Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus
Summary
Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.
Abstract
La capacité d’isoler les tissus embryonnaires constituait une étape essentielle pour établir le système de caille-poulet chimère, qui à son tour a contribué incontesté au dévoilement des processus clés en biologie du développement.
Dans les présentes est décrit une méthode optimisée pour isoler des tissus embryonnaires de cailles et de poulets par la microchirurgie et la digestion enzymatique tout en conservant ses propriétés biologiques. Après l’isolement, les tissus de ces deux espèces sont associés lors d’un test in vitro organotypique pendant 48 h. caille et tissus de poulet peuvent être distinguées par caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires permettant l’étude de la diaphonie cellulaire entre hétérospécifiques association des tissus. Cette approche est donc un outil utile pour étudier les interactions de tissu complexe dans le processus de développement avec des modifications spatiales très dynamiques, telles que celles survenant au cours de la morphogénèse du pharynx et de la formation de l’intestin antérieur organes dérivés endoderme. Cette approche expérimentale a été développée afin d’étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation du thymus. À cet égard, l’endoderme dérivés de prospective rudiment thymique et dérivés mesoderm mésenchyme, ont été isolés des embryons de caille et de poulet, respectivement.
La capacité des tissus associés à produire des organes peut être analysée plus loin en leur greffant sur la membrane Chorio-(CAM) d’un embryon de poulet. La came fournit des nutriments et permet les échanges gazeux dans les tissus explantés. Après 10 jours de développement ovo, les organes chimériques peuvent être analysés dans les explants récoltés par les méthodes morphologiques classiques. Cette procédure permet également étudier des contributions spécifiques des tissus au cours de la formation des organes, de ses initial (développement in vitro) pour la phase finale de l’organogenèse (en développement ovo).
Enfin, la méthode d’isolation améliorée fournit également en trois dimensions (3D) préserver les tissus embryonnaires, qui peuvent également être utilisés pour une analyse topographique haute résolution des modèles d’expression génique spécifique aux tissus.
Introduction
Dans les années 1970, un système élégant caille-poulet chimère a été développé par Le Douarin, ouvrant de nouvelles pistes pour comprendre le rôle de la migration cellulaire et interactions cellulaires au cours du développement1,2. Le modèle a été conçu en partant du principe qu’échange de cellules entre les deux espèces ne perturberait pas significativement l’embryogenèse, confirmé plus tard lorsqu’il est utilisé pour étudier les nombreux processus de développement, y compris la formation du système nerveux et le hématopoïétique systèmes de1. Prendre ce dernier à titre d’exemple, les vagues cycliques de progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le rudiment épithélial thymique fut observée à l’aide de la chimère de la caille-poulet système3. Pour cela, le territoire prospectif du thymus, l’endoderme des troisième et quatrième du pharyngés sachets (3/4PP), a été isolé mécaniquement et enzymatiquement embryons de caille (q) de 15 à 30 – stade de segments [1,5-E2.5 jour embryonnaire (E)]. Ces trois phases correspondent au poulet Hamburger et Hamilton4 (HH) – étapes 12-17. Les procédures d’isolement a commencé avec l’utilisation de trypsine enzymatiquement dissocier l’endoderme du mésenchyme ci-joint. L’endoderme isolé a été greffé dans la région de somatopleura d’un embryon de poulet (c) hôte à E3-E3.5 (HH-étapes 20 et 21). Ce mésenchyme hétérologue était considéré comme « permissive » au développement de l’épithélium thymique contribuant également à l’orgue formation3. Par la suite, des vagues successives de cellules progénitrices véhiculés par le sang de poulet hôtes infiltré la caille donneur thymiques épithéliales homologue contribuant à la formation du thymus chez l’hôte embryon3.
Plus récemment, une version modifiée de cette approche s’est avérée aussi important pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation de thymus5. À cet égard, les tissus impliqués dans la formation du thymus ectopique dans les embryons chimères3 ont été isolés, tous deux provenant d’embryons de donneurs et hôte et associés ex vivo. Un protocole amélioré a permis d’isoler l’endoderme 3/4PP de caille (E2.5-E3) et le mésoderme somatopleura de poulet (E2.5-E3). Brièvement, les tissus embryonnaires ont été isolées par microchirurgie et sous réserve de la digestion in vitro pancréatine. Aussi, les conditions de la digestion enzymatique, température et temps d’incubation ont été optimisées selon les tissus-type et le stade de développement (tableau 1).
Ensuite, les tissus isolés étaient associés dans un organotypique système in vitro pendant 48 h, comme indiqué précédemment5,6. L’association in vitro de tissus imite les interactions cellulaires les dans l’embryon, de surmonter certaines restrictions de la manipulation in vivo. Ce système est particulièrement utile pour étudier les interactions cellulaires dans les événements morphogène complexes, comme le développement de l’appareil pharyngien.
La contribution de chacun des tissus dans l’histogenèse du thymus, ainsi que la capacité de l’association hétérospécifiques pour générer un thymus peut être davantage explorés en utilisant la méthodologie de CAM, précédemment détaillées5,7,8. Succinctement, les tissus cultivés ont été greffés sur la came d’embryons cE8 et laissés se développer en ovo pendant 10 jours. Ensuite, la formation du thymus a été évaluée par analyse morphologique dans les explants récoltés. Comme dans les études classiques de caille-poulet3, l’épithélium thymique caille a été colonisée par les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPCs) provenant de l’embryon de poulet, qui s’est avéré plus tard contribuer à orgue développement9,10 . Les bactéries hétérotrophes ont migré de l’embryon vers le thymus chimérique ectopique à le fortement vascularisé CAM5,7,8. Caille épithélium thymique dérivée peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques à l’espèce (c’est-à-dire, QCPN – MAb caille périnucléaire), surmontant le besoin de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus.
Cette méthode expérimentale, comme l’approche en deux étapes dans la précédente publication8, permet la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques pendant in vitro et dans le développement d’ovo. En outre, des explants peuvent être récoltées en tout temps-point du cours de l’expérience de8.
Enfin, le protocole détaillé ici permet la préservation des propriétés naturelles et 3D-architecture des tissus embryonnaires, particulièrement utiles pour détailler les modèles d’expression génique in situ des territoires embryonnaires autrement inaccessibles par méthodes conventionnelles. En outre, transcriptome analysis approches, y compris les RNA-seq ou microarrays, peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques tout en fournissant une analyse de « omiques » de tissu-spécifiques à haut débit.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique d’isolation de tissu embryonnaire détaillée ici a été améliorée depuis les précédentes techniques pour produire des embryons chimériques caille-poulet dans différents contextes biologique3,5,6.
Cette approche consiste d’isoler des tissus embryonnaires pures sans nécessiter de manipulation génétique ou l’utilisation de marqueurs spécifiques des tissus, qui sont souvent …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants à Isabel Alcobia pour la lecture critique du manuscrit, Mário Henriques de narration vidéo et Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé d’un système vidéo et de Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
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