Summary
توفر هذه المقالة طريقة لعزل نقية الأنسجة الجنينية من أجنة السمان والدجاج التي يمكن دمجها إلى النموذج السابقين فيفو تشيميريك الأجهزة.
Abstract
وكان القدرة على عزل الأنسجة الجنينية خطوة أساسية لإقامة نظام الوهم الدجاج السمان، الذي بدوره قد قدمت مساهمات بلا منازع لإزاحة الستار عن العمليات الرئيسية في علم الأحياء التنموي.
وهنا يتم وصف أسلوب أمثل لعزل الأنسجة الجنينية من السمان والدجاج بالجراحة والهضم الأنزيمي مع الحفاظ على خصائصه البيولوجية. بعد عزلة، ترتبط الإنزيم أورجانوتيبيك في المختبر ل h. 48 السمان الأنسجة من كل الأنواع ويمكن التمييز بميزات النووية متميزة والمؤشرات الجزيئية التي تتيح دراسة الحديث عبر الهاتف الخلوي بين أنسجة الدجاج رابطة هيتيروسبيسيفيك للأنسجة. هذا النهج، لذلك، أداة مفيدة لدراسة تفاعلات الأنسجة المعقدة في العمليات الإنمائية مع التعديلات المكانية ديناميكية للغاية، مثل تلك التي تحدث أثناء morphogenesis البلعوم وتشكيل المعي أجهزة المستمدة من الأنسجة. ووضع هذا النهج التجريبي الأولى لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية. في هذا الصدد، بداية الغدة الصعترية المحتملين المستمدة من الأنسجة والمستمدة من ميسوديرم ميسينتشيمي، تم عزل من الأجنة السمان والدجاج، على التوالي.
يمكن اختبار قدرة الأنسجة المرتبطة بها لإنشاء الأجهزة كذلك بتطعيم لهم على الغشاء تشوريوالانتويك (كام) جنين الدجاج. كام توفر المواد الغذائية، ويتيح تبادل الغاز للأنسجة اكسبلانتيد. بعد 10 أيام في التنمية ovo، يمكن تحليل أجهزة تشيميريك في اكسبلانتس المقطوع بالطرق المورفولوجية التقليدية. يسمح هذا الإجراء أيضا دراسة المساهمات الخاصة بالانسجة أثناء تكوين الجهاز، ومن تطورها الأولى (التنمية في المختبر) إلى المراحل النهائية من أورجانوجينيسيس (في التنمية ovo).
أخيرا، توفر طريقة تحسين العزل أيضا ثريديمينسيونالي (3D) الحفاظ على الأنسجة الجنينية، التي يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الطوبوغرافية عالية الاستبانة لأنماط التعبير الجيني الأنسجة على حدة.
Introduction
في أوائل السبعينات، وضعت نظاما أنيقة الدجاج السمان الوهم Le دارين، فتح آفاقاً جديدة لفهم دور الهجرة الخلية والتفاعلات الخلوية أثناء التنمية1،2. وقد وضع النموذج على الفرضية القائلة بأن الخلية التبادل بين هذين النوعين لا تخل إلى حد كبير امبريوجينيسيس، أكد في وقت لاحق عندما تستخدم لدراسة العمليات الإنمائية العديدة، بما في ذلك تشكيل الجهاز العصبي والمكونة للدم نظم1. أخذ هذا الأخير على سبيل مثال، موجات دورية من فروعه المكونة للدم استعمار بداية الظهارية الغدة الصعترية أولاً لوحظ استخدام نظام الوهم الدجاج السمان3. لذلك، إقليم المحتملين من الغدة الصعترية، الأنسجة الحقائب الثالث والرابع البلعوم (3/4PP)، بمعزولة ميكانيكيا وانزيماتيكالي من الأجنة السمان (q) مرحلة 15 إلى 30-سميط [يوم الجنينية (ه) 1.5-E2.5]. وهذه المراحل تتوافق مع الدجاج الهامبرغر وهاميلتون4 (ح ح)-مراحل 12-17. بدأت إجراءات العزل باستخدام التربسين انزيماتيكالي ننأى الأنسجة من mesenchyme المرفقة. كان المطعمة الأنسجة المعزولة في منطقة سوماتوبليورا جنين الدجاج (ج) المضيف في E3-E3.5 (سمو-مراحل، 20-21). واعتبر هذا mesenchyme مغايرة "المتساهلة" للتنمية ظهارة الغدة الصعترية المساهمة أيضا في تشكيل الجهاز3. بعد ذلك، تسلل موجات متعاقبة من الدجاج المضيف السلف التي يحملها الدم الخلايا نظيره السمان الظهارية الغدة الصعترية الجهات المانحة المساهمة في تكوين الغدة الصعترية في الجنين المضيف3.
في الآونة الأخيرة، كما ثبت نسخة معدلة من هذا النهج مهما لدراسة التفاعلات بين الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية5. وفي هذا الصدد، معزولة، سواء من الأجنة المانحة والمضيفة، الأنسجة تشارك في تكوين الغدة الصعترية حمل خارج الرحم في الأجنة تشيميريك3 والمرتبطة السابقين فيفو. واستخدمت بروتوكولا محسنة لعزل الأنسجة 3/4PP السمان (E2.5-E3) وميسوديرم سوماتوبليورا الدجاج (E2.5-E3). بإيجاز، عزلت الأنسجة الجنينية الجراحة الدقيقة وتخضع الهضم بنكرياتين في المختبر. أيضا، كانت الأمثل الشروط الهضم الأنزيمي ودرجة الحرارة والوقت من الحضانة وفقا لنوع الأنسجة ومرحلة النمو (الجدول 1).
بعد ذلك، كانت المرتبطة الأنسجة المعزولة في أورجانوتيبيك في المختبر نظام ح 48، كما ذكر سابقا5،6. رابطة الأنسجة في المختبر يحاكي التفاعلات الخلوية المحلية في الجنين، التغلب على بعض القيود للتلاعب في الحية. هذا النظام مفيد بشكل خاص لدراسة التفاعلات الخلوية في أحداث morphogenic المعقدة، مثل تطوير جهاز البلعوم.
مساهمة كل الأنسجة في هيستوجينيسيس الغدة الصعترية، فضلا عن قدرة الرابطة هيتيروسبيسيفيك لتوليد الغدة الصعترية يمكن مواصلة استكشاف استخدام منهجية كام و مفصلة قبل5،،من78. إيجاز، الأنسجة المستزرعة المطعمة على كام cE8 الأجنة ويسمح بوضع في ovo لمدة 10 أيام. بعد ذلك، تم تقييم تكوين الغدة الصعترية بالتحليل المورفولوجي في explants المقطوع. كما هو الحال في الدراسات الكلاسيكية الدجاج السمان3، كان من ظهارة الغدة الصعترية السمان استعمر السلف المكونة للدم الخلايا (هبكس) المستمدة من جنين الدجاج، الذي أبدى في وقت لاحق للمساهمة في تطوير الجهاز9،10 . هبكس هاجروا من الجنين إلى الغدة الصعترية تشيميريك خارج الرحم عن طريق vascularized عالية كام5،،من78. السمان يمكن التعرف ظهارة الغدة الصعترية المشتقة من إيمونوهيستوتشيميستري استخدام الأجسام المضادة إبلاغها (أي، قكبن-ماب السمان بيرينوكلير)، التغلب على الحاجة إلى المؤشرات الخاصة بالانسجة الجزيئية.
يسمح هذا الأسلوب التجريبي، اقتراب خطوتين عنها في المنشور السابق8، تحوير مسالك التنبيه بالإدارة العادية لوكلاء الدوائية خلال في المختبر وفي التنمية ovo. أيضا، يمكن أن تحصد explants في أي وقت نقطة لمسار التجربة8.
أخيرا، البروتوكول العزلة هنا بالتفصيل يسمح الحفاظ على الخصائص الطبيعية و 3D-هندسة الأنسجة الجنينية، مفيدة بشكل خاص لتفصيل أنماط التعبير الجيني في الموقع من الأراضي الجنينية وإلا لا يمكن الوصول إليها من قبل الأساليب التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق نهج التحليل الترنسكربيتوم، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أو [ميكروارس]، في الأنسجة المعزولة دون اشتراط البصمات الجينية بينما تقدم تحليلاً "اوميكس" الخاصة بالانسجة عالية إنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كل هذه التجارب اتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية دي التاريخ مركز الطب والرعاية الحيوانية يسبوا.
1-المخصبة حضانة بيض السمان والدجاج
- مكان بيض السمان الياباني (طائر طائر japonica) المخصب في حاضنة هوميديفيد 38 درجة مئوية لمدة 3 أيام. احتضان البيض (بيضة نهاية حادة) مواجهة في قاعة الهواء.
ملاحظة: البيئة هوميديفيد ويتحقق عن طريق وضع حاوية مياه في الجزء السفلي من الحاضنة. - احتضان البويضات المخصبة من الدجاج (Gallus gallus) لأيام 2.5 في حاضنة هوميديفيد 38 درجة مئوية. احتضان البيض في وضع أفقي ووضع علامة على الجانب العلوي باستخدام قطعة من الفحم لتحديد مكان الجنين.
ملاحظة: تبدأ مع 40 من بيض السمان وبيض الدجاج 60 عند وضع هذه التجربة.
2-عزل الأنسجة السمان التي تحتوي على المجال المحتملين من بداية الغدة الصعترية
ملاحظة: استخدم غطاء الاندفاق الصفحي أفقي وتعقيم الأدوات والمواد للبيض التلاعب بالإجراءات في ظروف معقمة.
- إزالة منطقة الجنينية التي تحتوي على الإقليم المفترض لبداية الغدة الصعترية، منطقة القوس البلعوم يحتوي على 3rd و 4th الأقواس (3/4PAR)، كما هو موضح7،8.
- ملء وعاء كبير البورسليكات زجاج (100 مم × 50 مم؛ 100 سم3) مع 60 مل من البرد المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
- مع مساعدة مقص منحنى، اضغط وقطع حفرة دائرية في شل السمان البيض قد تم المحتضنة لمدة 3 أيام. جعل حفرة على الجانب الآخر من البيض غير حادة ونقل الصفار (مع الجنين) إلى الوعاء مع برنامج تلفزيوني الباردة.
- إزالة الجنين من صفار البيض بقطع الغشاء فيتيلين خارجياً للسفن خارج الجنينية استخدام مقص منحنى.
- بمساعدة الملقط رقيقة، مليئة نقل الجنين إلى وعاء صغير (60 مم × 30 مم؛ 15 سم3) 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- مع المصفاة، نقل الجنين إلى 100 مم طبق بيتري مع قاعدة أسود (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة ووضعها تحت ستيريوميكروسكوبي.
- تشريح 3/4PAR، كما هو موضح سابقا8.
- أسبيراتي 3/4PAR ونقل إلى طبق زجاج ثلاثة أرباع مملوءة ببرنامج تلفزيوني الباردة استخدام ماصة باستور معقمة من 2 مل.
- عزل الأنسجة التي تحتوي على الإقليم المفترض لبداية الغدة الصعترية (الأنسجة 3/4PP) بالهضم الأنزيمي مع بنكرياتين.
- مع المساعدة من البسط والملقط رقيقة، مليئة نقل 3/4PAR إلى طبق زجاج ثلاثة أرباع بنكرياتين الباردة (8 ملغ/مل؛ 1:3 إضعاف 25 ملغ/مل مع برنامج تلفزيوني الباردة).
- احتضانها ح 1 على الجليد الهضم الأنزيمي.
ملاحظة: يعتمد وقت الهضم الأنزيمي لمرحلة التنمية (الجدول 1). - ضع الصحن الزجاج تحت ستيريوميكروسكوبي (40 x-60 x التكبير) لعزل الأنسجة من 3/4PAR.
ملاحظة: تبقى جميع الأسطح وحلول البرد أثناء هذا الإجراء. تغيير إلى حل بنكرياتين باردة جديد إذا أخذ وقتاً طويلاً لتشريح الأنسجة (> 15 دقيقة). كمصدر لإضاءة، استخدام مصابيح LED التي أدرجت في ستيريوميكروسكوبي أو الألياف البصرية، تفكر في الحمل الحراري محدودة. - لعزل الأنسجة من الأنسجة المحيطة بها، استخدم اثنين الفولاذ المقاوم للصدأ ميكروسكالبيلس في أصحاب دبوس.
ملاحظة: استخدام ميكروسكالبيلس التي يبلغ قطرها بين 0.1 ملم و 0.2 مم والنيكل دبوس حاملي يبلغ قطرها الافتتاحية الفك 0 ملم إلى 1 ملم.- قم أولاً بإزالة الأنبوب العصبي وتعلق على سطح الأنسجة البلعوم الظهرية mesoderm.
- مع الجانب الظهرية حتى فصل بعناية وإزالة mesenchyme بين الأقواس البلعوم وفضح الحقائب البلعوم. تنفيذ هذا الإجراء على كلا الجانبين من 3/4PAR.
- إزالة أنبوب القلب و mesenchyme المحيطة بالحقائب الأمامي.
- مع الجانب البطني حتى قطع الأديم الظاهر في 2nd والأقواس 3rd البلعوم وإزالة بعناية mesenchyme يعلق على الحقائب. كرر هذا الإجراء على الجانب الآخر من 3/4PAR. وفي هذه المرحلة يجب أن تكون بداية الغدة الدرقية مرئية.
- قم بإزالة أي الخلايا الوسيطة المتبقية التي تعلق على الأنسجة البلعوم مع ميكروسكالبيلس اثنين.
- جعل قطع مستعرضة بين 2nd و 3rd PP، الناي بالانسجة البلعوم يحتوي على 3rd والحقائبال 4 من الجزء الأمامي من الأنسجة بعد بداية الغدة الدرقية و 2nd الحقيبة البلعوم.
- مع المساعدة من البسط والملقط رقيقة، مليئة نقل الأنسجة 3/4PP معزولة لطبق زجاج ثلاثة أرباع 100% مصل بقرى الجنين الباردة (FBS).
- يبقى الطبق الزجاج مع الأنسجة المعزولة على الجليد أثناء التحضير للفحص في المختبر. وبدلاً من ذلك، يمكن الحفاظ على الأنسجة المعزولة ثريديمينسيونالي وتحليلها في الموقع للتعبير الجيني.
3-عزل الدجاج سوماتوبليورا mesoderm
ملاحظة: إجراء البيض إجراءات التلاعب في ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي أفقي وتعقيم الأدوات والمواد.
- إزالة إقليم الجنينية التي تحتوي على ميسوديرم سوماتوبليورا على مستوى سميتس 19-24 (ss19-24).
- إزالة بيض الدجاج من الحاضنة بعد يومين حضانة.
- مع مقص منحنى، فتح ثقب صغير في shell. أدخل إبرة ونضح 2 مل الزلال مع حقنه 10 مل لخفض حجم الزلال داخل البيض ومنع الضرر للجنين (الموجودة أسفل منطقة ملحوظ من shell). تجاهل الزلال يستنشق.
- قص تعميما هول (تصل إلى ثلثي مساحة السطح العلوي) في منطقة ملحوظ من shell استخدام مقص منحنى.
- قص الغشاء فيتيلين خارجياً للسفن اكسترامبريونيك بينما يمسك الجنين بالملقط رقيقة.
- تحت ستيريوميكروسكوبي، وضع الجنين في 100 مم طبق بيتري مع قاعدة سوداء التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
ملاحظة: استخدم ستيريوميكروسكوبي من هذه النقطة إلى الأمام للتكبير التدريجي لإجراءات الجراحة الدقيقة. - استخدام أربعة دبابيس الحشرات رقيقة للاحتفاظ بالجنين إلى الجزء السفلي من اللوحة. ضع السنون الموجودة في منطقة اكسترامبريونيك تشكيل شكل مربع.
- إجراء تخفيضات اثنين بين سميتس 19 و 24 العرض على محور الجنين وعبور جميع الأراضي الجنين، استخدام مقص العين يكر.
- الإفراج عن قسم الأجنة، ss19-24، بقطع حواف الجنينية هامشية.
- الأنسجة aspirate ss19-24 ونقل إلى طبق زجاج ثلاثة أرباع مملوءة ببرنامج تلفزيوني الباردة استخدام ماصة باستور معقمة من 2 مل.
- عزل mesoderm الأفقي من منطقة سوماتوبليورا (ss19-24) عن طريق الهضم الأنزيمي مع بنكرياتين (8 ملغ/مل؛ 1:3 إضعاف 25 ملغ/مل مع برنامج تلفزيوني الباردة).
- مع المساعدة من البسط والملقط رقيقة، ونقل طبق الأنسجة ss19-24 لزجاج ثلاثة أرباع مملوءة بحل بنكرياتين الباردة.
- احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد الهضم الأنزيمي.
- تحت ستيريوميكروسكوبي، عزل mesoderm من الأنسجة المحيطة بها باستخدام ميكروسكالبيلس اثنين في حامل.
ملاحظة: تبقى جميع الأسطح وحلول البرد أثناء هذا الإجراء. تغيير إلى حل بنكرياتين باردة جديد إذا أخذ وقتاً طويلاً لتشريح الأنسجة (> 10 دقيقة.). كمصدر لإضاءة، استخدام مصابيح LED التي أدرجت في ستيريوميكروسكوبي أو الألياف البصرية، تفكر في الحمل الحراري محدودة. - خلال العزلة mesoderm، قم أولاً بإزالة في الأديم الظاهر على السطح تليها مفرزة حذراً من أنسجة سبلانكنوبليورا بطنيا يقع.
- الإفراج عن ميسوديرم حق الجانبية من سوماتوبليورا بقطع في حركة موازية للأنبوب العصبي.
- كرر فصل ميسوديرم من الجانب الأيسر للجنين.
ملاحظة: جعل بطء الحركات ميكروسكالبيل أثناء هذا الإجراء. عصا البروتينات مصفوفة خارج الخلوية المكشوفة للأنسجة ومنع حركة السوائل من الصكوك. - مع المساعدة من البسط والملقط رقيقة مليئة نقل mesoderm معزولة لطبق زجاج ثلاثة أرباع FBS الباردة.
- يبقى الطبق الزجاج مع الأنسجة المعزولة على الجليد أثناء التحضير للفحص في المختبر.
4. في المختبر الإنزيم أورجانوتيبيك: جمعية هيتيروسبيسيفيك للأنسجة 3/4PP السمان والدجاج سوماتوبليورا mesoderm
- تعد الثقافة المتوسطة مع المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS و 1% بكتيريا القلم/3،5.
- وضع شبكة معدنية في 35 مم طبق بيتري مع 5 مل من الثقافة المتوسطة.
ملاحظة: إزالة فائض السائل إلى مستوى السطح المتوسطة مع الجزء العلوي من الشبكة. - بمساعدة الملقط رقيقة، تراجع عامل تصفية الأغشية في المتوسط الثقافة وثم وضعه على رأس الشبكة على سطح واحد على اتصال بالهواء.
ملاحظة: ربع منطقة الغشاء (بقطر 13 مم) كافية للأنسجة الرابطة. - تحت ستيريوميكروسكوبي، معاون الأنسجة المعزولة على رأس عامل التصفية الغشاء. أولاً نقل الأنسجة 3/4PP (الخطوة 2) من الطبق الزجاج بانزلاق لطيف مع المساعدة من زرع ملعقة (أو الملعقة) ورقيقة الملقط. كرر هذا الإجراء ل mesoderm معزولة (الخطوة 3).
ملاحظة: مع المساعدة من ميكروسكالبيل، خلط الأنسجة إلى أقصى حد في الرابطة. - بعناية وضع الأنسجة المرتبطة بها في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ليمكن المطعمة 48 h. الأنسجة المستزرعة على الغشاء تشوريوالانتويك (كام).
ملاحظة: تم تشكيل الجهاز حمل خارج الرحم في كام مفصلة قبل8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تفاصيل البروتوكول وسيلة لعزل الطيور الأنسجة الجنينية لاستخدامها في العديد من النهج التقني البيولوجيا الخلوية والإنمائية. هذا الأسلوب كان يعمل سابقا في دراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة خلال المراحل المبكرة من تكوين الغدة الصعترية5. وهنا، تظهر نتائج جديدة في الشكل 1 و الشكل 2، باستخدام نهج مماثل.
الشكل 1 . دراسة نتائج تمثيلية للتعبير الجيني من ثريديمينسيونالي الحفاظ على البلعوم الأنسجة التي تحتوي على الإقليم المفترض لبداية الغدة الصعترية. التمثيل التخطيطي لجهاز البلعوم والأنسجة المعزولة التي تتضمن 2PP، 3PP و 4PP (في cE3.5 أو qE3) (A). الجامعة-جبل التهجين في الموقع مع BMP7 (ب) و "القنفذ سونيك" (ج) من الأنسجة المعزولة في cE3.5. وأشار إشارات قوية التهجين BMP7 و "القنفذ سونيك" برؤوس بيضاء في الأنسجة 2PP و 3PP (ب) ووسط البلعوم (ج)، على التوالي. A، والأمامية؛ cE، الدجاج الجنينية اليوم؛ L، اليسار؛ ف، اللاحق؛ PP، الحقيبة البلعوم؛ بورصة قطر، يوم الجنينية السمان؛ R، الحق. تغيير حجم أشرطة، 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل رقم 1 رسم تخطيطي للأنسجة المعزولة من البلعوم في qE3 (و cE3.5) (الشكل 1A) والتعبير في الموقع اثنين من الجينات المتعلقة بالانسجة والقنفذ سونيك11،12 BMP713 في الأنسجة المعزولة. وأجريت إجراءات الجامعة-جبل التهجين في الموقع كما هو موضح سابقا5،7. تم اكتشاف في الأنسجة 2PP و 3PP التعبير عن BMP7 واستبعد من البلعوم المركزية و 4PP (المسبار كان يرجى المقدمة من قبل إليزابيث Dupin) (الشكل 1B). على العكس من ذلك، اكتشفت في الأنسجة البلعوم وسط القنفذ سونيك واستبعادها من الحقائب7 (الشكل 1 ج).
الشكل 2 . نتائج تمثيلية السابقين فيفو تشكيل أجهزة تشيميريك- التمثيل التخطيطي للنهج التجريبية المستخدمة لوضع الدجاج السمان ثيمي تشيميريك (A). باختصار، كان مرتبطاً الأنسجة 3/4PP السمان معزولة (qE3) في المختبر مع الدجاج سوماتوبليورا ميسوديرم (cE2.5) ح 48. ثم ح 48 استزراع الأنسجة المطعمة على كام (cE8) ويسمح بوضع في ovo لمدة 10 أيام أخرى. مسلسل أبواب المستمدة من كام اكسبلانتس (غ ب) حللت بالانسجة التقليدية (ب وج) وإيمونوهيستوتشيميستري (د ز). ب ج (التكبير أعلى ب)، وكان الشريحة ملطخة إلى ح & هاء دال و هاء (أعلى التكبير (د))، إيمونوديتيكتيد مع الأجسام المضادة قكبن وكان الشريحة وكونتيرستينيد مع توضع لجيل. في F G (التكبير أعلى من واو)، الشريحة إيمونوديتيكتيد مع عموم المضادة كورونا تشيكية جسم وكونتيرستينيد مع توضع لجيل. رؤساء السهم الأسود يشير إلى قوي إيمونوستينينج بني قكبن (E) و "عموم كورونا تشيكية" (ز). انظر الجدول للمواد للحصول على تفاصيل الصورة. كاليفورنيا، والغضروف؛ الجيش الشعبي، وظهاره؛ PP، الحقيبة البلعوم؛ سوم، العضلات الملساء. تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويبين الشكل 2 تصميم التجريبية المستخدمة في وضع السابقين فيفو الدجاج السمان أجهزة تشيميريك. رابطة هيتيروسبيسيفيك الأنسجة كانت تزرع في المختبر ح 48 تليها في التنمية ovo لمدة 10 أيام (الشكل 2A). وحددت تيمي شكلت في explants المستمدة من كام علم الأنسجة التقليدية. الغدة الصعترية عرض الخصائص المورفولوجية العادية مع مقصورات لب وقشرة متطورة (الشكل 2، ج). كذلك عولج مقاطع المسلسل اكسبلانتس إيمونوسيتوتشيميستري (الشكل 2D-G)، كما وصف5،7. بيرينوكلير قكبن-السمان ماب (الشكل 2D، ﻫ) وعموم المضادة سيتوكيراتين (كورونا) (الشكل 2 واو، وزاي) الأجسام المضادة استخدمت كعلامات للسمان (إبلاغها) والخلايا الظهارية، على التوالي. وأظهرت الغدة الصعترية تشيميريك قكبن+ الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (الشكل 2D، هاء)، وهيكل شبكي (الشكل 2 واو، وزاي)، والاستعمار بالخلايا اللمفاوية (قكبن-) من أصل الجهات المانحة (الدجاج).
| الأنسجة المعزولة | مرحلة التنمية | تركيز | درجة الحرارة | فترة الحضانة |
| الأنسجة البلعوم | q E2-E2.5 | 8 ملغ/مل | على الجليد | 45-60 دقيقة. |
| ج E2.5-E3 | ||||
| q E3 | 8 ملغ/مل | على الجليد | 60-90 دقيقة. | |
| ج E3.5 | ||||
| q الفئة هاء-4 | 8 ملغ/مل | على الجليد | 90 دقيقة. | |
| ج E4.5 | ||||
| ميسوديرم سوماتوبليورا | q E2-E2.5 | 8 ملغ/مل | على الجليد | 30-50 دقيقة. |
| ج E2.5-E3 | ||||
| ج، والدجاج؛ E، ويوم الجنينية؛ q، السمان. | ||||
الجدول 1: أوضاع الهضم الأنزيمي خلال عزل الأنسجة الجنينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تحسين إجراءات عزل الأنسجة الجنينية مفصلة هنا من الأساليب السابقة لإنتاج أجنة الدجاج السمان تشيميريك في مختلف السياقات البيولوجية3،،من56.
وهذا النهج مناسبة لعزل الأنسجة الجنينية نقية دون الحاجة إلى التلاعب بالجينات أو استخدام علامات خاصة بالانسجة، التي غالباً ما تكون غير محددة، الحد من استخدام نماذج حيوانية معدلة وراثيا. ويمكن استخدامه لدراسة التفاعلات بين الظهارية الوسيطة أثناء التطوير، مع القدرة على عزل الأنسجة نقية يجري عاملاً يحد. على سبيل المثال، كما تقدم التنمية، الأنسجة تصبح أكثر سمكا، وأكثر أحكاما، ونعلق على الأنسجة المجاورة الأخرى مثل أن انفصالهما أكثر صعوبة. عليه، هذا الإجراء العزلة غير مناسب للمراحل اللاحقة للتنمية، وهما الراحل أورجانوجينيسيس.
هذا الأسلوب فريد من نوعه لدراسة التعبير الجيني في 3D--الحفاظ على الأنسجة الجنينية. لضمان 3D-سلامة الأنسجة المعزولة، ينبغي إبقاء أدوات ومواد وحلول عند درجات حرارة منخفضة طوال العملية.
الأنسجة ميكروديسيكتيون الإجراء هو أيضا خطوة حاسمة، ويعتمد ليس فقط على إنشاء حذراً من الشروط التجريبية (مثل درجة الحرارة ومدة الهضم الأنزيمي، كما يتضح في الجدول 1)، بل أيضا على التدريب العملي على مضيعة للوقت. هذا الإجراء يتطلب الصبر والممارسة. إذا كان المشغل يفقد مراجع المنطقة أن تشريح، وتقليل التكبير ستيريوسكوبي (20 س) سيوفر مراقبة شاملة التي سوف يساعد هذا القرار الخطوة القادمة.
أنشئ ح 48 في المختبر خطوة لتعزيز التفاعلات الخلوية بين الأنسجة الجنينية متميزة، في حين ovo في الأنسجة التي نمت في كام تدعم التنمية الطويلة الأجل، وتشكيل هيئة تشيميريك لرابطة هيتيروسبيسيفيك للأنسجة 5-الجمعيات الأنسجة في المختبر يمكن التغلب على بعض القيود المفروضة على التلاعب في الحية. على سبيل المثال، الإدارة المحلية للمخدرات أو عوامل النمو (باستخدام الخرز) في مناطق الجنين غير قابلة للوصول في فيفو، يمكن بسهولة إجراء باستخدام هذا النهج في المختبر. هذا وقد أظهرت سابقا لمحاكاة التفاعلات الأنسجة المحلية أثناء تشكيل الهيئة في منطقة البلعوم5.
حصاد explants المتنامية في كام5،،من78 أقل استهلاكاً للوقت وهي طريقة بسيطة لتعقب explants عند مقارنتها بأساليب جمع الأنسجة المطعمة على جدار الجسم للأجنة تشيميريك3. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زرعها كام مع الخلايا والأنسجة من الأنواع الأخرى غير الطيور، وقد استخدمت بنجاح في عدة سياقات التجريبية، من التنمية إلى السرطان14،15. على سبيل المثال، مقايسة كام سبق تطبيقه في دراسات الفئران إلى الدجاج تكثيفها16 ، وكثيراً ما يستخدم لاختبار قدرة الغازية من خلايا الأورام البشرية15.
في الآونة الأخيرة، صادق دراسة أنيقة مع إكسينوجرافت الإنسان في الدجاج الجنين الدجاج كنموذج لاختبار واستكشاف مبكر التنمية البشرية17. وفي المستقبل، سيكون من المثير للاهتمام أن يستكشف المنهجية التي وصف هذه الوثيقة باستخدام الرابطة فيما للأنسجة، والتي قد توفر نهج إضافية للماوس والدراسات التنموية البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب ممتنون إيزابيل الكوبايا لقراءة نقدية من المخطوطة، ماريو إنريكي للسرد الفيديو و Proa فيتور من "دائرة علم الأنسجة" ه هيستولوجيا دي معهد بيولوجيا هل التنمية، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة، لتقديم الدعم التقني. ونحن مدينون لا سيما كايرو باولو و "هوجو سيلفا" من مقاتلي دي أوديوفيسوايس (الوحدة السمعية البصرية)، دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي يسبوا على التزامهم المعلقة بإنتاج هذا الفيديو. ونعترف Microsystems إيكا يرجى توفير ستيريوسكوبي مزودة بنظام فيديو وإلى إينتيرافيس--شركة زراعية-سنة, S.A للمساهمة مع السمان يخصب البيض. هذا العمل كان يدعمه دي كلية الطب دي لشبونة، جامعة دي لشبونة (فمول).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
