Summary
Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.
Abstract
La capacité d’isoler les tissus embryonnaires constituait une étape essentielle pour établir le système de caille-poulet chimère, qui à son tour a contribué incontesté au dévoilement des processus clés en biologie du développement.
Dans les présentes est décrit une méthode optimisée pour isoler des tissus embryonnaires de cailles et de poulets par la microchirurgie et la digestion enzymatique tout en conservant ses propriétés biologiques. Après l’isolement, les tissus de ces deux espèces sont associés lors d’un test in vitro organotypique pendant 48 h. caille et tissus de poulet peuvent être distinguées par caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires permettant l’étude de la diaphonie cellulaire entre hétérospécifiques association des tissus. Cette approche est donc un outil utile pour étudier les interactions de tissu complexe dans le processus de développement avec des modifications spatiales très dynamiques, telles que celles survenant au cours de la morphogénèse du pharynx et de la formation de l’intestin antérieur organes dérivés endoderme. Cette approche expérimentale a été développée afin d’étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation du thymus. À cet égard, l’endoderme dérivés de prospective rudiment thymique et dérivés mesoderm mésenchyme, ont été isolés des embryons de caille et de poulet, respectivement.
La capacité des tissus associés à produire des organes peut être analysée plus loin en leur greffant sur la membrane Chorio-(CAM) d’un embryon de poulet. La came fournit des nutriments et permet les échanges gazeux dans les tissus explantés. Après 10 jours de développement ovo, les organes chimériques peuvent être analysés dans les explants récoltés par les méthodes morphologiques classiques. Cette procédure permet également étudier des contributions spécifiques des tissus au cours de la formation des organes, de ses initial (développement in vitro) pour la phase finale de l’organogenèse (en développement ovo).
Enfin, la méthode d’isolation améliorée fournit également en trois dimensions (3D) préserver les tissus embryonnaires, qui peuvent également être utilisés pour une analyse topographique haute résolution des modèles d’expression génique spécifique aux tissus.
Introduction
Dans les années 1970, un système élégant caille-poulet chimère a été développé par Le Douarin, ouvrant de nouvelles pistes pour comprendre le rôle de la migration cellulaire et interactions cellulaires au cours du développement1,2. Le modèle a été conçu en partant du principe qu’échange de cellules entre les deux espèces ne perturberait pas significativement l’embryogenèse, confirmé plus tard lorsqu’il est utilisé pour étudier les nombreux processus de développement, y compris la formation du système nerveux et le hématopoïétique systèmes de1. Prendre ce dernier à titre d’exemple, les vagues cycliques de progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le rudiment épithélial thymique fut observée à l’aide de la chimère de la caille-poulet système3. Pour cela, le territoire prospectif du thymus, l’endoderme des troisième et quatrième du pharyngés sachets (3/4PP), a été isolé mécaniquement et enzymatiquement embryons de caille (q) de 15 à 30 - stade de segments [1,5-E2.5 jour embryonnaire (E)]. Ces trois phases correspondent au poulet Hamburger et Hamilton4 (HH) - étapes 12-17. Les procédures d’isolement a commencé avec l’utilisation de trypsine enzymatiquement dissocier l’endoderme du mésenchyme ci-joint. L’endoderme isolé a été greffé dans la région de somatopleura d’un embryon de poulet (c) hôte à E3-E3.5 (HH-étapes 20 et 21). Ce mésenchyme hétérologue était considéré comme « permissive » au développement de l’épithélium thymique contribuant également à l’orgue formation3. Par la suite, des vagues successives de cellules progénitrices véhiculés par le sang de poulet hôtes infiltré la caille donneur thymiques épithéliales homologue contribuant à la formation du thymus chez l’hôte embryon3.
Plus récemment, une version modifiée de cette approche s’est avérée aussi important pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation de thymus5. À cet égard, les tissus impliqués dans la formation du thymus ectopique dans les embryons chimères3 ont été isolés, tous deux provenant d’embryons de donneurs et hôte et associés ex vivo. Un protocole amélioré a permis d’isoler l’endoderme 3/4PP de caille (E2.5-E3) et le mésoderme somatopleura de poulet (E2.5-E3). Brièvement, les tissus embryonnaires ont été isolées par microchirurgie et sous réserve de la digestion in vitro pancréatine. Aussi, les conditions de la digestion enzymatique, température et temps d’incubation ont été optimisées selon les tissus-type et le stade de développement (tableau 1).
Ensuite, les tissus isolés étaient associés dans un organotypique système in vitro pendant 48 h, comme indiqué précédemment5,6. L’association in vitro de tissus imite les interactions cellulaires les dans l’embryon, de surmonter certaines restrictions de la manipulation in vivo. Ce système est particulièrement utile pour étudier les interactions cellulaires dans les événements morphogène complexes, comme le développement de l’appareil pharyngien.
La contribution de chacun des tissus dans l’histogenèse du thymus, ainsi que la capacité de l’association hétérospécifiques pour générer un thymus peut être davantage explorés en utilisant la méthodologie de CAM, précédemment détaillées5,7,8. Succinctement, les tissus cultivés ont été greffés sur la came d’embryons cE8 et laissés se développer en ovo pendant 10 jours. Ensuite, la formation du thymus a été évaluée par analyse morphologique dans les explants récoltés. Comme dans les études classiques de caille-poulet3, l’épithélium thymique caille a été colonisée par les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPCs) provenant de l’embryon de poulet, qui s’est avéré plus tard contribuer à orgue développement9,10 . Les bactéries hétérotrophes ont migré de l’embryon vers le thymus chimérique ectopique à le fortement vascularisé CAM5,7,8. Caille épithélium thymique dérivée peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques à l’espèce (c'est-à-dire, QCPN - MAb caille périnucléaire), surmontant le besoin de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus.
Cette méthode expérimentale, comme l’approche en deux étapes dans la précédente publication8, permet la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques pendant in vitro et dans le développement d’ovo. En outre, des explants peuvent être récoltées en tout temps-point du cours de l’expérience de8.
Enfin, le protocole détaillé ici permet la préservation des propriétés naturelles et 3D-architecture des tissus embryonnaires, particulièrement utiles pour détailler les modèles d’expression génique in situ des territoires embryonnaires autrement inaccessibles par méthodes conventionnelles. En outre, transcriptome analysis approches, y compris les RNA-seq ou microarrays, peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques tout en fournissant une analyse de « omiques » de tissu-spécifiques à haut débit.
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Protocol
Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. fécondés d’incubation des oeufs de caille et poulet
- Place fertilisé des oeufs de caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) dans un incubateur humidifié à 38 ° C pendant 3 jours. Incuber les œufs (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans la chambre à air.
Remarque : L’environnement humidifié est réalisé en plaçant un récipient d’eau au fond de la couveuse. - Incuber les œufs fécondés de poulet (Gallus gallus) 2,5 jours dans un incubateur humidifié à 38 ° C. Incuber les œufs dans une position horizontale et marquer le dessus à l’aide d’un morceau de charbon de bois pour identifier l’emplacement de l’embryon.
Remarque : Commencez par 40 œufs de caille et 60 oeufs de poule lors de l’établissement de cette expérience.
2. isolement de l’endoderme caille contenant le domaine éventuel du rudiment du thymus
Remarque : Utiliser une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux pour les procédures de manipulation des oeufs dans des conditions stériles.
- Supprimer la région embryonnaire contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus, de la région arche pharyngienne contenant les 3rd et 4ème arches (3/4PAR), comme le décrit7,8.
- Remplir un bol en verre de borosilicate grand (100 x 50 mm ; 100 cm3) avec 60 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Avec l’aide de ciseaux courbes, tap et couper un trou circulaire dans la coque d’une caille oeuf qui a été incubé pendant 3 jours. Faire le trou sur le côté opposé de le œuf émoussé et transférer le jaune (avec l’embryon) dans le bol avec du PBS froid.
- Retirer l’embryon du vitellus en coupant la membrane vitelline extérieurement aux vaisseaux extra embryonnaire à l’aide de ciseaux courbes.
- Transfert de l’embryon à un petit bol (60 x 30 mm ; 15 cm3) avec l’aide de pinces fines, rempli de 10 mL de PBS froid.
- Avec une écumoire, déplacer l’embryon à une boîte de pétri avec une base noire de 100 mm (voir Table des matières) contenant 10 mL de PBS froide et placez-le sous un stéréomicroscope.
- Disséquer le 3/4PAR, comme décrit précédemment8.
- Aspirer le 3/4PAR et les transférer dans un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.
- Isoler l’endoderme contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus (l’endoderme 3/4PP) par digestion enzymatique avec pancréatine.
- Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert le 3/4PAR à un plat en verre trois quarts remplis de pancréatine froid (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).
- Incuber pendant 1 heure sur la glace pour la digestion enzymatique.
NOTE : Le temps de digestion enzymatique dépend de la phase de développement (tableau 1). - Placez le plat en verre sous le stéréomicroscope (grossissement de 40 x x-60) d’isoler l’endoderme de la 3/4PAR.
NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 15 min). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée. - Pour isoler l’endoderme les tissus environnants, utilisez deux microscalpels inox porte-broche.
Remarque : Utilisez microscalpels avec un diamètre compris entre 0,1 mm et 0. 2 mm et détenteurs de broche de nickel d’un diamètre d’ouverture de mâchoire de 0 mm à 1 mm.- Commencez par retirer le tube neural et le mésoderme attaché à la face dorsale de l’endoderme pharyngien.
- Avec la face dorsale vers le haut, soigneusement détacher et enlever le mésenchyme entre les arcs pharyngiens et exposer les poches pharyngiennes. Exécutez cette procédure sur les deux côtés de la 3/4PAR.
- Enlever le tube de coeur et le mésenchyme entourant les sachets antérieurs.
- Avec la face ventrale vers le haut, coupez l’ectoderme de la 2ème et 3rd arcs pharyngiens et retirez avec précaution le mésenchyme attaché à ces sachets. Répétez cette procédure sur l’autre côté de la 3/4PAR. À ce stade, le rudiment de la thyroïde doit être visible.
- Supprimer toute cellules mésenchymateuses restants attachés à l’endoderme pharyngien avec les deux microscalpels.
- Faites une coupe transversale entre les 2ème et 3rd PP, en dissociant l’endoderme pharyngien contenant les 3rd et 4 sachets deth de la partie antérieure de l’endoderme ayant le rudiment de la thyroïde et 2nd pochette du pharynx.
- Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert l’endoderme 3/4PP isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de 100 % froid sérum bovin fœtal (SVF).
- Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro. Sinon, les tissus isolés peuvent être conservées en trois dimensions et analysées in situ pour l’expression génique.
3. isolement du mésoderme somatopleura poulet
Remarque : Effectuez des oeufs des procédures de manipulation en conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux.
- Retirez le territoire embryonnaire contenant le mésoderme somatopleura au niveau des somites 19-24 (ES19-24).
- Sortir l’oeuf de la poule de l’incubateur après 2,5 jours d’incubation.
- Avec des ciseaux courbes, ouvrez un petit trou dans la coque. Insérer une aiguille et aspirer 2 mL d’albumine avec une seringue de 10 mL pour diminuer le volume de l’albumine à l’intérieur de le œuf et de prévenir les dommages de l’embryon (situé au-dessous de la région marquée de la coquille). Jeter l’albumine aspiré.
- Couper une circulaire trou (jusqu'à deux-tiers de la surface supérieure) dans la région marquée de la coque à l’aide de ciseaux courbes.
- Couper la membrane vitelline extérieurement aux navires extra-embryonnaires tout en maintenant l’embryon avec une pince fine.
- Sous un stéréomicroscope, placer l’embryon dans une boîte de pétri de 100 mm avec une base noire contenant 10 mL de PBS froid.
Remarque : Utilisez un stéréomicroscope à partir de ce moment pour un grossissement progressif des procédures de microchirurgie. - Utilisez quatre broches insectes minces pour tenir l’embryon vers le bas de la plaque. Placer les goupilles dans la région extra-embryonnaires formant une forme carrée.
- Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe de l’embryon et traversant tout le territoire embryonnaire, à l’aide de ciseaux œil wecker.
- Libérer la section de l’embryon, ES19-24, par découpage des bords embryonnaires marginal.
- Aspirer l’ES19-24 tissus et le transfert à un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.
- Isoler le mésoderme latéral de la région de somatopleura (ES19-24) par digestion enzymatique avec pancréatine (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).
- Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert les tissus ES19-24 à un verre plat trois quarts remplis d’une solution froide pancréatine.
- Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour la digestion enzymatique.
- Sous le stéréomicroscope, isoler le mésoderme les tissus environnants à l’aide de deux microscalpels dans un support.
NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 10 min.). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée. - Lors de l’isolation du mésoderme, retirez d’abord l’ectoderme à la surface, suivie d’un détachement prudent des tissus splancnopleura situé sur le ventre.
- Libérer le mésoderme latéral droit de le somatopleura en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural.
- Répétez la séparation du mésoderme du côté gauche de l’embryon.
Remarque : Faire ralentir les mouvements de microscalpel au cours de cette procédure. Les protéines de la matrice extracellulaire exposés collent aux instruments empêchant des mouvements fluides et les tissus. - Avec l’aide de la spatule et pince fine transfert le mésoderme isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de FBS froid.
- Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro.
4. In vitro organotypique dosage : association hétérospécifique de cailles 3/4PP endoderme et mésoderme somatopleura poulet
- Préparer le milieu de culture avec milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep3,5.
- Placer une grille métallique dans un 35 mm boîte de pétri avec 5 mL de milieu de culture.
NOTE : Enlever l’excès de liquide pour niveler la surface moyenne au dessus de la grille. - Avec l’aide de pinces fines, trempez une membrane filtrante dans le milieu de culture et puis placez-le sur le dessus de la grille pour avoir une surface de contact de l’air.
Remarque : Un quart de la surface de la membrane (avec 13 mm de diamètre) est suffisant pour l’association de tissu. - Sous le stéréomicroscope, associer les tissus isolés sur le dessus de la membrane filtrante. Tout d’abord transférer l’endoderme 3/4PP (étape 2) du verre plat en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Répétez cette procédure pour le mésoderme isolé (étape 3).
Remarque : Avec l’aide d’un microscalpel, mélanger les tissus afin de maximiser son association. - Placer soigneusement les tissus associés dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 à humidifié pour tissus cultivés de 48 h. peuvent être greffés sur la membrane Chorio-(CAM).
NOTE : Formation des organes ectopique dans la came a été détaillé précédemment8.
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Representative Results
Le protocole décrit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires aviaires pour être utilisé dans plusieurs approches de techniques de biologie cellulaire et du développement. Cette méthode a été précédemment employée pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant les premiers stades de formation de thymus5. Dans les présentes, nouveaux résultats sont indiqués dans la Figure 1 et Figure 2, en utilisant des approches similaires.
Figure 1 . Étudient les résultats représentatifs d’expression de gène de conservé en trois dimensions endoderme pharyngien contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus. Représentation schématique de l’appareil pharyngien et endoderme isolé contenant le 2PP, 3PP 4PP (au cE3.5 ou qE3) (A). Entier-montez l’hybridation in situ avec BMP7 (B) et Sonic Hedgehog (C) de l’endoderme isolé à cE3.5. Signaux d’hybridation forte de BMP7 et Sonic Hedgehog pointé par des pointes de flèche blanches dans l’endoderme des 2PP et 3PP (B) et du pharynx central (C), respectivement. A, antérieure ; cE, jour embryonnaire de poulet ; L, gauche ; P, postérieur ; PP, poche pharyngée ; qE, caille embryonnaires jour ; R., droit. Barres, 50 µm. l’échelle s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 1 est un dessin schématique de l’endoderme isolé du pharynx à qE3 (et cE3.5) (Figure 1 a) et l’expression in situe de deux gènes liés à l’endoderme, sonic hedgehog11,12 et13 de la BMP7 dans les tissus isolés. Les procédures d’entier-montez l’hybridation in situ ont été réalisées comme décrit précédemment5,7. L’expression de la BMP7 a été détectée dans l’endoderme des 2PP et 3PP et exclue du pharynx central et 4PP (sonde a été aimablement fournie par Elisabeth Dupin) (Figure 1 b). À l’inverse, hérisson sonic a été détectée dans l’endoderme du pharynx central et exclus les sachets7 (Figure 1C).
Figure 2 . Des résultats représentatifs des ex vivo formation d’organes chimériques. Représentation schématique de l’approche expérimentale utilisée pour développer la thymi chimérique caille-poulet (A). En bref, l’endoderme de 3/4PP caille isolés (qE3) était associée à in vitro mésoderme de somatopleura de poulet (cE2.5) pendant 48 h. Les tissus de 48 h de culture ont été greffés sur la CAM (cE8) et se développera en ovo pendant plus de 10 jours. Coupes sériées d’explants de CAM-dérivé (G-B) ont été analysés par l’histologie conventionnelle (B et C) et l’immunohistochimie (D à G). B et C (grossissement de B), la lame était tachée avec H & E. D et E (grossissement de D), la diapositive a été immudodétectée avec l’anticorps QCPN et eosine avec l’hématoxyline Gill. F et G (grossissement supérieur de F), la lame a été immudodétectée avec un anticorps anti-Pan CK et eosine avec l’hématoxyline Gill. Têtes de flèche noire pointent vers fort immunomarquage brun de QCPN (E) et Pan CK (G). Voir Table des matières pour plus de détails image acquisition. Ca, cartilage ; EP, épithélium ; PP, poche pharyngée ; SoM, muscle lisse. Barreaux de l’échelle : 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2 présente le protocole expérimental utilisé pour développer ex vivo organes chimérique de caille-poulet. L’association hétérospécifique de tissus ont été cultivée in vitro pendant 48 h, puis dans le développement d’ovo pendant 10 jours (Figure 2 a). Thymi formé des explants de CAM-dérivées ont été identifiés par l’histologie conventionnelle. Le thymus présentent des caractéristiques morphologiques normales bien développés compartiments médulla et le cortex (Figure 2 b, C). Coupes sériées des explants étaient encore traités pour l’immunocytochimie (Figure 2D- G), comme décrit5,7. Le QCPN - MAb caille périnucléaire (Figure 2D, E as EventArgs) et anti-pan cytokératine (CK) (Figure 2F, G) anticorps ont été utilisés comme marqueurs pour caille (spécifiques) et les cellules épithéliales, respectivement. Le thymus chimérique ont montré des cellules épithéliales thymiques QCPN+ (Figure 2D, E), une architecture réticulaire (Figure 2F, G) et la colonisation par les cellules lymphoïdes (QCPN-) d’origine donneur (poulet).
| Tissus isolés | Stade de développement | Concentration de | Température | Période d’incubation |
| Endoderme du pharynx | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Sur la glace | 45 – 60 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | Sur la glace | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | Sur la glace | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Somatopleura mésoderme | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | Sur la glace | 30 – 50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, poulet ; E, jour embryonnaire ; q, caille. | ||||
Tableau 1 : Conditions de digestion enzymatique au cours de l’isolement des tissus embryonnaires.
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Discussion
La technique d’isolation de tissu embryonnaire détaillée ici a été améliorée depuis les précédentes techniques pour produire des embryons chimériques caille-poulet dans différents contextes biologique3,5,6.
Cette approche consiste d’isoler des tissus embryonnaires pures sans nécessiter de manipulation génétique ou l’utilisation de marqueurs spécifiques des tissus, qui sont souvent indéterminé, limitant l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés. Il peut être utilisé pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse au cours du développement, avec la possibilité d’isoler les tissus purs étant le facteur limitant. Par exemple, au fur et développement, les tissus devenus plus épais, plus compact et attacher à d’autres tissus voisins, tels que leur séparation est plus difficile. Cette procédure d’isolement est donc impropre à des stades ultérieurs du développement, à savoir fin-organogenèse.
Cette méthode est unique pour étudier l’expression génique dans les tissus embryonnaires 3D préservés. Afin d’assurer l’intégrité des tissus isolés 3D, les instruments, des matériaux et des solutions doivent être à basse température pendant tout le processus.
La procédure de microdissection de tissu est également une étape essentielle qui s’appuie non seulement sur la mise en place minutieuse des conditions expérimentales (comme la température et la durée de la digestion enzymatique, comme illustré dans le tableau 1), mais aussi sur la temps de formation pratique. Cette procédure requiert patience et pratique. Si l’opérateur perd les références de la région à être disséqué, diminuant le grossissement de stéréoscope (20 x) fournira une observation globale qui aide la prochaine décision de déménagement.
Les 48 h à l’étape de vitro a été créé pour promouvoir les interactions cellulaires entre les tissus embryonnaires distinctes, tandis que l’ovo en tissus cultivés dans la came prend en charge le développement à long terme et la formation des organes chimérique de l’association hétérospécifique de tissus 5. les associations de tissus in vitro peuvent surmonter certaines limitations de manipulations in vivo. Par exemple, de l’administration locale de médicaments ou de facteurs de croissance (à l’aide de perles) dans les régions de l’embryon autrement inaccessible en vivo, peut être facilement effectuée à l’aide de cette approche in vitro. Cela a été démontré pour imiter les interactions tissulaires locales au cours de la formation des organes dans la région du pharynx5.
La récolte des explants de plus en plus en CAM5,7,8 prend moins de temps et est une méthode simple pour effectuer le suivi des explants comparativement aux méthodes de collecte de tissus greffés sur la paroi du corps des embryons chimères3. En outre, CAM peut être transplanté avec des cellules et de tissus provenant d’autres espèces non-avien, et il a été utilisé avec succès dans plusieurs contextes expérimentaux, de développement de cancer14,15. Par exemple, le test de la CAM a été précédemment appliqué dans la souris-en-poulet xénogreffes études16 et est fréquemment utilisé pour tester les capacités invasives des cellules de tumeurs humaines15.
Récemment, une étude élégante avec l’homme-en-poulet xénogreffe a validé l’embryon de poulet comme un modèle pour tester et explorer début développement humain17. À l’avenir, il sera intéressant d’étudier la méthodologie décrite dans les présentes à l’aide de l’association interspécifique des tissus, qui peuvent fournir des méthodes supplémentaires pour les souris et les études sur le développement humains.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à Isabel Alcobia pour la lecture critique du manuscrit, Mário Henriques de narration vidéo et Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé d’un système vidéo et de Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
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