Summary
الطفرات في الليوسيني الغنية تكرار جين كيناس 2 (LRRK2) تسبب مرض باركنسون الوراثية. لقد طورنا طريقة سهلة وقوية لتقييم الفوسفور الذي يسيطر عليه LRRK2 من Rab10 في العدلات الدم المحيطية البشرية. وهذا قد يساعد على تحديد الأفراد مع زيادة نشاط مسار كيناز LRRK2.
Abstract
الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) هو الجين الأكثر تحور في كثير من الأحيان في مرض باركنسون الوراثية (PD) وجميع الطفرات LRRK2 المسببة للأمراض يؤدي إلى فرط تنشيط وظيفتها كيناز. هنا، ونحن نصف قياس سهلة وقوية لقياس نشاط مسار كيناز LRRK2 في العدلات الدم المحيطية البشرية من خلال قياس الفوسفور LRRK2 التي تسيطر عليها واحدة من ركائزها الفسيولوجية، Rab10 في threonine 73. يتطلب تحليل المناعي الموصوف جسمًا مضادًا انتقائيًا وفوسفومحددًا تمامًا يتعرف على فوسفور epitope Rab10 Thr73 الذي سجله LRRK2 ، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من نوع MJFF-pRab10. ويستخدم العدلات الدم المحيطية البشرية, لأن الدم المحيطي يمكن الوصول إليها بسهولة والعدلات هي مكون وفيرة ومتجانسة. الأهم من ذلك، العدلات التعبير عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab10. عيب محتمل من العدلات هو نشاطها البروتياز سيرين الجوهرية العالية، مما يتطلب استخدام مثبطات البروتياز قوية جدا مثل السم العصبي العضوية diisopropylfluorophosphate (DIFP) كجزء من المخزن المؤقت الزل. ومع ذلك، فإن العدلات هي مورد قيم للبحث في نشاط مسار LRRK2 كيناز في الجسم الحي وينبغي النظر في إدراجها في مجموعات مستودعات PD الحيوية.
Introduction
فشلت محاولات إبطاء أو وقف مرض باركنسون (PD) حتى الآن. اكتشاف طفرات فرط التنشيط في الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) التي تسبب و / أو زيادة خطر PD أدى إلى تطوير مثبطات كيناز LRRK21،2،3. وقد دخلت هذه الآن التجارب السريرية4. وظيفة بالضبط من LRRK2 غير واضح، ولكن التقدم الرئيسي كان تحديد مجموعة فرعية من البروتينات راب GTPase، بما في ذلك Rab10، كأول ركائز الفسيولوجية حسن النية من كيناز LRRK25،6،7. التحديات الرئيسية في عصر العلاجات تعديل الأمراض هي العلامات الكيميائية الحيوية لحالة تنشيط الكيناز LRRK2 والمشاركة المستهدفة من مثبطات كيناز LRRK2.
حتى الآن، العلامة الدوائية الرئيسية لمثبطات LRRK2 في الجسم الحي كانت مجموعة من بقايا سيرين الفوسفورية التأسيسية من LRRK2، ولا سيما سيرين 935، التي تصبح dephosphorylated استجابة لمثبطات LRRK2 المتنوعة8،,9. ومع ذلك، سيرين 935 الفوسفور لا يرتبط مع نشاط الكيناز الخلوي الجوهري LRRK2 لأنه ليس الفوسفوري مباشرة من LRRK2 ولا يزال الفوسفورفي الكيناس غير نشط LRRK210. LRRK2 نشاط كيناز يرتبط بشكل جيد مع الفوسفور التلقائي من سيرين 1292، لكنه من الناحية العملية ليست قراءة مناسبة لنشاط LRRK2 كيناز الذاتية من خلال تحليل immunoblot من مقتطفات الخلية بأكملها بسبب عدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها وفوسفومحددة لهذا الموقع10،11.
لقد قمنا بتطوير قياس قوي وسهل لقياس نشاط مسار الكيناز LRRK2 في خلايا الدم المحيطية البشرية التي تقيس الفوسفور الذي تسيطر عليه LRRK2 من البروتين المستهدف الفسيولوجي Rab10 في threonine 7311. يمكن الوصول إلى الدم المحيطي بسهولة عن طريق venesection ، وهو إجراء منخفض الخطورة وسريع يسبب الحد الأدنى من عدم الراحة. نحن نركز على العدلات الدم المحيطية البشرية لأنها تشكل وفرة (37-80٪ من جميع خلايا الدم البيضاء) وخلايا متجانسة السكان التي تعبر عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab1011. وعلاوة على ذلك، يمكن عزل العدلات الدم المحيطية بسرعة وكفاءة من خلال استخدام نهج سلبي مغناطيسي مناعية. لضمان أن يتم التوسط في الفوسفور Rab10 لوحظ اللاحقة من قبل LRRK2، يتم احتضان كل دفعة من العدلات مع أو بدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية (نستخدم ونوصي MLi-2)2،,12. ثم يتبع ذلك الانزلات الخلوي في عازل يحتوي على البروثيديفوسفوسفوسفلور ثنائي البروبروبروبيل (DIFP)، وهو أمر ضروري لقمع نشاط البروتياز الرِسيّ الجوهري المعروف أنّه مرتفع في العدلات13. للتحليل النهائي عن طريق المناعي الكمي، نوصي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة MJFF-pRab10 الأرنب الذي يكشف على وجه التحديد Rab10 Thr73-phosphoepitope ولا عبر التفاعل مع البروتينات راب الفوسفورية الأخرى14. وقد تم التحقق من صحة الانتقائية وخصوصية هذا الأجسام المضادة في نماذج الإفراط في التعبير من البروتينات راب مختلفة وA549 Rab10 ضرب خارج خط الخلية14. وهكذا، فإننا قياس الفرق في الفوسفور Rab10 في العدلات التي تم التعامل معها مع وبدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية2. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضاً تحليل العينات بأساليب أخرى، مثل قياس الطيف الكمي للكتلة.
في الختام، LRRK2 التي تسيطر عليها Rab10 الفوسفور هو علامة متفوقة من نشاط كيناز LRRK2 إلى الفوسفور LRRK2 في سيرين 935 والبشر العدلات الدم المحيطية هي مورد قيمة لبحوث PD في LRRK2. بروتوكوللدينا يوفر فحص قوي وسهل لاستجواب نشاط مسار LRRK2 في العدلات الدم المحيطية ويسمح الطبقية الكيميائية الحيوية للأفراد مع زيادة LRRK2 نشاط كيناز15. الأهم من ذلك، قد يستفيد هؤلاء الأفراد من العلاج مثبطات الكيناز LRRK2 في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وفقا للوائح المحلية في المملكة المتحدة يتم إجراء جميع التلاعب والأنابيب من الدم البشري في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الفئة 2. وقد نُفِّمت جميع الإجراءات وفقاً للمجلس المحلي لاستعراض الأخلاقيات، وقدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة.
1- التحضير
- إعداد 0.1 مل من حل الأسهم EDTA 1 التي تحتوي على 100 mM EDTA في المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS).
- إعداد 60 مل من حل الأسهم EDTA 2 التي تحتوي على 1 mM EDTA في برنامج تلفزيوني.
- إعداد المخزن المؤقت lysis التي تحتوي على 50 mM Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.5)، 1٪ (v/v) تريتون X-100، 1 mM EGTA، 1 mM Na3VO4,50 mM NaF, 10 mM α-glycerophosphate, 5 mm الصوديوم بيروفوسفات, 0.27 M السكروز, 0.1% (v/v) α-mercaptoethanol, 1x كوكتيل مثبطات البروتياز, 1 ميكروغرام/مل microcystin-LR, و 0.5 mm diisopropyl fluorophosphate (DIFP).
ملاحظة: يستخدم المؤلفون بشكل روتيني منتجًا خاليًا من EDTA ، ولكن يجب أن يعمل أيضًا كوكتيل مثبط البروتياز المحتوي على EDTA. يمكن إجراء المخزن المؤقت الليسيس مقدما دون α-mercaptoethanol، مثبطات البروتياز، microcystin-LR، وDIFP، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. تأكد من أن يتم إضافة الـ α-mercaptoethanol ومثبطات البروتياز وmicrocystin-LR وDIFP مباشرة فقط قبل الاستخدام.
تنبيه: DIFP سام ويجب التعامل معه بعناية في غطاء الدخان بعد تقييم مخاطر الصحة والسلامة المحلية. يمكن إضافة DIFP إلى المخزن المؤقت للإزالة واستخدمه على الفور. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم اقتباس المخزن المؤقت الكامل الذي يحتوي على كافة المكونات الأخرى، بما في ذلك DIFP، وتخزينه عند -80 درجة مئوية للاستخدام اللاحق لمدة 4 أسابيع على الأقل.
2. عزل نيوتروفيل عن الدم كله
- جمع 10 مل من الدم في أنبوب جمع الدم. اخلط بلطف بواسطة أنابيب مقلوبة 7-8x.
- نقل 10 مل من الدم إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون EDTA 1 إلى الدم. مزيج بلطف.
- أضف 500 ميكرولتر من كوكتيل العزلة (50 ميكرولتر/مل) من طقم عزل العدلات(جدول المواد)إلى عينة الدم بأكملها.
- دوامة الخرز المغناطيسي من مجموعة عزل العدلات لمدة 30 ق قبل الاستخدام من أجل إعادة تعليق الخرز المغناطيسي غرامة جدا.
- أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى عينة الدم واخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقيقة.
- ملء أنبوب إلى 50 مل مع حل الأسهم EDTA 2. مزيج من قبل الأنابيب بلطف جدا صعودا وهبوطا 2-3x.
- ضع الأنبوب في المغناطيس وإزالة الغطاء لتجنب الهياج اللاحق للأنبوب.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- بعناية pipette تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي على العدلات في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس وتجنب جمع واضطراب خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. اترك حوالي 10 مل من تعليق خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. - دوامة الخرز المغناطيسي لمدة 30 ق قبل الاستخدام وإضافة 0.5 مل من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب يحتوي على العدلات المخصب. مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب.
- احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
- ضع الأنبوب في المغناطيس وإزالة الغطاء لتجنب الانفعالات اللاحقة.
- احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
- بعناية pipette تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي على العدلات في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس. اترك حوالي 5 مل من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب. - لضمان الإزالة الكاملة للحبات المغناطيسية من خليط الخلية ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المخصبة في المغناطيس.
- احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
- بعناية تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي الآن على العدلات النقية في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس. اترك حوالي 5 مل من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب. - خلط الخلايا المعزولة مع 1 mM EDTA حل الأسهم 2 إلى حجم النهائي من حوالي 41 مل. ماصة صعودا وهبوطا لخلط.
- تقسيم الحل بالتساوي إلى أنبوبين مع ما يقرب من 20 مل في كل أنبوب.
- الطرد المركزي على حد سواء أنابيب في 335 × ز لمدة 5 دقيقة.
- خلال هذا الطرد المركزي تأخذ MLi-2 مانع المخزون (200 μM/1000x التركيز) من الفريزر -80 درجة مئوية وترك في RT للاستخدام اللاحق.
- مباشرة بعد خطوة الطرد المركزي ودون هياج من الأنابيب، صب قبالة supernatant دون إزعاج الكريات العدلات. إعادة تعليق كل بيليه الخلية في 10 مل من الوسائط ثقافة الخلية(جدول المواد)في RT بواسطة الخلايا pipetting بلطف صعودا وهبوطا 4x.
3. LRRK2 كيناز مثبطالعلاج من العدلات النقية
- تسمية أنبوب واحد "DMSO" وأنبوب آخر "MLi-2".
- إلى أنبوب "DMSO" المسمى، إضافة 10 ميكرولتر من DMSO وتخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2x مع ماصة 10 مل. إلى أنبوب "MLi-2" المسمى، إضافة 10 ميكرولتر من 200 ميكرومتر MLi-2 محلول الأسهم (التركيز النهائي 200 nM) وتخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2x مع ماصة 10 مل.
- احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT. ميكس بلطف عن طريق عكس كل 10 دقيقة أثناء الحضانة.
- خلال فترة الحضانة، قم بإزالة مخزون 0.5 M DIFP من الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه في غطاء الدخان على الجليد. إزالة 1 ملغ / مل microcystin-LR محلول الأسهم من الفريزر -80 درجة مئوية وترك في RT لذوبان. خذ العليوت (0.25 مل) من المخزن المؤقت للليسيس خارج الفريزر ، واسمح له بإذابة الجليد في RT ، ثم وضعه على الجليد للاستخدام اللاحق.
- إعداد 1 مل من وسط ثقافة الخلية التي تحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO واستدعاء هذا المخزن المؤقت DMSO إعادة التعليق. قم بإعداد 1 مل من وسائط RPMI التي تحتوي على 1 ميكرولتر من 200 ميكرومتر MLi-2 واستدعاء هذا المخزن المؤقت MLi-2 إعادة التعليق.
- بعد فترة الحضانة 30 دقيقة، الطرد المركزي كلا الأنبوبين في 335 × ز لمدة 5 دقيقة.
- تجاهل بعناية supernatant في كل أنبوب دون إزعاج بيليه العدلات.
- للعينة المسماة DMSO بلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت DMSO إعادة التعليق وللأنبوب المسمى MLi-2، إعادة تعليق بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت MLi-2 إعادة التعليق.
- نقل كريات الخلية التي أعيد تعليقها إلى أنابيب الطرد المركزي المقابلة المسماة "DMSO" و "MLi-2" والطرد المركزي على حد سواء في 335 × ز لمدة 3 دقيقة.
- أثناء خطوة الطرد المركزي، قم بإعداد المخزن المؤقت للتليس. في غطاء الدخان بعناية إضافة 0.25 ميكرولتر من محلول DIFP 0.5 M بالإضافة إلى 0.25 ميكرولتر من 1 ملغم /مل microcystin-LR إلى المخزن المؤقت اللي 0.25 مل. تخلط وتترك على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: إضافة DIFP إلى المخزن المؤقت حل ضمن 15 دقيقة من حل الخلايا، لأن DIFP غير مستقر نسبياً في حل مائي. - مباشرة بعد الطرد المركزي، بعناية وتماما إزالة جميع supernatant مع ماصة دون إزعاج بيليه العدلات ووضع الأنابيب على الجليد.
- إضافة على الفور 100 ميكرولتر من العازلة الليليس التي تحتوي على DIFP وmicrocystine-LR إلى كل أنبوب. باستخدام ماصة 100-200 ميكرولتر، قم بإعادة تعليق كريات الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حوالي 5-10x.
- ليس الخلايا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- أنابيب الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة حطام الخلايا.
- نقل "DMSO" و "MLi-2" supernatants التي تحتوي على العدلات يلسات في أنابيب الطرد المركزي الجديدة. تخلص من بيليه الحطام.
ملاحظة: الليسات العدلة جاهزة الآن للاستخدام أو يمكن أن تكون المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح فحصنا باستجواب تفعيل الكيناس LRRK2 المرتبط بـ PD في العدلات الدموية الطرفية البشرية مع الفوسفور Rab10 المعتمد على LRRK2 كقراءة. العدلات هي متجانسة ووفيرة السكان خلايا الدم البيضاء الطرفية التي تعبر عن مستويات عالية من كل من البروتينات LRRK2 وRab10(الشكل 1). مجموعة الخلايا الأخرى الوحيدة بين الخلايا النووية الأحادية الدم المحيطية المتبقية (PBMCs) مع أعداد نسخ عالية من كلا البروتينات هي أحادية الخلايا ، ولكن هذه تشكل فقط 2-12 ٪ من خلايا الدم البيضاء. وهذا يشير إلى أن العدلات الدم المحيطية هي مصفوفة حيوية أكثر ملاءمة لدراسة الفوسفور RAB10 التي تسيطر عليها LRRK2.
عند عزل العدلات الدم المحيطية من 10 مل من الدم مع الإجراء لدينا, بين 0.5-0.75 تم الحصول على ملغ من إجمالي البروتين lysate لكل متبرع(الشكل 2A),وهو ما يكفي لعدد كبير من تحليل المناعة التي مطلوبة فقط 10 ميكروغرام لكل حارة هلام. أثناء التحقق من نقاء الخلايا وقابليتها للاستمرار لا يتم تنفيذها بشكل روتيني ، أظهرنا لثلاثة متبرعين أصحاء أن نقاء العدلات المعزولة بين 94-98٪ وقابلية الخلايا ~ 99٪ كما يحددها تحليل قياس الخلايا التدفق باستخدام علامة الايزوثوسيان الايزوثوسينات CD66b و 4'،6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrohydro (DAPI) تلطيخ لقابلية البقاء(الشكل 2A).
في حين أن التركيز في هذا المنشور هو عزل ومعالجة العدلات من الدم المحيطي وليس التحليل من قبل النشاف الغربي الكمي ، الشكل 2B يدل على أن MJFF-pRab10 الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تكتشف على وجه التحديد Rab10 الفوسفور في threonine 73 كشفت إشارات قوية في عينات العدلات، والتي تم قمعها بشكل ملحوظ عن طريق العلاج مع مثبط كيناز LRRK2 قوية ومحددة، في هذه الحالة MLi-2.
العدلات تحتوي على مستويات عالية من بروتيجات سيرين التي يمكن أن تؤثر على تحليل لطخة الغربية اللاحقة. في حين أن DIFP يقمع بشكل فعال نشاط البروتياز العالي في العدلات ، فهو سم عصبي قوي فوسفوري عضوي وسيكون من المستحسن استبداله بمثبط بروتياز فعال بنفس القدر ولكنه أقل سمية ، مثل فينيل ميثيل سولفونيل فلوريد (PMSF). وجدنا أن الفوسفور Rab10 تم الحفاظ عليه بشكل جيد على قدم المساواة عندما تم استبدال DIFP من قبل PMSF بتركيز 2.5 mM(الشكل 2C). ومع ذلك ، تم اختراق سلامة بروتين LRRK2 عند استخدام PMSF مقارنة بـ DIFP ، مما يشير إلى أن بروتين LRRK2 الأكبر أكثر عرضة للتدهور(الشكل 2C).
لقد أظهرنا سابقا أن آخر PD تسبب طفرة جينية VPS35 D620N النتائج في فرط تنشيط كيناز LRRK2 من قبل آلية غير معروفة حتى الآن15. تم عزل العدلات من ثلاثة أشخاص مع PD إيواء heterozygous المنتسببة في الطفرة VPS35 D620N باستخدام الطريقة الموضحة في هذه المقالة(الشكل 3). تم عزل عينات نيوتروفيل من تسعة متبرعين أصحاء كضوابط15. تحليل Immunoblot باستخدام MJFF-pRab10 الأجسام المضادة أحادية النسيلة يدل على زيادة كبيرة, ~ 3x في الفوسفور Rab10 في Thr 73 في العدلات من مرضى باركنسون مع طفرة VPS35 D620N مقارنة مع الضوابط. التعبير البروتين راب10 مجموع مماثل في جميع العينات 12 العدلات.
الشكل 1: وفرة من البروتينات LRRK2 وRab10 في الخلايا المناعية معزولة عن الدم البشري باستخدام البيانات التي تتوفر للجمهور على قاعدة بيانات immprot (http://www.immprot.org)16. يُظهر الرسم البياني عدد نسخ البروتين لكل خلية لـ LRRK2 وRab10 في مجموعة من خلايا المناعة في الدم المحيطية، بما في ذلك مجموعات فرعية من الخلايا التائية والخلايا B وأحادية الخلايا وخلايا NK والخلايا التشجرائية والنيوتروفيل الحبيبية والباسولفيل والإيوسينولين. وقد تم تعديل هذا الرقم من Fan et al.11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف وتحليل العدلات الدم المحيطية البشرية وأهمية DIFP للوقاية من التدهور البروتيني في العدلات. A (ب)تم التعامل مع العدلات مع أو بدون مثبط الكيناز LRRK2 (MLi-2)، ثم تحليلها وإخضاعها لتحليل المناعة الكمية مع الأجسام المضادة المشار إليها عن طريق الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) التصوير الفلوري. (C)تم عزل العدلات من اثنين من المتبرعين الأصحاء وتعامل مع 100 nM MLi-2 لمدة 30 دقيقة. A و B تم تعديله من Mir وآخرون15, في حين تم تعديل C من Fan et al.11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زيادة نشاط مسار كيناز LRRK2 في مرضى مرض باركنسون الذين يؤوون طفرة VPS35 D620N. تم عزل العدلات من تسعة ضوابط صحية غير متطابقة مع العمر وثلاثة مرضى PD يعانون من طفرة heterozygous VPS35 D620N المسببة للأمراض. عولجت الخلايا مع أو بدون 200 nM MLi-2 لمدة 30 دقيقة قبل تسييل الخلايا. (أ)ما مجموعه 10 ميكروغرام من استخراج الخلية بأكملها تخضع لتحليل المناعة الكمية مع الأجسام المضادة المشار إليها عن طريق الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) التصوير الفلوري. تم قياس المناعة لفوسفو-Thr73 Rab10: إجمالي نسبة Rab10(B). تم تحليل البيانات من قبل ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار المقارنة متعددة توكي. البيانات المقدمة كوسيلة ± SD؛ ع < 0.0001. وقد عُدِّل هذا الرقم من Mir et al.15. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشير الأدلة السريرية والوراثية والبيوكيميائية المقنعة إلى دور مهم لـ LRRK2 وخاصة وظيفتها في kinase في مرض باركنسون7. وقد وضعت مثبطات كيناز LRRK2 وتدخل التجارب السريرية2,,4,,12. على هذا النحو هناك حاجة لاستغلال LRRK2 كعلامة بيولوجية للمشاركة المستهدفة وكذلك الطبقية المرضى. لدينا بروتوكول يصف فحص قوية وسهلة لتحليل LRRK2 كيناز مسار تفعيل كما ينعكس من الفوسفور من الركيزة الفسيولوجية Rab10 في تجمع متجانسة من العدلات الدم المحيطية البشرية11,14. للتحليل من قبل المناعة الكمية، ونحن نوصي بشدة باستخدام الأجسام المضادة Rab10 phosphospecific عالية انتقائية (MJFF-pRab10 الأجسام المضادة أحادية النسيلة)14،17.
نحن نستخدم العدلات البشرية لأنها تشكل مجموعة فرعية متجانسة من خلايا الدم المحيطية التي تشكل السكان الكريات البيض المهيمنة17,18. والأهم من ذلك، العدلات لديها أيضا مستويات عالية من البروتين التعبير LRRK2 وRab10 تحت الدولة(الشكل 1)16. وعلى النقيض من ذلك، فإن المجموعات الفرعية المتبقية من الكريات البيض التي تشكل مجموعة من مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم غير متجانسة مع تعبير متغير ومنخفض في الغالب من LRRK2 وRab10. الخلايا الأحادية والخلايا التشجرية لديها مستويات التعبير عالية، ولكن منخفضة في وفرة عموما16.
في حين نوصي باستخدام أنابيب جمع الدم EDTA vacutainer، يمكن استخدام مضاد للتخثر غير EDTA. ومع ذلك ، فإن وجود EDTA مهم لأداء مجموعة العزل العدلات. ولذلك نوصي بإضافة EDTA إلى عينة الدم بأكملها بحيث يتم الوصول إلى تركيز نهائي من 1 mM EDTA حتى لو تم استخدام مضاد بديل للتخثر. يسمح استخدام مجموعة عزل العدلات وإعادة التّسْتَبُر مباشرةً من الدم البشري الكامل عن طريق الانتقاء السلبي المغنطيسي المغنطيسي بطريقة سريعة وسهلة نسبيًا. يحدد عدد المغناطيسات المتاحة عدد عينات الدم التي يمكن معالجتها بالتوازي. فمن الممكن بسهولة لعزل العدلات من ما يصل إلى ست عينات الدم بالتوازي باستخدام ستة مغناطيس. العيب المحتمل هو التكلفة المرتبطة بها لمجموعات العزل العدلات التجارية والمغناطيس المطلوب. وقد وصفت أساليب بديلة لعزل العدلات من الدم كله وتعتمد على الفصل الانحدار كثافة أو الفلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS), التي لها عيوب كبيرة. الأول هو أكثر بكثير من الوقت والعمالة كثيفة وعلى الأقل في أيدينا ليست موثوقة وفعالة. ويتطلب هذا الأخير آلة FACS وينبغي إدخال خطوات معالجة إضافية، بما في ذلك استنفاد خلايا الدم الحمراء وتلطيخ الخلايا، مما يضيف الوقت إلى عملية عزل الخلايا. بشكل عام ، فإن العزلة المغناطيسية المناعية سريعة ، وتولد عينة نقية للغاية ، وتتجنب الإفراط في التعامل مع الخلايا. فيما يتعلق بمعالجة العينة ، فقد أظهرنا سابقًا أن التأخير بين جمع الدم وعزل العدلات لمدة تصل إلى 24 ساعة على الأقل لا يؤدي إلى تغيير كبير أو اختلاف في نتيجة الفحص لدينا ، مما يوفر مرونة للاستغلال السريري المستقبلي11.
إجراء العزل العدلة نفسها سهلة جدا. نوصي دوامة الخرز المغناطيسي قبل كل استخدام. من المهم أيضا عدم إزعاج المغناطيس مرة واحدة في أنبوب داخل المغناطيس لتجنب الاضطراب وإزاحة من الخرز المغناطيسي. يتم إثراء العدلات في التعليق عن طريق عدة جولات من الإزالة المغناطيسية المناعية لجميع الخلايا غير المرغوب فيها. يجب الحرص على عدم لمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس وخلال الجولة الأولى من العزلة (الخطوة 2.11) حتى لا تعكر خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد الجولة النهائية من الأنابيب تعليق الخلية المخصب في أنبوب مخروطي جديد (الخطوة 2.24), العدلات متاحة على الفور لمعالجة فصاعدا. إذا تم استخدام العدلات لتقييم نشاط LRRK2 في الخلايا ، ثم يتم تقسيم العدلات إلى دفعتين وبعد الخفقان عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها إما في مثبط الكيناز LRRK2 (هنا ، MLi-2) أو DMSO التي تحتوي على وسط ثقافة الخلية. كما dephosphorylation في وجود وrephosphorylation في غياب تثبيط كيناز LRRK2 هي أحداث سريعة نسبيا، وينبغي توخي الحذر لضمان أن كسر العدلات MLi-2 المعالجة لا تزال معرضة لمثبط كيناس LRRK2 (على سبيل المثال، MLi-2) حتى تحل الخلية (الخطوات 3.8-3.10).
هناك العديد من خطوات الطرد المركزي في هذا البروتوكول باستخدام أنابيب مخروطية 15 و 50 مل. في حين أننا نستخدم بشكل روتيني سرعات الطرد المركزي المشار إليها في البروتوكول ، فمن الممكن زيادة سرعة الطرد المركزي تصل إلى 400 × ز دون التأثير سلبًا على صلاحية الخلايا. وهذا يؤدي إلى بيليه خلية العدلات أكثر حزما قليلا التي قد تساعد على الحد من أي خسارة محتملة للمواد العدلات أثناء decanting والأنابيب قبالة الخطوات الفائقة خلال هذا البروتوكول. ومن المرجح أن يؤدي ذلك إلى زيادة العائد من حيث إجمالي البروتين الذي تم الحصول عليه. ومن الشواغل المحتملة أن قوة الطرد المركزي الأعلى يمكن أن تنشط العدلات ويمكن أن تؤثر على التحليل اللاحق. توصيتنا العامة هي التعامل مع العدلات خلال كل خطوة من البروتوكول بلطف قدر الإمكان.
يستخدم بروتوكولنا مثبط البروتياز سيرين القوي للغاية DIFP (0.5 mM) كجزء من المخزن المؤقت لالعدلات. DIFP هو سم عصبي قوي فوسفوريعضوي ، وبينما قمنا بالتحقيق في المركبات البديلة ، فإن إضافة إلى عازل المحلول الليفي كان ضروريًا لتحليل الفوسفور Rab10 الذي يسيطر عليه LRRK2 في العدلات البشرية عن طريق المنابلة المناعية. على سبيل المثال ، تم استبدال DIFP مع 1 ٪ (ث / v) SDS لlyse العدلات في دراسات أخرى19 وأدى إلى تدهور كبير للبروتين إلى حد أن المناعي لLRRK2 ، Rab10 ، وحتى التحكم في التحميل GAPDH لم تسفر عن إشارة ، وبالتالي تسليط الضوء على أهمية تضمين مثبط اتصاز قوي للغاية في المخزن المؤقت الليسيس(الشكل 2C). عند استبدال DIFP مع أقل قوة، ولكن أيضا أقل سمية مثبطات البروتياز الرسيين PMSF في 2.5 mM، تم الحفاظ على فوسبوريلAtion Rab10 بشكل جيد، ولكن أكبر بروتين LRRK2 خضع تدهور كبير(الشكل 2C). من أجل تقليل التعامل مع حل مخزون DIFP ، يمكن إعداد المخزن المؤقت الذي يحتوي على DIFP على دفعات ، ويتم اقتباسه وتخزينه عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية11. فيما يتعلق بالتحليل عن طريق المناعي الكمي ، من الأهمية بمكان استخدام الأجسام المضادة فوسفومحددة التي ثبت أن تكون انتقائية لبروتين راب الفوسفوري LRRK2 واحد فقط ، مثل الأجسام المضادة MJFF-pRab10 المستخدمة في دراساتنا14.
ويمكن أيضا أن يتم توسيع البروتوكول باستخدام حجم أقصى من الدم الكامل تصل إلى 25 مل، وهو الحد الذي يمكن معالجته في إجراء عزل واحد باستخدام مغناطيس واحد، والتي هي قادرة على عقد 50 أنابيب مخروطية مل. الخطوات الوحيدة التي تحتاج إلى تعديلات هي الخطوة 2.4 (إضافة 50 ميكرولتر من كوكتيل العزلة لكل مل من الدم) ، والخطوتين 2.6 و 2.12 (إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل مل من الدم) ، وزيادة متناسبة في حجم العازلة اللازل لالعدلات في زل في الخطوة 3.12. يمكن أن تبقى جميع الخطوات الأخرى متطابقة.
باختصار، يصف بروتوكولنا طريقة سهلة وقوية لعزل العدلات البشرية عن الدم المحيطي. ويمكن بعد ذلك أن تعالج العدلات مع وبدون مثبط كيناز LRRK2 قوية ومحددة لتمكين القياس الكمي للالفوسفور LRRK2 التي تسيطر عليها من Rab10 في الجسم الحي. هذا يمكن أن تكون مفيدة للأفراد stتصديقه وفقا لLRRK2 نشاط مسار كيناز ولتحديد أولئك الذين يعانون من فرط المسار الذين قد يستفيدون من العلاج مثبطات كيناز LRRK2 في المستقبل. في حين أن هذا سيكون من غير المرجح بالنسبة لغالبية الناس مع PD، وتحديدا PD مجهول السبب، وقد تم بالفعل نشر لدينا اسايبنجاح في الأفراد الذين يحملون نادرة، طفرة heterozygous في جين آخر PD المرتبطة، VPS35 D620N، حيث يتم زيادة نشاط مسار كيناز LRRK2 بشكل كبير من قبل آلية نادرة15. كنا قد فحصنا سابقاLRRK2 التي تسيطر عليها مستويات الفوسفور راب 10 في عدد قليل من الأفراد الذين يحملون أكثر شيوعا LRRK2 G2019S الطفرة التي من المعروف لتنشيط LRRK2 نشاط kinase متواضعفقط من قبل عامل حوالي اثنين دون الكشف عن فرق كبير بالمقارنة مع الضوابط والمرضى الذين يعانون من PD idiopathic مع اثنين من اشير11،14. هذا والمزيد من البيانات غير المنشورة تشير إلى أن نشاط كيناز LRRK2 ربما يتطلب زيادة في > 3x من أجل تحقيق نتيجة كبيرة باستخدام المناعي الكمي. ومع ذلك، قد يتم زيادة حساسية الكشف عن تنشيط مسار LRRK2 كيناز إذا نشر أحدث تكنولوجيا قياس الطيف الكتلي.
نقترح أن العدلات هي مورد قيم لأبحاث مرض باركنسون في نشاط مسار الكيناز LRRK2 وقد يساعد في تحديد الأفراد الذين يمكن أن يستفيدوا من العلاج المستقبلي لمثبطات الكيناز LRRK2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونشكر المتطوعين الأصحاء الذين تكرموا بالتبرع بالدم لهذه الدراسة. نشكر مؤسسة مايكل ج. فوكس لأبحاث باركنسون (MJFF) وقيادة دراسة فوكس بيوتنت (FBN) على دعمهما ومدخلاتهما نحو البروتوكول المكتوب والفيديو. ونشكر البروفيسور ألكسندر زيمبريتش من جامعة فيينا في النمسا على اختبار بروتوكولنا وتعاوننا. نحن نقدر مساهمات بول ديفيز في المشروع (المدير العام لـ MRC PPU). ونحن ندرك أيضا الدعم التقني الممتاز من MRC البروتين الفوسفور ووحدة ubiquitylation (PPU) وهي التركيب الكيميائي (ناتاليا Shpiro لتجميع MLi-2)، MRC PPU الكواشف والخدمات فرق تنقية الأجسام المضادة (منسقة من قبل هيلاري ماكلوشلان وجيمس هاستي). نشكر مهيري تاولر وفريزر مردوخ من Vivomotion لمساعدتهما في صناعة مقاطع الفيديو والرسوم المتحركة. نشكر ستيف سواف من 81 فيلما للمساعدة في التحرير النهائي. يتم دعم استير ساملر من قبل الزمالة الأكاديمية السريرية العليا الاسكتلندية وتلقت التمويل من باركنسون في المملكة المتحدة (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
