Summary
מוטציות ב לאוצין העשיר חזרה לחזור 2 גנים (LRRK2) לגרום למחלת פרקינסון תורשתית. פיתחנו שיטה קלה ואיתנה להערכת זרחון LRRK2 נשלט של Rab10 בדם היקפי הדם נויטרופילים. הדבר עשוי לסייע בזיהוי אנשים עם פעילות מסלול מוגברת של LRRK2 קינאז.
Abstract
הלוצין העשיר חוזר קינאז 2 (LRRK2) הוא הגן השכיח ביותר במחלת פרקינסון תורשתית (PD) וכל מוטציות LRRK2 פתוגניים התוצאה היפרהפעלה של הפונקציה קינאז שלה. כאן, אנו מתארים שיטת קל ויציב לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול היקפי דם היקפיים על ידי מדידת LRRK2 זרחון מבוקר של אחד מצעים פיזיולוגיים שלה, Rab10 ב טראונין 73. הניתוח החיסוני המתואר מחייב מאוד בררני ופוספנטי הנוגדן כי מזהה את Rab10 Thr73 אפירופה זרחזיום על ידי LRRK2, כגון נוגדן MJFF-pRab10 הארנב מונובטיים. הוא משתמש דם היקפית אנושי נויטרופילים, כי דם היקפי נגיש בקלות נויטרופילים הם מרכיב שופע הומוגנית. חשוב מכך, נויטרופילים לבטא רמות גבוהות יחסית של LRRK2 ו Rab10. חיסרון פוטנציאלי של נויטרופילים הוא הפעילות הפנימית הגבוהה סרין פרוטאז שלהם, אשר מחייבת את השימוש של מעכבי פרוטאז חזק מאוד כגון diisopropylfluorophosphate הרעלן העצבי זרחן (DIFP) כחלק מאגר לפירוק. עם זאת, נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ב vivo וצריך להיחשב עבור הכללה לתוך משטרת ביוריאטורי אוספים.
Introduction
נסיונות להאט או להפסיק את מחלת פרקינסון (PD) נכשלו עד כה. הגילוי של מוטציות היפראותיים ב-לאוצין לחזור על קינאז 2 (LRRK2) הגורמות ו/או הגברת הסיכון למשטרה הובילה לפיתוח מעכבי LRRK2 קינאז1,2,3. אלה נכנסו עכשיו ניסויים קליניים4. הפונקציה המדויקת של LRRK2 אינו ברור, אבל התקדמות מרכזית כבר זיהוי של מערכת החלבונים של רב gtpase, כולל Rab10, כמו מצעים פיסיולוגיים בתום הראשון של הLRRK2 קינאז5,6,7. אתגרים מרכזיים בעידן של מחלות-שינוי therapeutics הם סמנים ביוכימיים של מצב הפעלה LRRK2 קינאז והתחייבות היעד של מעכבי LRRK2 קינאז.
עד כה, הסמן העיקרי של פרמקוטיק לLRRK2 מעכבי ב vivo הייתה מקבץ של שאריות סרין בצורה מצטברת של LRRK2, בפרט סרין 935, אשר הפכו להיות בתגובה למעכבי LRRK2 שונים8,9. עם זאת, סרין 935 זרחון אינו מתאם עם פעילות פנימית LRRK2 קינאז הפנימי משום שהוא אינו זרחי במישרין על-ידי LRRK2 והוא עדיין זרחבקינאז-לא פעיל LRRK210. LRRK2 קינאז פעילות מתאימה היטב עם הוספולציה של סרין 1292, אבל זה במונחים מעשיים לא מתאים לפעילות אנדודוגני LRRK2 קינאז על-ידי ניתוח חיסוני כתמי של תמציות תאים שלמות בשל היעדר הנוכחי של נוגדנים אמינים ופוספוסקיים עבור אתר זה10,11.
פיתחנו שיטת חזק וקל לכמת LRRK2 קינאז פעילות מסלול בתאי הדם היקפיים האדם המודד LRRK2 זרחון מבוקר של חלבון היעד הפיזיולוגי שלה Rab10 ב טראונין 7311. דם היקפי נגיש בקלות על ידי ונציה, שהוא סיכון נמוך והליך מהיר הגורם אי-נוחות מינימלית. אנו מתמקדים בגוף היקפי דם נויטרופילים כי הם מהווים שופע (37-80% של כל כדוריות הדם הלבנות) ואת האוכלוסייה תאים הומוגנית המבטא רמות גבוהות יחסית של שני LRRK2 ו Rab1011. יתר על כן, דם היקפי נויטרופילים יכול להיות מבודד במהירות וביעילות על ידי שימוש בגישה שלילית אימונוגנטית. כדי להבטיח כי הנצפים לאחר מכן Rab10 זילציה מתווכת על ידי LRRK2, כל אצווה של נויטרופילים הוא מודבטים עם או בלי חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכבי (אנו משתמשים וממליצים mli-2)2,12. זה ואחריו לאחר מכן הפירוק התא במאגר המכיל את מעכב פרוטאז diisopropyl fluorophosphate (difp), אשר הכרחי לדיכוי פעילות סרין פרוטאז מהותי כי ידוע להיות גבוה נויטרופילים13. לניתוח הסופי של האנליזה הכמותית, אנו ממליצים על שימוש בנוגדן MJFF-pRab10 הארנב שמזהה במפורש את Rab10 Thr73-פוספופאפיפ ואינו מגיב באמצעות חלבונים אחרים זרחתיים מסוג14. סלקטיביות וספציפיות של נוגדן זה אומת במודלים overexpression של חלבונים שונים של ראב ו A549 Rab10 לנקוש קו תא14. כך, אנו למדוד את ההבדל Rab10 זרחון ב נויטרופילים lysates כי כבר טופלו עם וללא חזק וסלקטיבי LRRK2 קינאז מעכב2. לחילופין, ניתן לנתח דגימות גם בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטר מסה כמותי.
לסיכום, LRRK2 שבשליטת Rab10 זרחון הוא סמן מעולה של פעילות LRRK2 קינאז LRRK2 זרחון ב סרין 935 ו-היקפי הדם נויטרופילים היקפיים הם משאב רב ערך עבור מחקר PD לתוך LRRK2. הפרוטוקול שלנו מספק מעשה יציב וקל לחקור פעילות מסלול LRRK2 דם היקפיים נויטרופילים ומאפשר ריבוד ביוכימיים של אנשים עם פעילות מוגברת LRRK2 קינאז15. חשוב מכך, אנשים כאלה עשויים להפיק תועלת מטיפול מעכב LRRK2 קינאז עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
על פי רגולציה בבריטניה המקומית כל המניפולציות וליטוף של דם אנושי נעשים בארון בטיחות בקטגוריה 2. כל ההליכים בוצעו בהתאם לועדת האתיקה המקומית וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מושכלת.
1. הכנה
- הכינו 0.1 mL של מניות EDTA פתרון 1 המכיל 100 mM EDTA ב-פוספט באגירה מלוחים (PBS).
- הכינו 60 mL של פתרון מניות EDTA 2 המכיל 1 מ"מ EDTA ב-PBS.
- הכנת מאגר לפירוק המכיל 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5), 1% (v/v) טריטון X-100, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ Na3VO4, 50 mm naf, 10 מ"מ β-Glycerophosphate, 5 מילימטר נתרן פירופוספט, 0.27 M סוכות, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1 X מעכב פרוטאז קוקטייל, אחד μg/mL MICROCYSTIN-LR, ו 0.5 מילימטר diisopropyl fluorophosphate (difp).
הערה: המחברים משתמשים באופן שגרתי במוצר EDTA-free, אך קוקטייל מעכב פרוטאז המכיל EDTA צריך גם לעבוד. מאגר הליזה ניתן לעשות מראש ללא β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP, ומאוחסן 4 ° צ' עד השימוש. ודא כי β-mercaptoethanol, מעכבי פרוטאז, microcystin-LR, ו DIFP הוא הוסיף רק מיד לפני השימוש.
התראה: DIFP הוא רעיל ויש לטפל בזהירות בתוך מכסה המנוע בעקבות בריאות מקומית והערכת סיכונים בטיחות. ניתן להוסיף DIFP למאגר הליזה ולהשתמש בו באופן מיידי. לחילופין, מאגר הפירוק המלא המכיל את כל הרכיבים האחרים, כולל DIFP, ניתן לצוטט ולאחסן ב-80 ° c לשימוש הבאים במשך 4 שבועות לפחות.
2. בידוד נויטרופילים מכל דם
- לאסוף 10 מ ל של דם לתוך צינור איסוף דם. מערבבים בעדינות על ידי היפוך צינורות 7-8x.
- העברה 10 מ ל של דם לתוך צינורית חרוט 50 mL.
- הוסף 100 μL של פתרון מלאי EDTA 1 לדם. מערבבים בעדינות.
- הוסף 500 μL של קוקטייל הבידוד (50 μL/mL) מערכת הבידוד נויטרופילים (טבלת חומרים) לדגימת הדם כולה.
- מערבולת את החרוזים מגנטי של ערכת הבידוד נויטרופילים עבור 30 s לפני השימוש כדי להשהות מחדש את החרוזים מגנטי עדין מאוד.
- הוסף 500 μL של החרוזים המגנטיים לדגימת הדם וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינורית מספר פעמים.
- דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 5 דקות.
- מלאו את הצינור ל 50 mL עם פתרון מניות EDTA 2. מערבבים על ידי בעדינות מאוד ללטף למעלה ולמטה 2 – 3x.
- מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים של הצינור.
- דגירה עבור 10 דקות ב RT.
- פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
הערה: אין לגעת בצד של הצינורית הנמצאת במגע עם המגנט ולהימנע מאיסוף והפרטורציה של תאי הדם האדומים בתחתית הצינורית. השאירו כ 10 מ ל של ההשעיה של תא דם אדום מאחורי בתחתית הצינור. - מערבולת החרוזים מגנטי עבור 30 s לפני השימוש ולהוסיף 0.5 mL של חרוזים מגנטיים הצינור המכיל נויטרופילים מועשר. מערבבים בעדינות על ידי היפוך השפופרת.
- דגירה ב RT עבור 5 דקות.
- מניחים את הצינור לתוך המגנט ולהסיר את המכסה כדי למנוע עצבנות הבאים.
- דגירה ב RT עבור 5 דקות.
- פיפטה בזהירות ההשעיה התא מועשר המכיל את נויטרופילים לתוך צינור 50 mL החדש.
הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת. - כדי להבטיח את ההסרה המלאה של חרוזים מגנטיים מן התערובת התא, למקם את הצינור המכיל את התאים מועשר לתוך המגנט.
- דגירה עבור 10 דקות ב RT.
- פיפטה בזהירות את ההשעיה התא מועשר כי כעת מכילה נויטרופילים טהור לתוך צינור 50 mL החדש.
הערה: אל תגעו בצד של הצינור כי הוא במגע עם המגנט. השאירו כ-5 מ ל של ההשעיה בתחתית השפופרת. - לערבב את התאים מבודדים עם 1 מ"מ מניות EDTA פתרון 2 לכרך הסופי של כ 41 mL. . פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב
- לחלק את הפתרון באופן שווה לשתי שפופרות עם כ 20 מ ל בכל צינור.
- צנטריפוגה את שני הצינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
- במהלך צנטריפוגה זה לקחת מלאי מעכב MLi-2 (200 μM/1, 000x ריכוז) מתוך-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT לשימוש הבאים.
- מיד לאחר הצעד הצנטריפוגה וללא עצבנות של צינורות, לשפוך את supernatant בלי להפריע את כדורי נויטרופילים. השהה מחדש כל גלולה ב-10 מ ל של מדיית תרבות התא (טבלת חומרים) ב-RT על-ידי ליטוף בעדינות של תאים למעלה ולמטה 4x.
3. LRRK2 קינאז טיפול מעכבי של נויטרופילים טהור
- תווית צינור אחד "DMSO" ואת הצינור השני "MLi-2".
- כדי "DMSO" התווית צינור, להוסיף 10 μL של DMSO ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל. כדי "MLi-2" שכותרתו הצינור, להוסיף 10 μL של 200 μM MLi-2 מניות פתרון (ריכוז סופי 200 nM) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2x עם צינור 10 מ"ל.
- מודקון את הדגימות עבור 30 דקות ב RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך כל 10 דקות במהלך הדגירה.
- במהלך תקופת הדגירה, להסיר 0.5 מניות M DIFP מ-80 ° c מקפיא ומקום בתוך המקפיא על הקרח. הסרת 1 מ"ג/mL מיקרו-LR פתרון מניות מ-80 ° c מקפיא ולעזוב ב RT כדי להפשיר. לקחת סדרת מחלקים (0.25 mL) של מאגר הליזה מתוך המקפיא, לאפשר לו להפשיר ב RT, ולאחר מכן למקם אותו על הקרח לשימוש הבאים.
- הכן 1 mL של התרבות התא בינונית המכילה 1 μL של DMSO ולקרוא זה מאגר מחדש DMSO ההשעיה. הכן 1 mL של מדיה RPMI המכיל 1 μL של 200 μM MLi-2 ולקרוא זה מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
- אחרי 30 דקות דגירה התקופה, צנטריפוגה הן צינורות ב 335 x g עבור 5 דקות.
- בזהירות להשליך את supernatant בכל צינור מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים.
- עבור המדגם DMSO התווית בעדינות להשעות את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הבולם החוזר DMSO ו עבור MLi-2 שכותרתו הצינור, להשעות את הגלולה ב 1 mL של מאגר מחדש MLi-2 ההשעיה.
- להעביר את כדורי תא מושעה מחדש לצינורות צנטריפוגה מסומנים המסומנים "DMSO" ו "MLi-2" ו צנטריפוגה שתי הצינורות ב 335 x g עבור 3 דקות.
- במהלך השלב הצנטריפוגה, הכן את מאגר הליזה. בתוך מכסה המנוע בזהירות להוסיף 0.25 μL של 0.5 M פתרון DIFP, כמו גם 0.25 μL של 1 מ"ג/מ"ל microcystin-LR למאגר הליזה 0.25 mL. לערבב ולהשאיר על הקרח עד השימוש.
הערה: הוסף DIFP למאגר הליזה בתוך 15 דקות של פירוק התא, כי DIFP הוא לא יציב יחסית בתמיסה מימית. - מיד לאחר צנטריפוגה, בזהירות לחלוטין להסיר את כל supernatant עם פיפטה מבלי להפריע את הגלולה נויטרופילים ולמקם את הצינורות על הקרח.
- מיד להוסיף 100 μL של מאגר הליזה המכיל DIFP ו-microcystine-LR לכל צינור. שימוש 100-200 μL הפיפטה, להשעות מחדש את כדורי התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה על 5 – 10x.
- ליאוס את התאים בקרח במשך 10 דקות.
- צינורות צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' כדי להסיר פסולת תא.
- העבר את "DMSO" ו "MLi-2" סופרנטנים המכילים את נויטרופילים לייטים לתוך צינורות צנטריפוגה חדשים. . התעלם מגלולה הפסולת
הערה: נויטרופילים lysates מוכנים כעת לשימוש או יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב-80 ° c לניתוח עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבדיקה שלנו מאפשרת לחקור את ההפעלה של LRRK2 קינאז PD-הקשורים המשטרה הקשורה בדם היקפי דם נויטרופילים עם LRRK2 תלוי Rab10 זרחון כמו בדיקה. נויטרופילים הם היקפיים ושופע היקפי דם לבנים האוכלוסייה המבטא רמות גבוהות של LRRK2 ו Rab10 חלבונים (איור 1). אוכלוסיית התאים היחידה היחידה בקרב תאי הדם ההיקפיים הנותרים (PBMCs) עם מספרי עותקים גבוהים של שני החלבונים הם מונוציטים, אבל אלה מפצות רק 2 – 12% של כדוריות הדם הלבנות. זה מציין כי דם היקפי נויטרופילים הם ביומטריקס מתאים יותר עבור לימוד LRRK2 שבשליטת Rab10 זירחון.
כאשר בידוד דם היקפי נויטרופילים מ 10 מ ל של דם עם ההליך שלנו, בין 0.5 – 0.75 mg של חלבון מוחלט ליפוסט לכל תורם הושג (איור 2A), אשר מספיקה עבור מספר משמעותי של ניתוח כתמי חיסוני אשר רק 10 μg לכל ג'ל ליין נדרשים. בעוד בדיקת הטוהר ואת הכדאיות של תאים אינו מבוצע באופן שגרתי, הדגמנו עבור שלושה תורמים בריאים כי הטוהר של נויטרופילים מבודדים הוא בין 94-98% ואת הכדאיות של תאים ~ 99% כפי שנקבע על ידי הניתוח cyCD66b try באמצעות שימוש ב--Fluoresceythiocyanate מרקר ו 4 ' 6-Diamidine-2'-פניינילידול דיהידרוטסטוסטרון (DAPI) כתמים עבור הכדאיות (איור 2 א).
בעוד המיקוד של הפרסום הזה הוא בידוד ועיבוד של נויטרופילים מפני דם היקפי ולא את הניתוח על ידי הכתמים המערביים הכמותי, איור 2B ממחיש כי הנוגדן mjff-pRab10 שהוא מזהה במיוחד Rab10 זרחני ב תראונין 73 חשף אותות חזקים בדגימות נויטרופילים, אשר דוכאו במידה ניכרת על ידי טיפול עם חזקה וספציפית LRRK2 קינאז מעכב, במקרה זה mli-2.
נויטרופילים מכילים רמות גבוהות של סרין פרוטסים שיכולים להשפיע על ניתוח כתמי אבן מערבי הבאים. בעוד DIFP ביעילות מדכא את הפעילות פרוטאז גבוהה נויטרופילים, זה רעלן רעיל חזק ביותר, והוא יהיה רצוי להחליף אותו עם מעכב פרוטאז יעיל אך פחות רעיל, כמו פנילמתיל פלואור (PMSF). מצאנו כי זרחון Rab10 היה שמור באותה מידה כאשר DIFP הוחלף על ידי PMSF בריכוז של 2.5 מ"מ (איור 2C). עם זאת, היושרה של חלבון LRRK2 נפרץ בעת שימוש PMSF לעומת DIFP, מציע כי חלבון LRRK2 גדול יותר פגיע יותר השפלה (איור 2C).
בעבר הראינו כי מוטציה נוספת של המשטרה גרימת גן VPS35 D620N תוצאות היפרהפעלה של LRRK2 קינאז על ידי מנגנון לא ידוע עדיין15. נויטרופילים מתוך שלושה אנשים עם PD מחסה מוטציה גרימת heterozygous VPS35 D620N מוטציה היו מבודדים באמצעות השיטה המתוארת במאמר זה (איור 3). דגימות נויטרופילים מתשעה תורמים בריאים היו מבודדים כפקדים15. ניתוח חיסוני כתמי באמצעות נוגדן MJFF-pRab10 שבטיים מדגים משמעותי, להגדיל ~ 3x ב Rab10 זרחון ב ה73 בתוך נויטרופילים מחולי פרקינסון עם VPS35 D620N מוטציה בהשוואה לפקדים. ביטוי החלבון הכולל Rab10 דומה בכל 12 דגימות נויטרופילים.
איור 1: שפע של חלבונים LRRK2 ו Rab10 בתאים חיסוניים מבודדים דם אנושי באמצעות נתונים הזמינים לציבור במסד הנתונים של immprot (http://www.immprot.org)16. הגרף מראה את מספר עותקי החלבון בכל תא עבור LRRK2 ו Rab10 בטווח של תאים היקפיים דם החיסונית, כולל קבוצות מתאר של תאי T, B תאים, מונוציטים, התאים NK, תאים דנדריטים, ואת הגרנולוציטים נויטרופילים, באספילים, ו אאוזינופילים. דמות זו שונתה מ-Fan ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אפיון וניתוח של דם היקפי והוא וחשיבותו של difp למניעת השפלה פרוטחרדה ב נויטרופילים. (א) נויטרופילים היו מבודדים מדם שלם של שלושה תורמים בריאים (a, B, ו C) מראה טוהר, הכדאיות, ותשואה חלבון מוחלט לאחר הליזה תאים. (ב) נויטרופילים טופלו עם או בלי LRRK2 קינאז מעכב (mli-2), לאחר מכן לאחר והוא נתון ניתוח כמותי כתמי באמצעות נוגדנים המצוין באמצעות הדמיה מקרוב אינפרא אדום (ניר) הדמיית קרינה. (ג) נויטרופילים היו מבודדים שני תורמים בריאים וטופלו עם 100 ננומטר mli-2 עבור 30 דקות. תאים היו ליטלו בנוכחות של 0.5 MM difp או 2.5 mM PMSF לחסום את הפעילות סרין פרוטאז ב נויטרופילים. A ו-B שונו מ מיר et al.15, בעוד C שונה מ מאוורר ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הוגדלה LRRK2 קינאז המסלול הפעילות בחולי פרקינסון מחסה לheterozygeous VPS35 D620N מוטציה. נויטרופילים היו מבודדים תשעה שאינם גיל מתאימים פקדים בריאים שלושה חולי PD עם מחלה גרימת heterozygous VPS35 D620N מוטציה. התאים טופלו עם או בלי 200 ננומטר MLi-2 עבור 30 דקות לפני הליזה התאים. (A) סך של 10 μg של תמצית התא השלם נתון ניתוח חיסוני כמותי עם נוגדנים המצוין באמצעות הדמיה באמצעות אינפרא אדום (ניר) פלואורסצנטית. בלוטים אימונוts היתה כמותית עבור פוספהו-Thr73 Rab10: היחס הכולל Rab10 (ב). הנתונים נותחו על ידי ANOVA חד כיוון עם מבחן השוואה מרובה של Tukey. נתונים המוצגים כאמצעי ± SD; p < 0.0001. דמות זו שונתה ממיר ואח'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוכחה משכנעת קלינית, גנטית, וביוכימית מצביע על תפקיד חשוב עבור LRRK2 ובמיוחד הפונקציה קינאז שלה במחלת פרקינסון7. מעכבי LRRK2 קינאז פותחו והם נכנסים ניסויים קליניים2,4,12. ככזה יש צורך לנצל LRRK2 כסמן עבור מעורבות היעד, כמו גם המטופל ריבוד. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטת יציב וקלה לניתוח הפעלת מסלול LRRK2 קינאז כפי שמשתקף על ידי זירחון של המצע הפיזיולוגי שלה Rab10 במאגר הומוגנית של האדם ההיקפי דם נויטרופילים11,14. לניתוח על ידי מחקר חיסוני כמותי, אנו ממליצים בחום על השימוש של הנוגדן Rab10 בררנית מאוד הספציפי (mjff-pRab10 נוגדן מונבטיים)14,17.
אנו משתמשים נויטרופילים האדם כי הם מהווים תת-קבוצה הומוגנית של תאי דם היקפיים המרכיבים את האוכלוסייה הלוקוציט הדומיננטי17,18. חשוב יותר, נויטרופילים יש גם רמות ביטוי חלבון גבוה של LRRK2 ו משנה שלה Rab10 (איור 1)16. לעומת זאת, מערכות המשנה הנותרות של לוקיציטים המופצות על הבריכה של PBMCs הינן הטרוגניות עם משתנה וביטוי נמוך ברובו של LRRK2 ו-Rab10. מונוציטים ותאי הדנדריטים יש רמות ביטויים גבוהים, אבל הם נמוכים הכולל שפע16.
בעוד אנו ממליצים על שימוש בצינורות איסוף דם של EDTA בתוך ובכל זאת, נוגד קרישה שונה מאשר EDTA ניתן להשתמש. עם זאת, הנוכחות של EDTA חשוב לביצועים של ערכת הבידוד נויטרופילים. לפיכך, אנו ממליצים להוסיף EDTA לדגימת הדם כולה כך ריכוז סופי של 1 מ"מ EDTA הוא הגיע גם אם נוגד קרישה אלטרנטיבי משמש. השימוש בערכת הבידוד נויטרופילים מאפשר טיהור של נויטרופילים ישירות מדם שלם של האדם על ידי בחירה שלילית חיסונית בדרך מהירה וקלה יחסית. מספר המגנטים הזמינים קובע כמה דגימות דם ניתן לעבד במקביל. זה ניתן בקלות כדי לבודד נויטרופילים מתוך עד שישה דגימות דם במקביל באמצעות שישה מגנטים. חיסרון פוטנציאלי הוא העלות המשויכת עבור ערכות בידוד נויטרופילים מסחרי המגנט הנדרש. שיטות חלופיות בידוד נויטרופילים מהדם כולו תוארו ולהסתמך על הפרדת צפיפות מעבר הדרגתי או מיון תא המופעל באמצעות הזריחה (FACS), אשר יש חסרונות משמעותיים. הראשון הוא באופן משמעותי יותר זמן ועבודה אינטנסיבית ולפחות בידינו לא אמין ויעיל. האחרון דורש מכונת FACS ושלבי טיפול נוספים יהיה צורך להציג, כולל דלדול של כדוריות הדם האדומות כתמים תא, הוספת זמן לתהליך בידוד התא. ככלל, בידוד אימונוגנטית הוא מהיר, מייצר דגימה טהורה מאוד, ונמנע טיפול מופרז של התאים. בנוגע לעיבוד לדוגמה, הצגנו בעבר כי עיכוב בין איסוף דם לבידוד נויטרופילים של לפחות עד 24 שעות אינו גורם לשינוי משמעותי או וריאציה בתוצאה של הטיפול שלנו, אשר מספק גמישות לניצול קליני בעתיד11.
תהליך הבידוד של נויטרופילים הוא קל מאוד. אנו ממליצים לוורטקסing את החרוזים המגנטיים לפני כל שימוש. חשוב גם לא להפריע מגנט פעם הצינור הוא בתוך המגנט כדי למנוע מערבולת וdislodgement של חרוזים מגנטיים. נויטרופילים הם להיות מועשר השעיה על ידי מספר סיבובים של הסרת החיסונית של כל התאים לא רצויים. הטיפול צריך להילקח לא לגעת בצד של הצינור כי הוא בקשר עם המגנט במהלך סבב הראשון של בידוד (שלב 2.11) כדי לא לperturb את כדוריות הדם האדומות בתחתית הצינור. לאחר הסיבוב האחרון של ליטוף ההשעיה התא מועשר לתוך צינור חרוט חדש (שלב 2.24), נויטרופילים זמינים מיד לעיבוד הלאה. אם נויטרופילים משמשים כדי להעריך את הפעילות LRRK2 בתאים, נויטרופילים הם לפצל לשתי אצוות ואחרי הפלטינג על ידי צנטריפוגה, מושעה בשני מעכבי LRRK2 קינאז (כאן, MLi-2) או DMSO המכיל את תרבות התא בינונית. כמו הדרחון בנוכחות וזירחון מחדש בהעדר עיכוב LRRK2 קינאז הם אירועים מהירים יחסית, טיפול צריך להילקח כדי להבטיח את השבר MLi-2 מטופלים נויטרופילים נשאר חשופים מעכבי LRRK2 קינאז (למשל, MLi-2) עד לפירוק התאים (שלבים 3.8 – 3.10).
ישנם מספר שלבים צנטריפוגה בפרוטוקול זה באמצעות 15 ו 50 mL שפופרות חרוט. בעוד אנו משתמשים באופן שגרתי במהירויות צנטריפוגה המצוין בפרוטוקול, ניתן להגדיל את המהירות צנטריפוגה עד 400 x g מבלי להשפיע לרעה על הכדאיות של התאים. זה התוצאות מוצק מעט כדורית תא התאים אשר עשוי לסייע להפחית כל אובדן פוטנציאלי של חומר נויטרופילים במהלך היין וללטף את השלבים supernatant במהלך פרוטוקול זה. זה צפוי להגדיל את התשואה במונחים של חלבון מוחלט ליפוסט השיגה. חשש פוטנציאלי הוא כוח צנטריפוגה גבוה יותר יכול להפעיל נויטרופילים ופוטנציאלי להשפיע על הניתוח העוקב. ההמלצה הכללית שלנו היא לטפל נויטרופילים במהלך כל צעד של הפרוטוקול בעדינות ככל האפשר.
הפרוטוקול שלנו משתמש בחזק מאוד סרין פרוטאז מעכבי DIFP (0.5 mM) כחלק מאגר הליזה נויטרופילים. DIFP הוא רעלן עצבי זרחן חזק, ובעוד יש לנו לחקור תרכובות חלופיות, התוספת שלה מאגר הליזה היה חיוני לניתוח של LRRK2 שבשליטת Rab10 זירחון האדם נויטרופילים על ידי החיסונית. לדוגמה, החלפת DIFP עם 1% (w/v) SDS השתמשו כדי lyse נויטרופילים במחקרים אחרים19 והוביל השפלה חלבון משמעותי במידה כי החיסונית עבור LRRK2, Rab10, ואפילו את השליטה הטעינה של היקף ההעמסה לא להניב אות, ובכך להדגיש את החשיבות של כולל מעכב פרוטאז חזק מאוד במאגר לפירוקFigure 2C בעת החלפת DIFP עם פחות חזק, אבל גם פחות מדכא סרין פרוטאז PMSF ב 2.5 מ"מ, Rab10 phosporylation היה שמור היטב, אבל חלבון LRRK2 גדול עבר השפלה משמעותית (איור 2C). על מנת למזער את הטיפול של פתרון מניות DIFP, מאגר לליזה המכיל DIFP ניתן להכין בקבוצות, מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c או-80 ° c11. ביחס לניתוח על ידי החיסונית כמותית, זה הוא החשיבות העליונה להשתמש בנוגדן זרחן כי הוכח להיות סלקטיבי רק חלבון LRRK2 ליחיד בודד, כגון הנוגדן MJFF-pRab10 המשמש ללימודים שלנו14.
ניתן גם לשנות את הפרוטוקול באמצעות כמות מקסימלית של דם שלם של עד 25 מ ל, שהיא המגבלה שניתן לעבד בהליך בידוד אחד באמצעות מגנט אחד, אשר מסוגל להחזיק 50 mL חרוט צינורות. הצעדים היחידים שיצטרכו התאמות הם שלב 2.4 (הוספת 50 μL של קוקטייל בידוד ל-mL של דם), שלבים 2.6 ו 2.12 (הוספת 50 μL של חרוזים מגנטיים ל-mL של דם), ועלייה מידתית בנפח של מאגר הליזה עבור הליזה נויטרופילים בשלב 3.12. כל השלבים האחרים ניתן לשמור זהה.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה קלה ואיתנה כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם ההיקפי. נויטרופילים לאחר מכן ניתן לטפל עם וללא חזק וספציפי LRRK2 קינאז מעכבי כדי לאפשר את כימות של זירחון LRRK2 נשלט של Rab10 בvivo. זה יכול להיות שימושי עבור אנשים שתקן בהתאם לפעילות המסלול LRRK2 קינאז ולזיהוי אלה עם היפר הפעלה המסלול מי עשוי להפיק תועלת מLRRK2 קינאז בעתיד טיפול מעכבי. אמנם זה יהיה לא סביר במקרה של רוב האנשים עם PD, במיוחד אידיופטית PD, הצורך שלנו כבר נפרס בהצלחה אנשים שנשאו נדיר, heterozygous מוטציה בגן אחר הקשורים למשטרה, VPS35 D620N, שם פעילות מסלול LRRK2 קינאז גדל באופן משמעותי על ידי מנגנון לא ידוע עדיין15. בעבר בחנו ראב LRRK2 מבוקרת 10 רמות זירחון במספר קטן של אנשים הנושאים מוטציה LRRK2 G2019S הנפוצים יותר, כי ידוע להפעיל פעילות LRRK2 קינאז רק בצניעות על ידי גורם של כמעט שניים מבלי לגלות הבדל משמעותי בהשוואה לפקדים וחולים עם משטרת אידיופטית עם שלנו שינוי11,14. זה ועוד נתונים שלא פורסמו מראים כי פעילות LRRK2 קינאז ככל הנראה דורש גידול של > 3x על מנת להניב תוצאה משמעותית באמצעות חיסוני כמותי. עם זאת, את הרגישות לגילוי LRRK2 קינאז הפעלה המסלול עשוי להיות מוגבר אם לפרוס את הטכנולוגיה המדינה-of-the-אמנות ספקטרומטר המסה.
אנו מציעים כי נויטרופילים הם משאב רב ערך עבור מחקר מחלת פרקינסון לתוך פעילות מסלול LRRK2 קינאז ועשוי לעזור לזהות אנשים שיכולים להפיק תועלת בעתיד LRRK2 קינאז טיפול מעכבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים למתנדבים הבריאים שתרמו באדיבות דם למחקר הנוכחי. אנו מודים לקרן מייקל ג'יי פוקס לחקר פרקינסון (MJFF) ולמנהיגות המחקר פוקס ביונט (FBN) לתמיכה ולכניסה לפרוטוקול הכתוב ולווידאו. אנו מודים לפרופסור אלכסנדר זיפריץ ' מאוניברסיטת וינה באוסטריה על בחינת הפרוטוקול ושיתוף הפעולה שלנו. אנו מעריכים את התרומות של פול דייוויס לפרויקט (מנהל כללי של MRC PPU). אנו מכירים גם את התמיכה הטכנית המצוינת של זרחון חלבון MRC והיחידה אוביקווילציה (PPU) כלומר סינתזה כימית (נטליה שפירו MLi-2), MRC PPU ריאגנטים ושירותים נוגדנים לטיהור צוותים (מתואם על ידי הילארי McLauchlan וג Hastie). אנו מודים מולר מטאולר ו פרייזר מרדוק מ Vivomotion עבור עזרתם עם עשיית קטעי וידאו ואנימציות. אנו מודים לסטיב סואב מ 81 סרטים לסיוע בעריכות הסופיות. אסתר סממלר נתמכת על ידי מלגת לימודים אקדמית בכירה סקוטית וקיבלה מימון של פרקינסון בבריטניה (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
