Summary
ロイシンの変異は、リピートキナーゼ2遺伝子(LRRK2)が遺伝性パーキンソン病を引き起こす。我々はヒト末梢血中のRab10のLRRK2制御リン酸化を評価するための容易で、強い方法を開発した。これは、LRRK2キナーゼ経路活性の増加を有する個体を同定するのに役立つ可能性がある。
Abstract
ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)は、遺伝性パーキンソン病(PD)における最も頻繁に変異した遺伝子であり、すべての病原性LRRK2突然変異はキナーゼ機能の過剰活性化をもたらす。ここでは、ヒト末梢血中のLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための容易で強いアッセイを、その生理学的基質の1つであるRab10のLRRK2制御リン酸化をスレオニン73で測定することによって説明する。記載された免疫ブロット法は、MJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体のようなLRRK2によってリン酸化されたRab10 Thr73エピトープを認識する完全に選択的かつホスホウオンギクオン性抗体を必要とする。末梢血は容易にアクセス可能であり、好中球は豊富で均質な構成成分であるため、ヒト末梢血好中球を使用する。重要なことに、好中球はLRRK2とRab10の両方の比較的高いレベルを発現する。好中球の潜在的な欠点は、その高い固有のセリンプロテアーゼ活性であり、これは、溶菌緩衝液の一部として有機リンニューロトキシンジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)のような非常に強力なプロテアーゼ阻害剤の使用を必要とする。それにもかかわらず、好中球は、生体内のLRRK2キナーゼ経路活性の研究のための貴重なリソースであり、PDバイオレポジトリコレクションに含まれるように考慮されるべきである。
Introduction
パーキンソン病(PD)を遅くまたは停止する試みは、これまでのところ失敗しています。PDのリスクを引き起こすおよび/または増加するロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)における過剰活性化突然変異の発見は、LRRK2キナーゼ阻害剤11、2、32,3の開発につながっている。これらは今臨床試験4に入りました。LRRK2の正確な機能は不明であるが、大きな進歩は、LRRK2キナーゼ5、6、7,6,7の最初のボナフィデス生理基質としてRab10を含むRab GTPaseタンパク質のサブセットの同定であった。疾患修飾治療の時代における主な課題は、LRRK2キナーゼ活性化状態の生化学的マーカーおよびLRRK2キナーゼ阻害剤の標的関与である。
これまで、インビボにおけるLRRK2阻害剤の主な薬物動態マーカーは、LRRK2の構成的にリン酸化されたセリン残基のクラスターであり、特にセリン935は、多様なLRRK2阻害剤88,99に応答して脱リン酸化される。しかしながら、セリン935リン酸化は、LRRK2によって直接リン酸化されておらず、キナーゼ不活性LRRK210中に依然としてリン酸化されているため、固有の細胞LRRK2キナーゼ活性と相関しない。LRRK2キナーゼ活性はセリン1292の自己リン酸化とよく相関するが、実際には、この部位10,11,11に対する信頼できる、そしてホスホ特異的抗体の現在の欠如による全細胞抽出物の免疫ブロット分析による内因性LRRK2キナーゼ活性に適した読み出しではない。
我々は、ヒト末梢血細胞におけるLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための堅牢で容易なアッセイを開発し、その生理学的標的タンパク質Rab10のリン酸化をスレオニン7311で測定した。末梢血は、最小限の不快感を引き起こす低リスクかつ迅速な手順である静脈切除によって容易にアクセス可能である。ヒト末梢血好中球は、LRRK2とRab1011の両方の比較的高いレベルを発現する豊富な(全白血球の37~80%)と均質な細胞集団を構成するため、我々は注目する。さらに、末梢血好中球は、免疫磁気陰性アプローチを採用することにより、迅速かつ効率的に単離することができる。その後観察されたRab10リン酸化がLRRK2によって媒介されることを確実にするために、好中球の各バッチは、強力で選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらずインキュベートされる(我々はMLi-2を使用し、推奨する)2、12。,12この後、プロテアーゼ阻害剤ジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)を含む緩衝液中の細胞溶出が続き、好中球13において高くすることが知られているセリンプロテアーゼ活性を抑制するために必要である。定量免疫ブロット法による最終分析では、Rab10 Thr73-ホスホエピトープを特異的に検出し、他のリン酸化ラブタンパク質14と交差反応しないMJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体を用いることにお勧めします。この抗体の選択性と特異性は、異なるRabタンパク質の過剰発現モデルおよびA549 Rab10ノックアウト細胞ライン14において検証されている。従って、強力かつ選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤2の有無にかかわらず治療された好中球の溶血体におけるRab10リン酸化の差を測定する。あるいは、定量質量分析などの他の方法によってサンプルを分析することもできる。
結論として、LRRK2制御のRab10リン酸化は、セリン935におけるLRRK2リン酸化に対するLRRK2キナーゼ活性の優れたマーカーであり、ヒト末梢血好中球は、LRRK2に関するPD研究の貴重なリソースである。我々のプロトコルは、末梢血好中球中のLRRK2経路活性を問い合わすために堅牢で容易なアッセイを提供し、LRRK2キナーゼ活性15を増加した個体の生化学的階層化を可能にする。重要なことに、このような個体は、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受ける可能性がある。
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Protocol
現地の英国の規制によると、人間の血液のすべての操作とピペットは、カテゴリー2の生物学的安全キャビネットで行われます。すべての手続きは、地域の倫理審査委員会に従って行われ、すべての参加者はインフォームド・コンセントを提供しています。
1. 準備
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100 mM EDTAを含むEDTAストック溶液1の0.1 mLを調製します。
- PBSに1 mM EDTAを含むEDTAストック溶液2の60 mLを調製します。
- 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) を含むリシスバッファーを準備し、1%(v/v) トリトン X-100、 1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、50mM NaF、10 mM β-グリセロリン酸、5 mMピロリン酸ナトリウム、0.27 Mショ糖、0.1%(v/v)βメルカプトエタノール、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル、1 μg/mLシストシン-LR、0.5mMジプロピソリン酸(DPPリン酸)
注:著者らはEDTAフリー製品を日常的に使用していますが、EDTA含有プロテアーゼ阻害剤カクテルも機能するはずです。このリシス緩衝液は、β-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤、ミクロシスチン-LR、およびDIFPを使用せずに事前に作製し、使用するまで4°Cで保存することができる。β-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤、ミクロシスチン-LR、およびDIFPが使用直前にのみ添加されることを確認してください。
注意:DIFPは有毒であり、地元の健康と安全リスク評価に続いて、ヒュームフードで注意して処理する必要があります。DIFPは、リシスバッファーに添加し、すぐに使用することができます。あるいは、DIFPを含む他のすべての成分を含む完全なリシスバッファーを、少なくとも4週間の後で使用するために-80°Cでアリクォートして保存することができる。
2. 全血からの好中球の分離
- 血液採取管に10mLの血液を集める。チューブを7-8x反転して、そっと混ぜます。
- 血液10mLを50mL円錐管に移す。
- 血液に100μLのEDTAストック溶液1を加えます。やさしく混ぜます。
- 好中球分離キット(材料表)から全血サンプルに500 μLの分離カクテル(50 μL/mL)を加えます。
- 非常に微細な磁気ビーズを再懸濁させるために使用前に30 sの中等球分離キットからの磁気ビーズを渦。
- 血液サンプルに500μLの磁性ビーズを加え、チューブを数回反転して軽く混ぜます。
- 室温(RT)で5分間インキュベートします。
- EDTAストックソリューション2でチューブを50 mLに充填します。2~3倍の上下にピペットを軽く入れ込んで混ぜます。
- チューブをマグネットに入れ、蓋を取り外してチューブのその後の攪拌を避けます。
- RTで10分間インキュベートします。
- 新しい50 mL円錐形の管に好中球を含む濃縮された細胞懸濁液を注意深くピペット。
注:磁石に接触しているチューブの側面に触れないようにし、チューブの底部にある赤血球の採取と摂動を避けてください。約10mLの赤血球懸濁液をチューブの底に残します。 - 使用前に30 sの磁気ビーズをボルテックスし、濃縮された好中球を含むチューブに磁気ビーズの0.5 mLを追加します。管を逆にしてやさしく混ぜます。
- RTで5分間インキュベートします。
- チューブを磁石に入れ、蓋を取り外して、その後の動揺を避けます。
- RTで5分間インキュベートします。
- 新しい50 mL円錐形の管に好中球を含む濃縮された細胞懸濁液を注意深くピペット。
メモ:磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。チューブの底部に約5mLの懸濁液を残します。 - 細胞混合物から磁気ビーズを完全に除去するには、濃縮された細胞を含むチューブを磁石に入れます。
- RTで10分間インキュベートします。
- 新しい50 mL円錐形の管に今純粋な好中球を含んでいる濃縮された細胞懸濁液を慎重にピペット。
メモ:磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。チューブの底部に約5mLの懸濁液を残します。 - 分離した細胞を1 mM EDTAストックソリューション2と混合し、最終容積は約41mLにします。ピペットを上下に混ぜ合わせます。
- 各チューブに約20mLの2つのチューブに溶液を均等に分割します。
- 遠心分離機は335 x gで5分間の両方の管。
- この遠心分離の間にMLi-2阻害剤のストック(200 μM/1,000x濃度)を-80°Cの冷凍庫から取り出し、RTに放置して、その後使用します。
- 遠心分離ステップの直後とチューブの攪拌なしに、好中球ペレットを乱すことなく上清を注ぎます。各細胞ペレットを10mLの細胞培養培地(材料表)でRTで再懸濁し、細胞を上下に軽くピペット処理して4倍にします。
3. 純粋好中球のLRRK2キナーゼ阻害剤の治療
- 一方のチューブに「DMSO」と他のチューブ「MLi-2」のラベルを付けます。
- 「DMSO」ラベル付きチューブに、DMSOの10 μLを加え、10 mLピペットで2倍上下にピペットを加え、穏やかに混ぜます。「MLi-2」ラベル付きチューブに、200 μM MLi-2ストック溶液(最終濃度200 nM)の10 μLを加え、10 mLピペットで2倍上下にピペットを加え、穏やかに混ぜます。
- RTで30分間サンプルをインキュベートし、インキュベーション中に10分ごとに反転して穏やかに混ぜます。
- インキュベーション期間中、-80°Cの冷凍庫から0.5M DIFPストックを取り出し、氷の上のヒュームフードに入れてください。-80°C冷凍庫から1mg/mLマイクロシスチン-LRストック溶液を取り出し、RTで解凍します。リシスバッファーのアリコート(0.25 mL)を冷凍庫から取り出し、RTで解凍し、その後使用するために氷の上に置きます。
- DMSO 1 μLを含む細胞培養培地を1 mL用意し、このDMSO再懸濁液を呼び出します。200 μM MLi-2 の 1 μL を含む RPMI メディアを 1 mL 準備し、この MLi-2 リサスペンション バッファと呼びます。
- 30分インキュベーション期間の後、遠心分離機は335 x gで5分間の両方のチューブを。
- 慎重に好中球ペレットを乱すことなく、各チューブ内の上清を捨てます。
- DMSOラベルサンプルの場合、ペレットをDMSO再懸濁液バッファーの1mLに、MLi-2ラベル付きチューブ用に1mLに徐停止し、MLi-2リサスペンションバッファーの1mLにペレットを再懸濁させます。
- 再懸濁された細胞ペレットを「DMSO」と「MLi-2」とラベル付けされた対応する遠心分離チューブに移し、両方のチューブを335 x gで3分間移動します。
- 遠心分離工程中に、リシスバッファーを調製する。ヒュームフードでは0.5 M DIFP溶液0.25 μLを慎重に加え、0.25 μLの1 mg/mLマイクロシスチン-LRを0.25 mL溶解バッファーに加えます。混ぜて氷の上に置いておいて使います。
注: DIFP は水溶液中では比較的不安定であるため、細胞溶解の 15 分以内に溶解バッファーに DIFP を追加します。 - 遠心分離の直後に、慎重かつ完全に好中球ペレットを乱すことなくピペットですべての上清を除去し、氷の上にチューブを置きます。
- DIFPおよびマイクロシスチン-LRを含む100μLのリシスバッファーを各チューブに直ちに加えます。100~200 μL のピペットを使用して、約 5 ~ 10 倍のピペットを上下にピペット処理して、細胞ペレットを再中断します。
- 氷の上の細胞を10分間ライスします。
- 遠心管は20,000 x gで4°Cで15分間細胞の破片を除去する。
- 好中球の溶出物を含む「DMSO」および「MLi-2」上清を新しい遠心管に移す。デブリペレットを捨てます。
注:好中球の溶菌は使用の準備ができているか、液体窒素で凍結し、将来の分析のために-80 °Cで保存することができます。
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Representative Results
我々のアッセイは、読み出しとしてLRRK2依存性Rab10リン酸化を用いたヒト末梢血好中球中のPD関連LRRK2キナーゼの活性化を問い合わすことを可能にする。好中球は、LRRK2およびRab10タンパク質の両方の高レベルを発現する均質で豊富な末梢白血球集団である(図1)。残りの末梢血単核細胞(PBMC)の中で、両方のタンパク質のコピー数が多い唯一の他の細胞集団は単球であるが、これらは白血球の2〜12%しか占めない。これは、末梢血好中球がLRRK2制御Rab10リン酸化を研究するためのより適切なバイオマトリックスであることを示している。
末梢血好中球を10mLの血液から分離する場合、ドナー1人当たりの全タンパク質溶菌の0.5~0.75mgが得られた(図2A)、ゲルレーンあたり10μgしか必要とされないイムノブロット分析のかなりの数に十分である。細胞の純度と生存率をチェックすることは日常的に行われるものではありませんが、 我々は、3人の健康なドナーに対して、CD66b-フルオレセイン等性好中球マーカーおよび4',6-ディアミドイン-2'フェニリンド2'ジヒドロクロリド(DAPI)染色性を用いたフローサイトメトリー解析により、単離された好中球の純度が94~98%、細胞の生存率が99%であることを実証した。
本書の焦点は末梢血からの好中球の分離と処理であり、定量的なウェスタンブロッティングによる分析ではなく、図2Bは、スレオニン73でRab10リン酸化を特異的に検出するMJFF-pRab10モノクローナル抗体が、強力で特異的なLRRK2キナーゼ阻害剤(この場合はMLi-2)による治療によって顕著に抑制された好中球サンプル中の強いシグナルを明らかにしたことを示している。
好中球には、その後のウェスタンブロット分析に影響を与える可能性のある高レベルのセリンプロテアーゼが含まれています。DIFPは好中球中の高いプロテアーゼ活性を効果的に抑制する一方で、強力な有機リン神経毒であり、フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)のような同様に有効だが毒性の低いプロテアーゼ阻害剤と置き換えるのが望ましい。DIFPを2.5mMの濃度でPMSFに置き換えた場合、Rab10リン酸化は同様に良好に保存されていることがわかった(図2C)。しかし、DIFPと比較してPMSFを使用するとLRRK2タンパク質の完全性が損なわれ、より大きなLRRK2タンパク質が分解しやすくなることを示唆している(図2C)。
我々は以前に、別のPDを引き起こす遺伝子変異VPS35 D620Nが、まだ未知の機構15によってLRRK2キナーゼの過活性化をもたらすことを示した。PDを有する3人の好中球が疾患を引き起こすヘテロ接合VPS35 D620N突然変異を有する、この記事に記載された方法を用いて単離した(図3)。9人の健常ドナーからの好中球試料を、コントロール15として単離した。MJFF-pRab10モノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析は、コントロールと比較してVPS35 D620N突然変異を有するパーキンソン病患者からの好中球におけるThr 73におけるRab10リン酸化の有意な〜3倍の増加を示す。全Rab10タンパク質発現は、全12個の好中球サンプルで同様です。
図1:インプロットデータベース上で一般に入手可能なデータを用いてヒト血液から分離された免疫細胞中のLRRK2およびRab10タンパク質の存在量(http://www.immprot.org)16。グラフは、T細胞、B細胞、単球、NK細胞、樹状細胞、顆粒球好中球、好塩基球、好酸球、好酸球、好酸球などの末梢血免疫細胞の範囲におけるLRRK2およびRab10の細胞当たりのタンパク質コピー数を示しています。この図は、Fanら11から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:好中球中のタンパク質分解の予防のためのヒト末梢血中球の特徴付けと分析、およびDIFPの重要性を示す。(A)好中球は、細胞溶菌後の純度、生存率、および全タンパク質収量を示す3人の健康なドナー(A、B、およびC)の全血から単離された。A(B)好中球をLRRK2キナーゼ阻害剤(MLi-2)の有無にかかわらず治療し、次いで、近赤外(NIR)蛍光イメージングを介して示された抗体を用いて分析し、定量的イムノブロット分析を行った。(C) 好中球は2人の健康なドナーから隔離され、30分間100 nM MLi-2で処理された。AとBはMir et al.15から変更され、CはFan et al.11から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヘテロジジョウスVPS35 D620N突然変異を有するパーキンソン病患者におけるLRRK2キナーゼ経路活性の増加。好中球は、9人の非年齢に一致した健康なコントロールと、疾患を引き起こすヘテロ接合性VPS35 D620N突然変異を有する3人のPD患者から単離された。細胞を、細胞のリシスの前に30分間、200 nM MLi-2の有無にかかわらず処理した。(A)示された抗体を用いた定量的免疫ブロット分析を対象に、全細胞抽出物の合計10 μgを近赤外(NIR)蛍光イメージングを介して行う。免疫ブロットは、ホスホ-Thr73 Rab10:総ラブ10比(B)について定量した。データは、Tukeyの多重比較検定を用いて一方向のANOVAによって分析された。手段±SDとして提示されるデータ。p < 0.0001.この図は、Mirら15から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
説得力のある臨床、遺伝学的、生化学的証拠は、LRRK2の重要な役割、特にパーキンソン病におけるキナーゼ機能を指摘する。LRRK2キナーゼ阻害剤が開発され、臨床試験2、4、124,に入っています。そのため、患者層層と同様に、標的エンゲージメントのバイオマーカーとしてLRRK2を利用する必要があります。我々のプロトコルは、ヒト末梢血好中球11,14,14の均質プールにおけるその生理基質Rab10のリン酸化によって反映されるLRRK2キナーゼ経路活性化を分析するための堅牢で容易なアッセイを記述する。定量免疫ブロット法による分析には、高選択的なホスフォ特異的なRab10抗体(MJFF-pRab10モノクローナル抗体)14,17,17を使用することを強くお勧めします。
ヒト好中球は、優勢な白血球集団17,18を構成する末梢血細胞の均質なサブセットを構成するため、18使用する。さらに重要なことに、好中球はまたLRRK2およびそのサブステートRab10(図1)16の高いタンパク質発現レベルを有する。対照的に、PBMCのプールを構成する白血球の残りのサブセットは、LRRK2およびRab10の可変的かつ主に低い発現と異質である。単球および樹状細胞は高い発現レベルを有するが、全体的な存在量は16である。
EDTAバクタの採血管の使用を推奨する一方で、EDTA以外の抗凝固剤を使用することができます。しかし、EDTAの存在は、好中球分離キットの性能にとって重要である。したがって、代替抗凝固剤を使用する場合でも、1 mM EDTAの最終濃度に達するように、全血サンプルにEDTAを添加することをお勧めします。好中球の分離キットの使用は比較的速く、容易な方法で免疫磁気陰性選択によって人間の全血から直接好中球を精製することを可能にする。利用可能な磁石の数は、並列処理できる血液サンプルの数を決定します。6つの磁石を用いて、最大6個の血液サンプルから同時に好中球を分離することは容易に可能である。潜在的な欠点は、商用好中球の分離キットと必要な磁石に関連するコストです。全血からの好中球分離のための代替方法が説明されており、有意な欠点を有する濃度勾配分離または蛍光活性化細胞選別(FACS)に依存している。前者は大幅に多くの時間と労働集約的であり、少なくとも私たちの手の中では信頼性が高く効率的ではありません。後者はFACSマシンを必要とし、赤血球の枯渇や細胞染色を含む追加の取り扱い手順を導入する必要があり、細胞分離プロセスに時間を追加する。全体的に、免疫磁気の分離は速く、非常に純粋なサンプルを生成し、細胞の過剰な取り扱いを避ける。サンプル処理に関して、我々は、少なくとも24時間までの採血と好中球の分離の間の遅延は、我々のアッセイの結果に有意な変化または変動をもたらさないことを以前に示した、 これは将来の臨床搾取11に柔軟性を提供する。
好中球の分離手順自体は非常に簡単です。使用前に磁気ビーズをボルテックスすることをお勧めします。磁気ビーズの乱気流や外れを避けるために、チューブが磁石の内側に入ると磁石を邪魔しないことも重要です。好中球は、すべての不要な細胞の免疫磁気除去のいくつかのラウンドによって懸濁液中で濃縮されています。チューブの底部の赤血球を摂動しないように、磁石と接触しているチューブの側面と第1回の単離(ステップ2.11)の間に触れないように注意してください。濃縮された細胞懸濁液を新しい円錐形チューブにピペット化した後(ステップ2.24)、好中球は直ちに進入処理に利用できる。好中球が細胞中のLRRK2活性を評価するために使用される場合、好中球は2つのバッチに分割され、遠心分離によってペレット化された後、LRRK2キナーゼ阻害剤(ここでは、MLi-2)または細胞培養培地を含むDMSOのいずれかで再懸濁される。LRRK2キナーゼ阻害がない場合の存在下での脱リン酸化および再リン酸化は比較的迅速な事象であるとして、MLi-2処理好中球分率がLRRK2キナーゼ阻害剤にさらされたままであることを確実にするために注意が必要である(例えば、MLi-2)細胞のリシスまで(ステップ3.8-3.10)。
このプロトコルには、15 mLおよび50 mLの円錐管を使用して、いくつかの遠心分離ステップがあります。プロトコルでは示された遠心分離速度を日常的に使用していますが、細胞の生存率に悪影響を及ぼすことなく、遠心分離速度を最大400 x gまで向上させることが可能です。これは、このプロトコル中に上清ステップをオフにデカンティングおよびピペットの間に好中球材料の潜在的な損失を減らすのに役立つかもしれないわずかに堅い好中球細胞ペレットをもたらす。これは、得られた総タンパク質の糖質の観点から収率を増加させる可能性が高い。潜在的な懸念は、より高い遠心分離力が好中球を活性化し、その後の分析に影響を与える可能性があるということです。私たちの一般的な推奨事項は、プロトコルのすべてのステップ中に好中球を可能な限り穏やかに処理することです。
我々のプロトコルは、好中球の溶菌緩衝液の一部として非常に強力なセリンプロテアーゼ阻害剤DIFP(0.5 mM)を使用しています。DIFPは強力な有機リン神経毒であり、我々は代替化合物を調査したが、リシスバッファーへの添加は、免疫ブロッティングによるヒト好中球におけるLRRK2制御Rab10リン酸化の分析に不可欠であった。例えば、DIFPを1%(w/v)SDSに置き換えることは、他の研究19で好中球を溶汁するために使用され、LRRK2、Rab10、さらにはGAPDHローディングコントロールのイムノブロットングがシグナルを生じなかった程度で有意なタンパク質分解をもたらし、したがって、リシス緩衝液に非常に強力なプロテアーゼ阻害剤を含めることの重要性を強調した( 図2C)。DIFPを2.5mMで低い毒性のセリンプロテアーゼ阻害剤PMSFに置き換えると、Rab10ホスポリル化は十分に保存されたが、より大きなLRRK2タンパク質は有意な分解を受けた(図2C)。DIFPストック溶液の取り扱いを最小限に抑えるために、DIFPを含む溶解バッファーをバッチで調製し、-20°Cまたは-80°C11で貯蔵することができる11。定量免疫ブロットによる分析に関しては、我々の研究に用いられるMJFF-pRab10抗体のような単一のLRRK2リン酸化ラブタンパク質に対してのみ選択的であることが実証されたホスホ特異性抗体を用いることが最も重要である。
このプロトコルは、最大25 mLの全血の最大量を使用してスケールアップすることができ、これは50 mLの円錐管を保持することができる1つの磁石を使用して1つの隔離手順で処理することができる限界である。調整が必要な唯一のステップは、ステップ2.4(血液のmLあたり50μLの分離カクテルを追加する)、ステップ2.6および2.12(血液のmLあたり50μLの磁気ビーズを追加する)、およびステップ3.12の好中球溶菌のための溶離緩衝液の体積の比例増加である。他のすべてのステップは同一に保つことができます。
要約すると、我々のプロトコルは、末梢血からヒト好中球を分離するための容易で、強い方法を記述する。好中球は、強力かつ特異的なLRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらず治療することができ、生体内でのRab10のLRRK2制御リン酸化の定量化を可能にする。これは、LRRK2キナーゼ経路活性に従って個体を階層化し、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受ける可能性のある経路過剰活性化を有するものを同定するのに有用であり得る。これは、PD、特に特に特に特発性PDを有する大多数の人々にとってはそうは限らないが、我々のアッセイは、LRRK2キナーゼ経路活性がまだ未知のメカニズム15によって有意に増加する別のPD関連遺伝子VPS35 D620Nに稀なヘテロ接合性突然変異を運ぶ個体に既に正常に展開されている。我々は以前、LRRK2キナーゼ活性を活性化することが知られている少数のLRRK2 G2019S突然変異を有する少数の個体において、LRRK2制御ラブ10リン酸化レベルを調べ、アッセイ11,14,14で特異性PDを有する対照および患者と比較して有意な差を検出することなく、約2倍の差しか検出していない。これとさらに未発表のデータは、LRRK2キナーゼ活性が定量的免疫ブロッティングを使用して有意な結果を得るためには、おそらく>3xの増加を必要とすることを示唆している。しかし、最新の質量分析技術を導入すればLRRK2キナーゼ経路活性化の感度が高くなる可能性がある。
好中球は、LRRK2キナーゼ経路活性に関するパーキンソン病研究の貴重な資源であり、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受けることができる個人を特定するのに役立つ可能性があることを示唆している。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
今回の研究に献血してくれた健康なボランティアに感謝します。私たちは、パーキンソン病研究のためのマイケル・J・フォックス財団(MJFF)とフォックスバイオネット研究リーダーシップ(FBN)に、書面によるプロトコルとビデオに対する彼らの支援とインプットに感謝します。オーストリアのウィーン大学のアレクサンダー・ジンプリッヒ教授に、私たちのプロトコルとコラボレーションをテストしてくれたことに感謝します。私たちは、プロジェクト(MRC PPUのゼネラルマネージャー)にポール・デイヴィスの貢献を大切にしています。また、MRCタンパク質リン酸化およびユビキタス化ユニット(PPU)、すなわち化学合成(MLi-2を合成するためのナタリア・シュピロ)、MRC PPU試薬およびサービス抗体精製チーム(によって調整された)の優れた技術サポートを認識しています(ヒラリー・マクラウクランとジェームズ・ハスティ)。私たちは、ビデオやアニメーションを作る彼らの助けをビボモーションからマヘリ・トウラーとフレイザーマードックに感謝します。私たちは、最終的な編集の支援のために81の映画からスティーブ・ソアヴェに感謝します。エステル・サムラーは、スコットランドのシニア・クリニカル・アカデミック・フェローシップの支援を受けており、パーキンソン病の英国(K-1706)から資金を受け取っています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
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- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
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