Summary

भ्रूण के ऊतकों का अलगाव और बटेर के गठन-चिकन Chimeric थाइमस उदाहरण का उपयोग अंगों

Published: February 16, 2019
doi:

Summary

यह लेख बटेर और चिकन भ्रूण है कि पूर्व vivo chimeric अंगों फार्म के लिए संयुक्त किया जा सकता से शुद्ध भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करता है ।

Abstract

भ्रूण के ऊतकों को अलग करने की क्षमता बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली है, जो बारी में विकास जीव विज्ञान में प्रमुख प्रक्रियाओं का अनावरण करने के लिए निर्विवाद योगदान प्रदान की है की स्थापना के लिए एक आवश्यक कदम था ।

इस के साथ साथ microsurgery और एंजाइमी पाचन द्वारा बटेर और मुर्गियों से भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन किया है, जबकि इसके जैविक गुणों के संरक्षण । अलगाव के बाद, दोनों प्रजातियों के ऊतकों में एक में जुड़े है इन विट्रो organotypic परख के लिए ४८ h. बटेर और चिकन के ऊतकों को अलग परमाणु सुविधाओं और आणविक मार्करों के बीच सेलुलर पार बात के अध्ययन की अनुमति द्वारा भेदभाव किया जा सकता है ऊतकों के heterospecific एसोसिएशन । इस दृष्टिकोण है, इसलिए, ग्रसनी morphogenesis और अग्रांत्र के गठन के दौरान होने वाले उन के रूप में अत्यधिक गतिशील स्थानिक संशोधनों के साथ विकासात्मक प्रक्रियाओं में जटिल ऊतक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है अन्तः-व्युत्पंन अंगों । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण सबसे पहले थाइमस गठन के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. इस में, अन्तः भावी thymic और मध्य त्वक स्तर-व्युत्पंन mesenchyme व्युत्पंन, बटेर और चिकन भ्रूण, क्रमशः से अलग किया गया ।

अंगों को उत्पन्न करने के लिए संबद्ध ऊतकों की क्षमता आगे उन्हें एक चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सांचा) पर भ्रष्टाचार द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । कैम पोषक तत्वों प्रदान करता है और explanted ऊतकों को गैस एक्सचेंजों की अनुमति देता है । ovo के विकास में 10 दिनों के बाद, chimeric अंगों को पारंपरिक रूपात्मक विधियों द्वारा काटा explants में विश्लेषण किया जा सकता है । यह प्रक्रिया भी अंग गठन के दौरान ऊतक विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने की अनुमति देता है, अपने प्रारंभिक विकास से (इन विट्रो विकास) organogenesis के अंतिम चरणों (ovo विकास में) ।

अंत में, बेहतर अलगाव विधि भी प्रदान करता है तीन आयामी (3 डी) संरक्षित भ्रूण के ऊतकों, कि भी ऊतक के उच्च संकल्प स्थलाकृतिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विशिष्ट जीन-अभिव्यक्ति पैटर्न.

Introduction

1970 के दशक में, एक सुरुचिपूर्ण बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली Le Douarin द्वारा विकसित किया गया था, नए रास्ते खोलने के लिए सेल प्रवासन और सेलुलर बातचीत के विकास के दौरान की भूमिका को समझने के लिए1,2. मॉडल आधार है कि दो प्रजातियों के बीच सेल विनिमय काफी embryogenesis परेशान नहीं होता पर तैयार किया गया था, बाद में जब कई विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की पुष्टि की, तंत्रिका और टेम के गठन सहित सिस्टम1. एक उदाहरण के रूप में उत्तरार्द्ध ले रही है, टेम progenitors बस्तियां thymic उपकला रुडी के चक्रीय तरंगों पहली बार बटेर का उपयोग कर मनाया गया था-चिकन कल्पना प्रणाली3. उस के लिए, थाइमस के संभावित क्षेत्र, तीसरे और चौथे ग्रसनी पाउच (3/4PP) के अन्तः, यांत्रिक और enzymatically बटेर से अलग कर दिया गया था (क्यू) 15 से 30-somite चरण [भ्रूण दिवस (ई) १.५ में भ्रूण-ई 2.5] । इन चरणों चिकन हैमबर्गर और हैमिल्टन4 (एचएच) के अनुरूप-चरणों 12-17 । trypsin के उपयोग से शुरू की गई अलगाव प्रक्रियाएं अन्तः को संलग्न mesenchyme से enzymatically अलग कर देना । अलग अन्तः एक मेजबान चिकन के somatopleura क्षेत्र में भ्रष्टाचार किया गया था (सी) E3 पर भ्रूण-e 3.5 (एचएच-20-21 चरणों) । इस heterologous mesenchyme “स्वतंत्र” thymic उपकला विकास भी अंग गठन3के लिए योगदान करने के लिए माना जाता था. इसके बाद, चिकन मेजबान रक्त जनित जनक कोशिकाओं के क्रमिक तरंगों बटेर दाता thymic उपकला समकक्ष मेजबान भ्रूण3में थाइमस गठन के लिए योगदान घुसपैठ ।

हाल ही में, इस दृष्टिकोण का एक संशोधित संस्करण भी थाइमस गठन5के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया था । इस संबंध में, chimeric भ्रूण3 में अस्थानिक थाइमस के गठन में शामिल ऊतकों अलग थे, दोनों दाता और मेजबान भ्रूण से, और संबद्ध पूर्व vivo । एक बेहतर प्रोटोकॉल के लिए बटेर 3/4PP अन्तः (ई 2.5-e3) और चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर (ई 2.5-e3) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संक्षेप में, भ्रूण के ऊतकों microsurgery द्वारा अलग किया गया था और के अधीन इन विट्रो pancreatin पाचन । इसके अलावा, एंजाइमी पाचन, तापमान और समय की गर्मी की स्थिति ऊतक के अनुसार अनुकूलित-प्रकार और विकासात्मक चरण (तालिका 1) थे ।

अगले, अलग ऊतक एक organotypic में ४८ एच के लिए इन विट्रो प्रणाली में जुड़े थे, के रूप में पहले5,6की सूचना दी । ऊतकों के इन विट्रो एसोसिएशन में स्थानीय सेलुलर बातचीत भ्रूण की नकल, vivo हेरफेर में से कुछ प्रतिबंध पर काबू पाने. यह प्रणाली विशेष रूप से जटिल morphogenic घटनाओं में सेलुलर बातचीत, जैसे ग्रसनी तंत्र के विकास के अध्ययन के लिए उपयोगी है ।

थाइमस histogenesis में प्रत्येक ऊतक के योगदान, के रूप में अच्छी तरह के रूप में heterospecific एसोसिएशन की क्षमता के लिए एक थाइमस उत्पंन आगे सांचा पद्धति का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, पहले विस्तृत5,7,8। संक्षेप में, प्रसंस्कृत ऊतकों cE8 भ्रूण के सांचा पर भ्रष्टाचार कर रहे थे और 10 दिनों के लिए ovo में विकसित करने की अनुमति दी । फिर, थाइमस गठन रूपात्मक विश्लेषण द्वारा काटा explants में मूल्यांकन किया गया था । के रूप में शास्त्रीय बटेर-चिकन अध्ययन3, बटेर thymic उपकला टेम जनक कोशिकाओं (HPCs) चिकन भ्रूण है, जो बाद में अंग विकास9,10 में योगदान दिखाया गया से व्युत्पंन द्वारा बृहदांत्र था . HPCs उच्च संवहनी सांचा5,7,8के माध्यम से अस्थानिक chimeric थाइमस के लिए भ्रूण से चले गए । बटेर व्युत्पंन thymic उपकला प्रजातियों का उपयोग immunohistochemistry द्वारा पहचाना जा सकता है विशिष्ट एंटीबॉडी (यानी, QCPN-मॉब बटेर PeriNuclear), ऊतक विशिष्ट आणविक मार्करों के लिए की जरूरत पर काबू पाने ।

इस प्रायोगिक विधि, दो कदम दृष्टिकोण के रूप में पिछले8प्रकाशन में रिपोर्ट, औषधीय एजेंटों के नियमित प्रशासन द्वारा संकेत रास्ते के मॉडुलन में इन विट्रो में और ovo विकास के दौरान अनुमति देता है । इसके अलावा, explants प्रयोग8के पाठ्यक्रम के किसी भी समय-बिंदु पर काटा जा सकता है ।

अंत में, अलगाव प्रोटोकॉल यहां विस्तृत प्राकृतिक गुणों और भ्रूण के ऊतकों की 3d वास्तुकला के संरक्षण की अनुमति देता है, विशेष रूप से सीटू जीन में विस्तार करने के लिए उपयोगी-भ्रूण क्षेत्रों के अभिव्यक्ति पैटर्न अंयथा द्वारा दुर्गम पारंपरिक तरीकों । इसके अलावा, आरएनए-seq या microarrays सहित transcriptome विश्लेषण दृष्टिकोण, एक ऊतक विशिष्ट उच्च प्रवाह “ओमिक्स” विश्लेषण प्रदान करते हुए आनुवंशिक मार्कर की आवश्यकता के बिना भी अलग ऊतकों में लागू किया जा सकता है.

Protocol

इन सभी प्रयोगों Centro Académico de Medicina de Lisboa के पशु देखभाल और नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें । 1. निषेचित बटेर और चिकन अंडे की मशीन 3 दिनों के लिए एक ३८ डिग्री सेल्सियस humidified मशीन में जापानी बटेर (Coturnix Cotur…

Representative Results

प्रोटोकॉल एक विधि के लिए एवियन भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए कई सेलुलर और विकासात्मक जीवविज्ञान तकनीकी दृष्टिकोण में इस्तेमाल किया जा विवरण । इस विधि पहले थाइमस गठन5के प्रारं?…

Discussion

भ्रूण ऊतक अलगाव प्रक्रिया यहां विस्तृत पिछले तकनीक से सुधार के लिए बटेर-चिकन chimeric भ्रूण विभिंन जैविक संदर्भों में3,5,6उत्पादन किया गया ।

यह दृष्टिकोण आनुवंश…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए इसाबेल Alcobia के आभारी हैं, वीडियो कथन के लिए Mário हेनरिक्स के लिए और Proa de प्रोटोकॉल ई Instituto Histologia, Biologia de Desenvolvimento de Faculdade की Medicina सेवा से वीटर Lisboa, Universidade डी Lisboa, तकनीकी सहायता के लिए । हम विशेष रूप से पाउलो Caeiro और ह्यूगो सिल्वा Unidade de audiovisuais (Audiovisual इकाई), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa के लिए उनके इस वीडियो के उत्पादन के लिए उत्कृष्ट प्रतिबद्धता के लिए ऋणी हैं । हम एक वीडियो प्रणाली के साथ सुसज्जित stereoscope प्रदान करने के लिए Leica माइक्रोसिस्टंस स्वीकार करते हैं और बटेर निषेचित अंडे के साथ योगदान के लिए Interaves-Sociedade एग्रो Pecuária, एस. ए. यह काम Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Metal grid Goodfellows fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) from supermarket 
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette Normax 5426015
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Pancreatin Sigma-Aldrich P-3292 Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30 0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10 0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Microscope Leica Microsystems  DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner  Hamamatsu Photonics C13220-01
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80

References

  1. Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
  3. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
  4. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  5. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).
  6. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  7. Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).
  8. Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
  9. Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
  10. Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
  11. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  12. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  13. Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).
  14. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  15. Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  16. Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
  17. Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).

Play Video

Cite This Article
Figueiredo, M., Neves, H. Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example. J. Vis. Exp. (144), e58965, doi:10.3791/58965 (2019).

View Video