भ्रूण के ऊतकों का अलगाव और बटेर के गठन-चिकन Chimeric थाइमस उदाहरण का उपयोग अंगों
Summary
यह लेख बटेर और चिकन भ्रूण है कि पूर्व vivo chimeric अंगों फार्म के लिए संयुक्त किया जा सकता से शुद्ध भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करता है ।
Abstract
भ्रूण के ऊतकों को अलग करने की क्षमता बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली है, जो बारी में विकास जीव विज्ञान में प्रमुख प्रक्रियाओं का अनावरण करने के लिए निर्विवाद योगदान प्रदान की है की स्थापना के लिए एक आवश्यक कदम था ।
इस के साथ साथ microsurgery और एंजाइमी पाचन द्वारा बटेर और मुर्गियों से भ्रूण के ऊतकों को अलग करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन किया है, जबकि इसके जैविक गुणों के संरक्षण । अलगाव के बाद, दोनों प्रजातियों के ऊतकों में एक में जुड़े है इन विट्रो organotypic परख के लिए ४८ h. बटेर और चिकन के ऊतकों को अलग परमाणु सुविधाओं और आणविक मार्करों के बीच सेलुलर पार बात के अध्ययन की अनुमति द्वारा भेदभाव किया जा सकता है ऊतकों के heterospecific एसोसिएशन । इस दृष्टिकोण है, इसलिए, ग्रसनी morphogenesis और अग्रांत्र के गठन के दौरान होने वाले उन के रूप में अत्यधिक गतिशील स्थानिक संशोधनों के साथ विकासात्मक प्रक्रियाओं में जटिल ऊतक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है अन्तः-व्युत्पंन अंगों । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण सबसे पहले थाइमस गठन के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था. इस में, अन्तः भावी thymic और मध्य त्वक स्तर-व्युत्पंन mesenchyme व्युत्पंन, बटेर और चिकन भ्रूण, क्रमशः से अलग किया गया ।
अंगों को उत्पन्न करने के लिए संबद्ध ऊतकों की क्षमता आगे उन्हें एक चिकन भ्रूण के chorioallantoic झिल्ली (सांचा) पर भ्रष्टाचार द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । कैम पोषक तत्वों प्रदान करता है और explanted ऊतकों को गैस एक्सचेंजों की अनुमति देता है । ovo के विकास में 10 दिनों के बाद, chimeric अंगों को पारंपरिक रूपात्मक विधियों द्वारा काटा explants में विश्लेषण किया जा सकता है । यह प्रक्रिया भी अंग गठन के दौरान ऊतक विशिष्ट योगदान का अध्ययन करने की अनुमति देता है, अपने प्रारंभिक विकास से (इन विट्रो विकास) organogenesis के अंतिम चरणों (ovo विकास में) ।
अंत में, बेहतर अलगाव विधि भी प्रदान करता है तीन आयामी (3 डी) संरक्षित भ्रूण के ऊतकों, कि भी ऊतक के उच्च संकल्प स्थलाकृतिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विशिष्ट जीन-अभिव्यक्ति पैटर्न.
Introduction
1970 के दशक में, एक सुरुचिपूर्ण बटेर-चिकन कल्पना प्रणाली Le Douarin द्वारा विकसित किया गया था, नए रास्ते खोलने के लिए सेल प्रवासन और सेलुलर बातचीत के विकास के दौरान की भूमिका को समझने के लिए1,2. मॉडल आधार है कि दो प्रजातियों के बीच सेल विनिमय काफी embryogenesis परेशान नहीं होता पर तैयार किया गया था, बाद में जब कई विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की पुष्टि की, तंत्रिका और टेम के गठन सहित सिस्टम1. एक उदाहरण के रूप में उत्तरार्द्ध ले रही है, टेम progenitors बस्तियां thymic उपकला रुडी के चक्रीय तरंगों पहली बार बटेर का उपयोग कर मनाया गया था-चिकन कल्पना प्रणाली3. उस के लिए, थाइमस के संभावित क्षेत्र, तीसरे और चौथे ग्रसनी पाउच (3/4PP) के अन्तः, यांत्रिक और enzymatically बटेर से अलग कर दिया गया था (क्यू) 15 से 30-somite चरण [भ्रूण दिवस (ई) १.५ में भ्रूण-ई 2.5] । इन चरणों चिकन हैमबर्गर और हैमिल्टन4 (एचएच) के अनुरूप-चरणों 12-17 । trypsin के उपयोग से शुरू की गई अलगाव प्रक्रियाएं अन्तः को संलग्न mesenchyme से enzymatically अलग कर देना । अलग अन्तः एक मेजबान चिकन के somatopleura क्षेत्र में भ्रष्टाचार किया गया था (सी) E3 पर भ्रूण-e 3.5 (एचएच-20-21 चरणों) । इस heterologous mesenchyme “स्वतंत्र” thymic उपकला विकास भी अंग गठन3के लिए योगदान करने के लिए माना जाता था. इसके बाद, चिकन मेजबान रक्त जनित जनक कोशिकाओं के क्रमिक तरंगों बटेर दाता thymic उपकला समकक्ष मेजबान भ्रूण3में थाइमस गठन के लिए योगदान घुसपैठ ।
हाल ही में, इस दृष्टिकोण का एक संशोधित संस्करण भी थाइमस गठन5के प्रारंभिक चरणों के दौरान उपकला-mesenchymal बातचीत के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण साबित हो गया था । इस संबंध में, chimeric भ्रूण3 में अस्थानिक थाइमस के गठन में शामिल ऊतकों अलग थे, दोनों दाता और मेजबान भ्रूण से, और संबद्ध पूर्व vivo । एक बेहतर प्रोटोकॉल के लिए बटेर 3/4PP अन्तः (ई 2.5-e3) और चिकन somatopleura मध्य त्वक स्तर (ई 2.5-e3) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संक्षेप में, भ्रूण के ऊतकों microsurgery द्वारा अलग किया गया था और के अधीन इन विट्रो pancreatin पाचन । इसके अलावा, एंजाइमी पाचन, तापमान और समय की गर्मी की स्थिति ऊतक के अनुसार अनुकूलित-प्रकार और विकासात्मक चरण (तालिका 1) थे ।
अगले, अलग ऊतक एक organotypic में ४८ एच के लिए इन विट्रो प्रणाली में जुड़े थे, के रूप में पहले5,6की सूचना दी । ऊतकों के इन विट्रो एसोसिएशन में स्थानीय सेलुलर बातचीत भ्रूण की नकल, vivo हेरफेर में से कुछ प्रतिबंध पर काबू पाने. यह प्रणाली विशेष रूप से जटिल morphogenic घटनाओं में सेलुलर बातचीत, जैसे ग्रसनी तंत्र के विकास के अध्ययन के लिए उपयोगी है ।
थाइमस histogenesis में प्रत्येक ऊतक के योगदान, के रूप में अच्छी तरह के रूप में heterospecific एसोसिएशन की क्षमता के लिए एक थाइमस उत्पंन आगे सांचा पद्धति का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, पहले विस्तृत5,7,8। संक्षेप में, प्रसंस्कृत ऊतकों cE8 भ्रूण के सांचा पर भ्रष्टाचार कर रहे थे और 10 दिनों के लिए ovo में विकसित करने की अनुमति दी । फिर, थाइमस गठन रूपात्मक विश्लेषण द्वारा काटा explants में मूल्यांकन किया गया था । के रूप में शास्त्रीय बटेर-चिकन अध्ययन3, बटेर thymic उपकला टेम जनक कोशिकाओं (HPCs) चिकन भ्रूण है, जो बाद में अंग विकास9,10 में योगदान दिखाया गया से व्युत्पंन द्वारा बृहदांत्र था . HPCs उच्च संवहनी सांचा5,7,8के माध्यम से अस्थानिक chimeric थाइमस के लिए भ्रूण से चले गए । बटेर व्युत्पंन thymic उपकला प्रजातियों का उपयोग immunohistochemistry द्वारा पहचाना जा सकता है विशिष्ट एंटीबॉडी (यानी, QCPN-मॉब बटेर PeriNuclear), ऊतक विशिष्ट आणविक मार्करों के लिए की जरूरत पर काबू पाने ।
इस प्रायोगिक विधि, दो कदम दृष्टिकोण के रूप में पिछले8प्रकाशन में रिपोर्ट, औषधीय एजेंटों के नियमित प्रशासन द्वारा संकेत रास्ते के मॉडुलन में इन विट्रो में और ovo विकास के दौरान अनुमति देता है । इसके अलावा, explants प्रयोग8के पाठ्यक्रम के किसी भी समय-बिंदु पर काटा जा सकता है ।
अंत में, अलगाव प्रोटोकॉल यहां विस्तृत प्राकृतिक गुणों और भ्रूण के ऊतकों की 3d वास्तुकला के संरक्षण की अनुमति देता है, विशेष रूप से सीटू जीन में विस्तार करने के लिए उपयोगी-भ्रूण क्षेत्रों के अभिव्यक्ति पैटर्न अंयथा द्वारा दुर्गम पारंपरिक तरीकों । इसके अलावा, आरएनए-seq या microarrays सहित transcriptome विश्लेषण दृष्टिकोण, एक ऊतक विशिष्ट उच्च प्रवाह “ओमिक्स” विश्लेषण प्रदान करते हुए आनुवंशिक मार्कर की आवश्यकता के बिना भी अलग ऊतकों में लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
भ्रूण ऊतक अलगाव प्रक्रिया यहां विस्तृत पिछले तकनीक से सुधार के लिए बटेर-चिकन chimeric भ्रूण विभिंन जैविक संदर्भों में3,5,6उत्पादन किया गया ।
यह दृष्टिकोण आनुवंश…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए इसाबेल Alcobia के आभारी हैं, वीडियो कथन के लिए Mário हेनरिक्स के लिए और Proa de प्रोटोकॉल ई Instituto Histologia, Biologia de Desenvolvimento de Faculdade की Medicina सेवा से वीटर Lisboa, Universidade डी Lisboa, तकनीकी सहायता के लिए । हम विशेष रूप से पाउलो Caeiro और ह्यूगो सिल्वा Unidade de audiovisuais (Audiovisual इकाई), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa के लिए उनके इस वीडियो के उत्पादन के लिए उत्कृष्ट प्रतिबद्धता के लिए ऋणी हैं । हम एक वीडियो प्रणाली के साथ सुसज्जित stereoscope प्रदान करने के लिए Leica माइक्रोसिस्टंस स्वीकार करते हैं और बटेर निषेचित अंडे के साथ योगदान के लिए Interaves-Sociedade एग्रो Pecuária, एस. ए. यह काम Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
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