Summary
Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.
Abstract
La capacidad de aislar los tejidos embrionarios fue un paso esencial para establecer el sistema de pollo de codorniz quimera, que a su vez ha proporcionado contribuciones indiscutibles a develar procesos clave en la biología del desarrollo.
Es en este documento se describe un método optimizado para aislar los tejidos embrionarios de codornices y pollos por microcirugía y digestión enzimática conservando sus propiedades biológicas. Después de aislamiento, los tejidos de ambas especies se asocian en un ensayo in vitro organotypic de 48 h. de codorniz y los tejidos de pollo pueden ser discriminados por las características nucleares distintas y marcadores moleculares, lo que permite el estudio de la diafonía celular entre heteroespecíficas Asociación de tejidos. Este enfoque es, por lo tanto, una herramienta útil para el estudio de las interacciones de tejido complejo en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas, tales como ésos que ocurren durante la morfogénesis faríngea y la formación del foregut órganos derivados del endodermo. Este enfoque experimental primero fue desarrollado para estudiar las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación del timo. En este sentido, el rudimento tímico potencial derivados del endodermo y mesodermo derivado mesenchyme, fueron aislados de embriones de codorniz y de pollo, respectivamente.
La capacidad de los tejidos asociados para generar órganos puede probarse más por injerto sobre la membranas corioalantoideas (CAM) de un embrión de pollo. El CAM proporciona nutrientes y permite intercambios de gases a los tejidos explanted. Después de 10 días de desarrollo de ovo, los órganos quiméricos pueden ser analizados en los explantes cosechados por los métodos morfológicos convencionales. Este procedimiento también permite estudiar las contribuciones específicas de tejido durante la formación de órganos, desde su desarrollo inicial (desarrollo in vitro) la fase final de la organogénesis (en desarrollo de ovo).
Por último, el método de aislamiento mejorado también proporciona tridimensionalmente (3D) conserva los tejidos embrionarios, que también pueden utilizarse para el análisis topográfico de alta resolución de los patrones de expresión génica específica de tejido.
Introduction
En la década de 1970, un sistema elegante de codorniz-gallina de quimera fue desarrollado por Le Douarin, abriendo nuevas vías para entender el papel de la migración celular y las interacciones celulares durante el desarrollo1,2. El modelo fue ideado en la premisa de que del intercambio entre las dos especies no molestaría considerablemente embriogénesis, confirmado más adelante cuando se utiliza para el estudio de numerosos procesos de desarrollo, incluyendo la formación de nervioso y las hematopoyéticas sistemas1. Tomando este último como un ejemplo, las ondas cíclicas de progenitores hematopoyéticos colonizando el rudimento epitelial tímica se observó por primera vez utilizando el sistema quimera de codorniz-gallina de3. Para ello, el territorio prospectivo del timo, el endodermo de las bolsas de tercer y cuarto faríngeos (3/4PP), era mecánica y enzimáticamente aislado de embriones de codorniz (q) en 15 - 30 etapa somite [día embrionario (E) 1.5-E2.5]. Estas etapas corresponden a pollo Hamburger y Hamilton4 (HH) - 12-17. Los procedimientos de aislamiento comenzaron con el uso de la tripsina enzimáticamente disociar el endodermo de la mesénquima adjunto. El endodermo aislado se injertó en la región de la somatopleura de un embrión de pollo (c) de host en el E3-E3.5 (HH-etapas 20-21). Este mesénquima heteróloga consideró "permisivo" para el desarrollo de epitelio tímico, contribuyendo también a la formación de órganos3. Después, sucesivas oleadas de las células del progenitor transmitidas por la sangre del huésped pollo se infiltraron en la codorniz donantes tímicas epiteliales contraparte contribuyendo a la formación del timo en el embrión huésped del3.
Más recientemente, una versión modificada de este método fue demostrada para ser importante para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. En este sentido, los tejidos involucrados en la formación del timo ectópico en embriones quiméricos3 fueron aislados de embriones de donante y huésped y asociados ex vivo. Se utilizó un protocolo mejorado para aislar el endodermo 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) y el mesodermo de la somatopleura de pollo (E2.5-E3). Brevemente, los tejidos embrionarios se aislaron por microcirugía y digestión in vitro pancreatina. Además, las condiciones de digestión enzimática, temperatura y tiempo de incubación fueron optimizadas según el tipo de tejido y etapa de desarrollo (tabla 1).
A continuación, los tejidos aislados se asociaron en un organotypic sistema vitro durante 48 h, como previamente divulgados5,6. La Asociación in vitro de tejidos imita las interacciones locales de celulares en el embrión, superando algunas limitaciones de la manipulación en vivo. Este sistema es particularmente útil para el estudio de las interacciones celulares en complejos eventos morfogénicos, como el desarrollo del aparato faríngeo.
La contribución de cada tejido en la histogénesis del timo, así como la capacidad de la Asociación heteroespecíficas para generar un timo puede ser más explorado utilizando la metodología de CAM, anteriormente detallada5,7,8. Sucintamente, los tejidos cultivados fueron injertados en la leva de embriones cE8 y permitió desarrollar en ovo por 10 días. Entonces, formación de timo fue evaluada mediante análisis morfológico de los explantes cosechados. Como en la clásica de codorniz-gallina de estudios3, el epitelio tímico de codorniz fue colonizado por las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs) derivadas del embrión de pollo, que fue demostrado más adelante para contribuir al desarrollo de órgano9,10 . Los HPCs emigraron del embrión a timo ectópico quimérico a la altamente vascularizado CAM5,7,8. Codorniz derivada epitelio tímico puede identificarse por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, QCPN - MAb codorniz PeriNuclear), superación de la necesidad de marcadores moleculares específicos de tejido.
Este método experimental, como el enfoque de dos pasos registrado en la anterior publicación8, permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos in vitro y en el desarrollo de ovo. También, los explantes se pueden cosechar en cualquier momento del curso del experimento8.
Por último, el protocolo de aislamiento aquí detallado permite la preservación de las propiedades naturales y 3D-arquitectura de los tejidos embrionarios, particularmente útiles para detallar patrones de expresión génica en situ de territorios embrionarios de lo contrario inaccesibles por métodos convencionales. Además, enfoques de análisis del transcriptoma, incluyendo RNA-seq o microarrays, pueden también aplicarse en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos mientras que proporciona un análisis de alto rendimiento de tejidos específicos "ómicas".
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Protocol
Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de huevo de codorniz y pollo de fertilizan
- Lugar fertilizado huevos de codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) en una incubadora humidificada de 38 ° C durante 3 días. Incubar los huevos (extremo romo del huevo) hacia arriba en la cámara de aire.
Nota: El ambiente humidificado se logra colocando un recipiente de agua en la parte inferior de la incubadora. - Incubar huevos fertilizados del pollo (Gallus gallus) 2,5 días en una incubadora humidificada de 38 ° C. Incubar los huevos en posición horizontal y marque la parte superior usando un pedazo de carbón para identificar la ubicación del embrión.
Nota: Comience con huevos de codorniz 40 y 60 huevos de gallina al establecer este experimento.
2. aislamiento del endodermo de la codorniz que contiene el dominio prospectivo de rudimento tímico
Nota: Use una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales para los procedimientos de manipulación del huevo en condiciones estériles.
- Quitar la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico, la región faríngea de arco que contiene elrd de 3 y 4th arcos (3/4PAR), como se describe7,8.
- Llene un recipiente grande de vidrio borosilicato (100 x 50 mm, 100 cm3) con 60 mL de frío con tampón fosfato salino (PBS).
- Con la ayuda de tijeras curvas, toque y corte un orificio circular en la cáscara de una codorniz huevo que ha sido incubada durante 3 días. Hacer el agujero en el lado opuesto del huevo Romo y transferencia de la yema (con embrión) a la taza con PBS frío.
- Retire el embrión de la yema cortando la membrana vitelina externamente a los vasos extra embrionarios con tijeras curvas.
- Con la ayuda de Pinzas finas, transferencia del embrión a un recipiente pequeño (60 mm x 30 mm; 15 cm3) llena con 10 mL de PBS frío.
- Con una espumadera, pasar el embrión a una placa de Petri con una base negra de 100 mm (véase Tabla de materiales) que contienen 10 mL de PBS frío y colocarlo bajo un estereomicroscopio.
- Diseccionar el 3/4PAR, como se describió previamente8.
- Aspirado el 3/4PAR y transfiéralo a un plato de cristal tres cuartas partes llenaron de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
- Aislar el endodermo que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico (el endodermo 3/4PP) por digestión enzimática con pancreatina.
- Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, 3/4PAR transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de frío pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).
- Incubar durante 1 h en el hielo para la digestión enzimática.
Nota: El tiempo de digestión enzimática depende de la etapa del desarrollo (tabla 1). - Coloque el plato de vidrio bajo el estereomicroscopio (aumento de x-60 x 40) para aislar el endodermo de la 3/4PAR.
Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 15 min). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada. - Para aislar el endodermo de los tejidos circundantes, utilice dos microscalpels de acero inoxidable en los titulares de pin.
Nota: Utilice microscalpels con un diámetro entre 0,1 mm y 0,2 mm y níquel pasador titulares con un diámetro de abertura de quijada de 0 mm a 1 mm.- Primero retire el tubo neural y mesodermo unido a la superficie dorsal del endodermo faríngeo.
- Con el lado dorsal hacia arriba, con cuidado separar y quitar el mesénquima entre los arcos faríngeos y exponer las bolsas faríngeas. Realizar este procedimiento en ambos lados de la 3/4PAR.
- Retire el tubo del corazón y el mesénquima que rodea las bolsas anteriores.
- Con la parte ventral hacia arriba, corte del ectodermo de la 2º y 3rd arcos faríngeos y retire con cuidado el mesénquima a las bolsas. Repita este procedimiento en el otro lado de la 3/4PAR. En esta etapa el rudimento de la tiroides debe ser visible.
- Retire cualquier restantes células mesenquimales que atado al endodermo faríngeo con el dos microscalpels.
- Hacer un corte transversal entre el 2y y 3rd PP, disociando el endodermo faríngeo que contiene elrd de 3 y 4 bolsas delth de la parte anterior del endodermo que el rudimento de la tiroides y 2nd bolsa faríngea.
- Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia el endodermo 3/4PP aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de suero bovino fetal (FBS) de frío de 100%.
- Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Alternativamente, pueden preservarse tridimensionalmente los tejidos aislados y analizados in situ para la expresión génica.
3. aislamiento de mesodermo somatopleura de pollo
Nota: Ejecutar el huevo procedimientos de manipulación en condiciones estériles, utilizando una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales.
- Quitar el territorio embrionario que contiene el mesodermo de la somatopleura del nivel de los somitas 19-24 (ss19-24).
- Retirar el huevo del pollo de la incubadora después de 2,5 días de incubación.
- Con tijeras curvas, abra un pequeño agujero en la cáscara. Inserte una aguja y aspirar 2 mL de albúmina con una jeringa de 10 mL para bajar volumen de albúmina dentro del huevo y evitar daños del embrión (ubicado debajo de la región marcada de la cáscara). Deseche la albúmina aspirada.
- Corte circular (hasta dos tercios de la superficie superior) del agujero en la región marcada del caparazón con unas tijeras curvas.
- Cortar la membrana vitelina externamente a los vasos extraembrionarias mientras sostiene el embrión con pinzas finas.
- Bajo un estereomicroscopio, colocar el embrión en una placa de Petri de 100 mm con una base negra que contiene 10 mL de PBS frío.
Nota: Use un estereomicroscopio de aquí en adelante para un aumento progresivo de los procedimientos de microcirugía. - Use cuatro pernos insectos delgados para mantener el embrión en la parte inferior de la placa. Coloque los pernos en la región extraembrionarias formando un cuadrado.
- Realizar dos cortes entre las somitas 19 y 24 transversalmente en el eje embrionario y cruzar todo el territorio embrión, utilizando tijeras de ojo de wecker.
- Liberar la sección embrión, ss19-24, por marginal embrionaria bordes de corte.
- Los tejidos aspirados ss19-24 y transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes llenan de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.
- Aislar el mesoderm lateral de la región de la somatopleura (ss19-24) por digestión enzimática con pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).
- Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia de los tejidos ss19-24 a un vaso plato tres cuartos llenados con solución fría de pancreatina.
- Incubar durante 30 min en hielo para la digestión enzimática.
- Bajo el estereomicroscopio, aislar el mesodermo de los tejidos circundantes con dos microscalpels en un soporte.
Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 10 min.). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada. - Durante el aislamiento del mesodermo, primero retire el ectodermo en la superficie, seguida por la separación cuidadosa de los tejidos splancnopleura situado ventralmente.
- Suelte el mesodermo lateral derecho de la somatopleura cortando en un movimiento paralelo al tubo neural.
- Repita la separación del mesodermo del lado izquierdo del embrión.
Nota: Hacer lentos movimientos de microscalpel durante este procedimiento. Las proteínas de la matriz extracelular expuesta se pegan a los tejidos e instrumentos de prevención de movimientos fluidos. - Con la ayuda de una espátula y pinzas finas transferencia el mesodermo aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de equipos frío.
- Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro.
4. In vitro organotypic ensayo: heteroespecíficas Asociación de endodermo 3/4PP de codorniz y pollo somatopleura mesodermo
- Preparar el medio de cultivo con Medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS y 1% pluma/Strep3,5.
- Colocar una rejilla metálica en una placa de Petri con 5 mL de medio de cultivo de 35 mm.
Nota: Retire el exceso de líquido a nivel de la superficie del medio con la parte superior de la rejilla. - Con la ayuda de Pinzas finas, un filtro de membrana de la inmersión en el medio de cultivo y colocarla en la parte superior de la cuadrícula para tener una superficie de contacto con el aire.
Nota: Un cuarto de la superficie de la membrana (con 13 mm de diámetro) es adecuado para la Asociación de tejidos. - Bajo el estereomicroscopio, asociar los tejidos aislados en la parte superior del filtro de membrana. Primero transferir el endodermo 3/4PP (paso 2) desde el plato de vidrio suave deslizamiento con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Repita este procedimiento para el mesodermo aislado (paso 3).
Nota: Con la ayuda de un microscalpel, mezcla de los tejidos para maximizar su asociación. - Coloque cuidadosamente los tejidos asociados en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2 para tejidos cultivados 48 h. pueden ser injertados en la membranas corioalantoideas (CAM).
Nota: La formación ectópica de órgano en la leva fue anteriormente detallada8.
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Representative Results
El protocolo detalla un método para aislar los tejidos embrionarios aviares a utilizarse en varios métodos técnicas de biología celular y del desarrollo. Este método fue empleado anteriormente para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. Aquí, nuevos resultados se muestran en la figura 1 y figura 2, usando métodos similares.
Figura 1 . Estudian de resultados representativos de la expresión génica de three-dimensionally preservadas endodermo faríngeo que contiene el territorio presuntivo del rudimento de thymus. Representación esquemática del aparato faríngeo y endodermo aislada que contiene la 2PP, 3PP y 4PP (a cE3.5 o qE3) (A). Conjunto de montaje de hibridación in situ con BMP7 (B) y Sonic Hedgehog (C) del endodermo aislado a cE3.5. Las señales de hibridación fuerte de BMP7 y Sonic Hedgehog que señala blanco puntas de flecha en el endodermo de la 2PP y 3PP (B) y la faringe central (C), respectivamente. A anterior; cE, día embrionario de pollo; L, izquierda; P, posterior; PP, faríngeo; qE, día embrionario codorniz; R, derecho. Escala de bares, 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 1 es un dibujo esquemático del endodermo de la faringe en el qE3 (y cE3.5) (figura 1A) y la expresión in situ de dos genes relacionados con el endodermo, sonic hedgehog11,12 y BMP713 en el tejido aislado. Los procedimientos de montaje conjunto de hibridación in situ se realizaron como se describió anteriormente5,7. La expresión de BMP7 fue detectada en el endodermo de la 2PP y 3PP y excluida de la faringe central y 4PP (punta de prueba fue amablemente proporcionada por Elisabeth Dupin) (figura 1B). Por el contrario, sonic hedgehog fue detectada en el endodermo de la faringe central y excluido de las bolsas7 (figura 1C).
Figura 2 . Resultados representativos de ex vivo formación de órganos quiméricas. Representación esquemática del enfoque experimental para desarrollar pollo de codorniz thymi quimérica (A). Brevemente, el endodermo codorniz aislado de 3/4PP (qE3) fue asociado en vitro mesodermo somatopleura de pollo (cE2.5) durante 48 h. Los tejidos 48 h cultivada fueron injertados en la CAM (cE8) y permitió desarrollar en ovo por más de 10 días. Secciones seriadas de los explantes derivados de CAM (B-G) fueron analizadas por histología convencional (B y C) e inmunohistoquímica (D hasta G). En B y C (a mayor aumento de B), la diapositiva fue teñida con H & E. En D y E (aumento mayor de D), la diapositiva fue immunodetected con el anticuerpo QCPN y contratinción con hematoxilina de Gill. En F y G (mayor aumento de F), la diapositiva fue immunodetected con el anticuerpo de anti-Pan CK y contratinción con hematoxilina de Gill. Cabezas de flecha negras señalan el immunostaining marrón fuerte de QCPN (E) y CK (G) de Pan. Véase Tabla de materiales para detalles de la adquisición de imagen. CA, cartílago; EP, epitelio; PP, faríngeo; MOS, músculo liso. Barras de escala: 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 muestra el diseño experimental utilizado para desarrollar ex vivo órganos quimérica de pollo de codorniz. La Asociación heteroespecíficas de tejidos fueron cultivada in vitro durante 48 h, seguida en el desarrollo de ovo por 10 días (figura 2A). Thymi formado en explantes derivados de CAM fueron identificados por la histología convencional. El timo presenta características morfológicas normales con compartimentos bien desarrollados de médula y la corteza (figura 2B, C). Secciones seriadas de los explantes fueron tratadas más para inmunocitoquímica (Figura 2D- G), como describió5,7. El QCPN - MAb codorniz perinuclear (Figura 2D, E) y anti-bandeja citoqueratina (CK) (figura 2F, G) anticuerpos fueron utilizados como marcadores para la codorniz (específicos) y las células epiteliales, respectivamente. El timo quimérico mostró células epiteliales tímicas de QCPN+ (Figura 2D, E), una arquitectura reticular (figura 2F, G) y la colonización por células linfoides (QCPN-) del origen dispensador de (pollo).
| Tejido aislado | Etapa de desarrollo | Concentración | Temperatura | Período de incubación |
| Endodermo de la faringe | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | En el hielo | 45 – 60 minutos. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| q E3 | 8 mg/mL | En el hielo | 60 - 90 min. | |
| c E3.5 | ||||
| q E4 | 8 mg/mL | En el hielo | 90 min. | |
| c E4.5 | ||||
| Mesodermo de la Somatopleura | q E2 - E2.5 | 8 mg/mL | En el hielo | 30 – 50 min. |
| c E2.5 - E3 | ||||
| c, pollo; E, día embrionario; q, codorniz. | ||||
Tabla 1: Condiciones de digestión enzimática durante el aislamiento de los tejidos embrionarios.
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Discussion
El procedimiento de aislamiento de tejido embrionario detallado aquí fue mejorado de las técnicas anteriores para producir embriones quiméricos pollo codorniz en contextos biológicos3,5,6.
Este enfoque es adecuado para aislar los tejidos embrionarios puros sin necesidad de manipulación genética o el uso de marcadores específicos de tejido, que son a menudo indeterminado, limitar el uso de modelos animales modificados genéticamente. Puede ser utilizado para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante el desarrollo, con la capacidad de aislar tejidos puros, siendo el factor limitante. Por ejemplo, como avances de desarrollo, los tejidos se convierten en más gruesos, más compacto y colocar a otros tejidos vecinos, tal que su separación es más difícil. Este procedimiento de aislamiento es, por lo tanto, inadecuado para etapas posteriores del desarrollo, es decir, finales de organogénesis.
Este método es único para el estudio de expresión génica en 3D conserva los tejidos embrionarios. Para asegurar la integridad 3D de los tejidos aislados, instrumentos, materiales y soluciones deben conservarse a bajas temperaturas durante todo el proceso.
El procedimiento de la microdisección de tejidos también es un paso crítico que se basa, no sólo en el cuidado de establecimiento de las condiciones experimentales (como temperatura y duración de la digestión enzimática, como ejemplo en tabla 1), sino también en la formación práctica requiere mucho tiempo. Este procedimiento requiere práctica y paciencia. Si el operador pierde las referencias de la región para ser disecado, disminuyendo el aumento de estereoscopio (20 x) proporcionará una observación general que ayude a la decisión de mover siguiente.
48 h en el paso de vitro fue establecida para promover las interacciones celulares entre distintos tejidos embrionarios, mientras que la ovo en tejido cultivado en la CAM apoya el desarrollo a largo plazo y formación de la quimérico órgano de la Asociación heteroespecíficas de tejidos 5. las asociaciones de tejidos in vitro pueden superar algunas limitaciones de la manipulación en vivo. Por ejemplo, la administración local de medicamentos o factores de crecimiento (con granos) en regiones del embrión de otra manera inaccesible en vivo, puede realizar fácilmente utilizando este enfoque in vitro. Esto ha demostrado previamente para imitar las interacciones locales del tejido durante la formación de órganos en la región faríngea5.
Explantes en CAM5,7,8 es menos desperdiciadora de tiempo y es un método simple para realizar un seguimiento de explantes en comparación con los métodos de recogida de los tejidos injertados en la pared del cuerpo de embriones quiméricos3. Además, CAM puede ser trasplantada con las células y tejidos de otras especies no-aviar, y se ha utilizado con éxito en varios contextos experimentales, desarrollo de cáncer14,15. Por ejemplo, el análisis de la CAM se aplicó previamente en ratones en pollo xenoinjertos estudios16 y con frecuencia se utiliza para probar la capacidad invasiva de las células de tumores humanos15.
Recientemente, un elegante estudio con humanos en pollo xenoinjerto ha validado el embrión de pollo como modelo para probar y explorar los principios del desarrollo humano17. En el futuro, sería interesante explorar la metodología aquí descrita mediante la asociación entre las especies de los tejidos, que puede proporcionar enfoques adicionales para el mouse y estudios del desarrollo humanos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecemos a Isabel Alcobia por la lectura crítica del manuscrito, Mário Henriques video narración y Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con un sistema de vídeo y Interaves - Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
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