é realizada rotineiramente, demonstramos para três doadores saudáveis que a pureza dos neutrófilos isolados está entre 94-98% e a viabilidade das células ~99% conforme determinada pela análise de citometria de fluxo usando o marcador de iothiocianato de cd66b−fluoresceína e 4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydrochloride (DAPI) para a coloração para viabilidade(Figura 2A).
Enquanto o foco desta publicação é o isolamento e processamento de neutrófilos do sangue periférico e não a análise por manchas ocidentais quantitativas, A Figura 2B demonstra que o anticorpo monoclonal MJFF-pRab10 que detecta especificamente rab10 fosforilado em threonine 73 revelou sinais robustos nas amostras de neutrófilos, que foram marcadamente suprimidos pelo tratamento com um potente e específico inibidor de quinase LRRK2, neste caso MLi-2.
Os neutrófilos contêm altos níveis de proteases serinas que podem afetar a análise subsequente das manchas ocidentais. Embora o DIFP suprima efetivamente a alta atividade protease em neutrófilos, é uma potente neurotoxina organofosforo e seria desejável substituí-la por um inibidor de protease igualmente eficaz, mas menos tóxico, como o flúor de fenilmesulfonnil (PMSF). Descobrimos que a fosforilação rab10 foi igualmente bem preservada quando o DIFP foi substituído pelo PMSF em uma concentração de 2,5 mM(Figura 2C). No entanto, a integridade da proteína LRRK2 foi comprometida ao usar PMSF em comparação com o DIFP, sugerindo que a maior proteína LRRK2 é mais suscetível à degradação (Figura 2C).
Já mostramos anteriormente que outra mutação genética causadora de PD VPS35 D620N resulta na hiperativação da quinase LRRK2 por um mecanismo ainda desconhecido15. Os neutrófilos de três pessoas com DP que abrigavam uma mutação heterozigosa causadora de doenças VPS35 D620N foram isolados usando o método descrito neste artigo (Figura 3). Amostras de neutrófilos de nove doadores saudáveis foram isoladas como controles15. A análise de imunoblot usando o anticorpo monoclonal MJFF-pRab10 demonstra um aumento significativo de ~3x na fosforilação rab10 em Thr 73 em neutrófilos de pacientes com Parkinson com uma mutação VPS35 D620N em comparação com os controles. A expressão total da proteína Rab10 é semelhante em todas as 12 amostras de neutrófilos.
Figura 1: Abundância de proteínas LRRK2 e Rab10 em células imunes isoladas do sangue humano usando dados que estão disponíveis publicamente no banco de dados immprot (http://www.immprot.org)16. O gráfico mostra o número de cópias proteicas por célula para LRRK2 e Rab10 em uma gama de células imunes sanguíneas periféricas, incluindo subconjuntos de células T, células B, monócitos, células NK, células dendríticas, e os granulócitos neutrófilos, basófilos e eosinófilos. Esta figura foi modificada a partir de Fan et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização e análise de neutrófilos de sangue periférico sértico humano e importância da DIFP para a prevenção da degradação proteolítica em neutrófilos. (A) Os neutrófilos foram isolados do sangue total de três doadores saudáveis (A, B e C) mostrando pureza, viabilidade e rendimento total da proteína após lise celular. (B) Os neutrófilos foram tratados com ou sem inibidor de quinase LRRK2 (MLi-2), depois lisados e submetidos à análise quantitativa de imunoblot com os anticorpos indicados através de imagens de fluorescência quase infravermelha (NIR). (C) Os neutrófilos foram isolados de dois doadores saudáveis e tratados com 100 nM MLi-2 por 30 min. As células foram lised na presença de 0,5 mM DIFP ou 2,5 mM PMSF para bloquear a atividade protease serina em neutrófilos. A e B foram modificados de Mir et al.15, enquanto C foi modificado de Fan et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aumento da atividade da via de quinase LRRK2 em pacientes com doença de Parkinson que abrigam uma mutação heteroziggeous VPS35 D620N. Os neutrófilos foram isolados de nove controles saudáveis não-compatíveis com a idade e três pacientes com DP com uma mutação heterozigosa causadora de doenças VPS35 D620N. As células foram tratadas com ou sem 200 nM MLi-2 por 30 min antes da lise celular. (A) Um total de 10 μg de extrato de célula inteira submetido à análise quantitativa de imunoblot com os anticorpos indicados através de imagens de fluorescência de infravermelho próximo (NIR). As imunoblots foram quantificadas para phospho-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio(B). Os dados foram analisados por ANOVA unidirecional com o teste de comparação múltipla de Tukey. Dados apresentados como meios ± DS; p < 0,0001. Esta figura foi modificada a partir de Mir et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Evidências clínicas, genéticas e bioquímicas convincentes apontam para um papel importante para o LRRK2 e, em particular, sua função quinase na doença de Parkinson7. Os inibidores da quinase LRRK2 foram desenvolvidos e estão entrando em ensaios clínicos2,4,12. Como tal, há a necessidade de explorar o LRRK2 como um biomarcador para o engajamento do alvo, bem como a estratificação do paciente. Nosso protocolo descreve um ensaio robusto e fácil para analisar a ativação da via de quinase LRRK2 como refletido pela fosforilação de seu substrato fisiológico Rab10 na piscina homogênea de neutrófilos de sangue periférico humano11,14. Para análise por imunoblotação quantitativa, recomendamos fortemente o uso de um anticorpo rab10 altamente seletivo fosfoespecífico (anticorpo monoclonal MJFF-pRab10)14,17.
Usamos neutrófilos humanos porque constituem um subconjunto homogêneo de células sanguíneas periféricas que compõem a população dominante de leucócitos17,18. Mais importante, os neutrófilos também têm altos níveis de expressão proteica de LRRK2 e seu subestado Rab10 (Figura 1)16. Em contraste, os subconjuntos restantes de leucócitos que compõem o pool de PBMCs são heterogêneos com variável e predominantemente baixa expressão de LRRK2 e Rab10. Monócitos e células dendríticas têm altos níveis de expressão, mas são baixos em abundância geral16.
Embora recomendamos o uso de tubos de coleta de sangue edta vacutainer, um anticoagulante diferente do EDTA pode ser usado. No entanto, a presença de EDTA é importante para o desempenho do kit de isolamento de neutrófilos. Por isso, recomendamos adicionar EDTA à amostra de sangue total para que uma concentração final de 1 mM EDTA seja alcançada mesmo se um anticoagulante alternativo for usado. O uso do kit de isolamento de neutrófilos permite purificar neutrófilos diretamente do sangue humano inteiro por seleção negativa imunomagnética de forma relativamente rápida e fácil. O número de ímãs disponíveis determina quantas amostras de sangue podem ser processadas em paralelo. É facilmente viável isolar neutrófilos de até seis amostras de sangue em paralelo usando seis ímãs. Uma desvantagem potencial é o custo associado para kits comerciais de isolamento de neutrófilos e o ímã necessário. Métodos alternativos para o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro foram descritos e dependem da separação gradiente de densidade ou da triagem celular ativada por fluorescência (FACS), que têm desvantagens significativas. O primeiro é significativamente mais tempo e trabalho intensivo e pelo menos em nossas mãos não é tão confiável e eficiente. Este último requer uma máquina FACS e medidas adicionais de manuseio precisariam ser introduzidas, incluindo o esgotamento de glóbulos vermelhos e coloração celular, adicionando tempo ao processo de isolamento celular. No geral, o isolamento imunomagnético é rápido, gera uma amostra altamente pura e evita o manuseio excessivo das células. Em relação ao processamento amostral, já mostramos anteriormente que um atraso entre a coleta de sangue e o isolamento de neutrófilos de pelo menos até 24 h não resulta em uma mudança ou variação significativa no resultado do nosso ensaio, o que proporciona flexibilidade para futura exploração clínica11.
O procedimento de isolamento de neutrófilos em si é muito fácil. Recomendamos vórticar as contas magnéticas antes de cada uso. Também é importante não perturbar o ímã uma vez que o tubo está dentro do ímã para evitar turbulência e desalojamento das contas magnéticas. Os neutrófilos estão sendo enriquecidos em suspensão por várias rodadas de remoção imunomagnética de todas as células indesejadas. Deve-se tomar cuidado para não tocar na lateral do tubo que está em contato com o ímã e durante a primeira rodada de isolamento (passo 2.11) para não perturbar os glóbulos vermelhos na parte inferior do tubo. Após a rodada final de pipetação da suspensão celular enriquecida em um novo tubo cônico (etapa 2.24), os neutrófilos estão imediatamente disponíveis para processamento contínuo. Se os neutrófilos forem usados para avaliar a atividade LRRK2 em células, os neutrófilos são então divididos em dois lotes e após a pelotização por centrifugação, resuspensos em um inibidor de quinase LRRK2 (aqui, MLi-2) ou DMSO contendo meio de cultura celular. Como a desfosforilação na presença e refosforilação na ausência de inibição de quinase LRRK2 são eventos relativamente rápidos, é preciso ter cuidado para garantir que a fração de neutrófilos tratados mLi-2 permaneça exposta a um inibidor de quinase LRRK2 (por exemplo, MLi-2) até a lse celular (passos 3.8-3.10).
Existem várias etapas de centrifugação neste protocolo usando tubos cônicos de 15 e 50 mL. Enquanto usamos rotineiramente as velocidades de centrifugação indicadas no protocolo, é possível aumentar a velocidade de centrifugação até 400 x g sem afetar negativamente a viabilidade das células. Isso resulta em uma pelota de célula sutrófilo ligeiramente mais firme que pode ajudar a reduzir qualquer perda potencial de material neutrófilo durante a decantação e pipetting fora das etapas sobrenatant durante este protocolo. Isso provavelmente aumentará o rendimento em termos de lysate protéico total obtido. Uma preocupação potencial é que uma força de centrifugação mais alta poderia ativar neutrófilos e potencialmente afetar a análise subseqüente. Nossa recomendação geral é lidar com neutrófilos durante cada etapa do protocolo o mais suavemente possível.
Nosso protocolo usa o inibidor de protease serina altamente potente DIFP (0,5 mM) como parte do tampão de lise neutrófilo. DIFP é uma potente neurotoxina organofosforo, e embora tenhamos investigado compostos alternativos, sua adição ao tampão de lise foi essencial para a análise da fosforilação Rab10 controlada por LRRK2 em neutrófilos humanos por imunoblotação. Por exemplo, a substituição do DIFP por 1% (w/v) SDS tem sido usada para lise neutrófilos em outros estudos19 e levou a uma degradação proteica significativa na medida em que a imunoblotação para LRRK2, Rab10, e até mesmo o controle de carregamento GAPDH não produziram um sinal, destacando assim a importância de incluir um inibidor de protease altamente potente no buffer de lise(Figura 2C). Ao substituir o DIFP pelo inibidor de protease serina menos potente, mas também menos tóxico, em 2,5 mM, a fosporilação rab10 foi bem preservada, mas a maior proteína LRRK2 sofreu degradação significativa(Figura 2C). Para minimizar o manuseio da solução de estoque DIFP, o buffer de lysis contendo DIFP pode ser preparado em lotes, alicitados e armazenados a -20 °C ou -80 °C11. No que diz respeito à análise por imunoblotação quantitativa, é primordial utilizar um anticorpo fosforespecífico que tenha sido demonstrado ser seletivo para apenas uma única proteína Rab fosforilada LRRK2, como o anticorpo MJFF-pRab10 utilizado em nossos estudos14.
O protocolo também pode ser ampliado usando um volume máximo de sangue total de até 25 mL, que é o limite que pode ser processado em um procedimento de isolamento usando um ímã, que é capaz de segurar tubos cônicos de 50 mL. Os únicos passos que precisariam de ajustes são a etapa 2.4 (adicionando 50 μL de coquetel de isolamento por mL de sangue), os passos 2.6 e 2.12 (adicionando 50 μL de contas magnéticas por mL de sangue), e um aumento proporcional no volume de tampão de lise para lise neutrófilo na etapa 3.12. Todos os outros passos podem ser mantidos idênticos.
Em resumo, nosso protocolo descreve um método fácil e robusto para isolar neutrófilos humanos do sangue periférico. Os neutrófilos podem então ser tratados com e sem um potente e específico inibidor de quinase LRRK2 para permitir a quantificação da fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 in vivo. Isso pode ser útil para estratificar os indivíduos de acordo com a atividade da via lRRK2 quinase e para identificar aqueles com hiperativação de vias que podem se beneficiar do futuro tratamento inibidor de quinase LRRK2. Embora este seja improvável o caso para a maioria das pessoas com DP, especificamente dp opático, nosso ensaio já foi implantado com sucesso em indivíduos portadores de uma mutação rara e heterozigosa em outro gene associado ao PD, VPS35 D620N, onde a atividade da via kinase LRRK2 é significativamente aumentada por um mecanismo ainda desconhecido15. Examinamos anteriormente os níveis de fosforilação Rab 10 controlados por LRRK2 em um pequeno número de indivíduos portadores da mutação LRRK2 G2019S mais comum que é conhecida por ativar a atividade de quinase LRRK2 apenas modestamente por um fator de cerca de dois sem detectar uma diferença significativa quando comparado aos controles e pacientes com DP idiopática com o nosso ensaio11,14. Este e outros dados não publicados sugerem que a atividade de quinase LRRK2 provavelmente requer um aumento de >3x, a fim de produzir um resultado significativo usando imunoblotting quantitativo. No entanto, a sensibilidade para detectar a ativação da via kinase LRRK2 pode provavelmente ser aumentada se implantar tecnologia de espectrometria de massa de última geração.
Sugerimos que os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa da doença de Parkinson na atividade da via de quinase LRRK2 e podem ajudar a identificar indivíduos que poderiam se beneficiar do futuro tratamento inibidor de quinase LRRK2.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos voluntários saudáveis que gentilmente doaram sangue para o presente estudo. Agradecemos à Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) e à liderança do estudo Fox BioNet (FBN) pelo apoio e contribuição ao protocolo escrito e ao vídeo. Agradecemos ao professor Alexander Zimprich, da Universidade de Viena, na Áustria, por testar nosso protocolo e colaboração. Valorizamos as contribuições de Paulo Davies para o projeto (gerente geral da PPU MRC). Também reconhecemos o excelente suporte técnico das equipes de purificação de anticorpos e de Fosforilação de Proteína mrc (PPU), ou seja, Síntese Química (Natalia Shpiro para sintetização MLi-2), Reagentes de Reagentes e Serviços de Purificação de Mrc PPU (coordenados por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos do MRC PPU e Services (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por Hilary McLauchlan e James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler e Fraser Murdoch da Vivomotion por sua ajuda na produção dos vídeos e animações. Agradecemos a Steve Soave, de 81 filmes, pela ajuda com as edições finais. Esther Sammler é apoiada por uma Bolsa Acadêmica Clínica Clínica Sênior Escocesa e recebeu financiamento do Reino Unido de Parkinson (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
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