Summary

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

Published: February 16, 2019
doi:

Summary

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Abstract

La capacità di isolare i tessuti embrionali era un passo essenziale per stabilire il sistema di quaglia-pollo chimera, che a sua volta ha fornito contributi indiscussi per svelare processi chiave nella biologia inerente allo sviluppo.

Qui è descritto un metodo ottimizzato per isolare i tessuti embrionali da quaglie e polli di microchirurgia e digestione enzimatica pur conservando le sue proprietà biologiche. Dopo l’isolamento, tessuti da entrambe le specie sono associati in un saggio in vitro organotipiche per 48 h. Quaglia e tessuti di pollo possono essere discriminate da distinte caratteristiche nucleari e marcatori molecolari, permettendo lo studio del cellulare cross-talk tra Associazione heterospecific dei tessuti. Questo approccio è, pertanto, uno strumento utile per lo studio delle interazioni complesse del tessuto in processi di sviluppo con modifiche spaziali altamente dinamiche, come quelle che si verificano durante la morfogenesi della faringe e la formazione della del foregut endoderma-derivato organi. Questo approccio sperimentale è stato sviluppato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi di formazione di timo. In questo, l’endoderma-derivato prospettico rudimento timico e mesenchima derivato dal mesoderma, sono state isolate da embrioni di pollo e quaglia, rispettivamente.

La capacità dei tessuti associati per generare gli organi possa essere ulteriormente testata mediante innesto li sulla membrana corio-allantoidea (CAM) di un embrione di pollo. Il CAM fornisce le sostanze nutrienti e consente lo scambio di gas ai tessuti espiantati. Dopo 10 giorni di sviluppo di ovo, gli organi chimerici possono essere analizzati in espianti di raccolti con i metodi morfologici convenzionali. Questa procedura permette anche di studiare tessuto-specifici contributi durante la formazione dell’organo, dal suo iniziale sviluppo (sviluppo in vitro) alle fasi finali dell’organogenesi (in sviluppo di ovo).

Infine, il metodo migliore isolamento fornisce anche tridimensionale (3D) conservato tessuti embrionali, che possono essere utilizzati anche per analisi topografiche ad alta risoluzione dei modelli di espressione genica tessuto-specifica.

Introduction

Agli inizi del 1970, un sistema elegante quaglia-pollo chimera è stato sviluppato da Le Douarin, aprendo nuove vie per comprendere il ruolo della migrazione cellulare e interazioni cellulari durante lo sviluppo1,2. Il modello è stato ideato sulla premessa che scambio di cellule tra le due specie non vorrei disturbare notevolmente l’embriogenesi, successivamente confermato quando utilizzati per lo studio di numerosi processi di sviluppo, tra cui la formazione del sistema nervoso e l’ematopoietiche sistemi1. Prendendo quest’ultimo come un esempio, le onde cicliche dei progenitori ematopoietici colonizzando il rudimento epiteliale del timo in primo luogo è stata osservata mediante quaglia-pollo chimera system3. Per questo, il territorio prospettico del timo, l’endoderma dei sacchetti di terzi e quarto pharyngeal (3/4PP), era meccanicamente ed enzimaticamente isolato da embrioni di quaglia (q) in 15-30 – fase somite [giorno embrionale (E) 1.5-E2.5]. Queste fasi corrispondono al pollo Hamburger e Hamilton4 (HH) – fasi 12-17. Le procedure di isolamento iniziato con l’uso di tripsina enzimaticamente dissociare l’endoderma dal mesenchima allegato. L’endoderma isolato è stato innestato nella regione somatopleura di embrione di pollo (c) ospite presso E3-E3.5 (HH-fasi 20-21). Questo mesenchima eterologa è stato considerato “permissivo” allo sviluppo di epitelio timico che contribuiscono anche alla formazione dell’organo3. In seguito, ondate successive di cellule progenitrici ematica di pollo ospite infiltrato la controparte quaglia donatore timici epiteliali che contribuiscono alla formazione di timo in embrione host3.

Più recentemente, una versione modificata di questo approccio è stato anche dimostrata di essere importante per lo studio delle interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. A questo proposito, i tessuti coinvolti nella formazione del timo ectopico in embrioni chimerici3 erano isolati, sia da donatore e host embrioni e associati ex vivo. Un protocollo migliorato è stato usato per isolare l’endoderma 3/4PP di quaglia (E2.5-E3) e il mesoderma somatopleura di pollo (E2.5-E3). Brevemente, i tessuti embrionali sono stati isolati di microchirurgia e soggetto a digestione in vitro pancreatina. Inoltre, le condizioni di digestione enzimatica, temperatura e tempo di incubazione sono state ottimizzate secondo tessuto tipo e Stadio di sviluppo (tabella 1).

Successivamente, i tessuti isolati sono stati associati in un organotipiche sistema in vitro per 48 h, come precedentemente segnalato5,6. L’associazione in vitro di tessuti imita il locale interazioni cellulari nell’embrione, superando alcune restrizioni della manipolazione in vivo. Questo sistema è particolarmente utile per studiare le interazioni cellulari in eventi morfogenetici complessi, quali lo sviluppo dell’apparato faringeo.

Il contributo di ogni tessuto nell’istogenesi di timo, così come la capacità dell’associazione heterospecific per generare un timo può essere ulteriormente esplorato utilizzando la metodologia di CAM, precedentemente dettagliate5,7,8. Succintamente, i tessuti coltivati sono stati innestati la CAM di embrioni cE8 e ha permesso di sviluppare in ovo per 10 giorni. Quindi, formazione di timo è stata valutata mediante analisi morfologica in espianti di raccolti. Come gli studi classici di quaglia-pollo3, l’epitelio timico quaglia è stata colonizzata da cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da un embrione di pollo, che più successivamente è stato indicato per contribuire allo sviluppo di organo9,10 . La HPCs migrati dall’embrione al timo ectopico chimerico attraverso l’altamente vascularized CAM5,7,8. Quaglia epitelio timico derivata può essere identificato mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi specie-specifici (cioè, QCPN – MAb Quaglia perinucleare), superando la necessità di marcatori molecolari del tessuto-specifica.

Questo metodo sperimentale, come l’approccio in due fasi segnalato nella precedente pubblicazione8, consente la modulazione della trasduzione del segnale dalla regolare somministrazione di agenti farmacologici durante in vitro e in sviluppo di ovo. Inoltre, espianti possono essere raccolto in qualsiasi momento del corso dell’ esperimento8.

Infine, il protocollo di isolamento qui dettagliato consente la conservazione delle proprietà naturali e 3D-architettura di tessuti embrionali, particolarmente utili per dettagliare modelli di espressione genica in situ dei territori embrionali altrimenti inaccessibili da metodi convenzionali. Inoltre, approcci di analisi del trascrittoma, tra cui RNA-seq o microarrays, possono anche applicarsi in tessuti isolati senza la necessità di marcatori genetici, fornendo un’analisi di tessuto-specifico elevato throughput “omics”.

Protocol

Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e orientamenti etici del Centro Académico de Medicina de Lisboa. 1. l’incubazione delle uova di quaglia e pollo fertilizzato Posto fecondate le uova di quaglia giapponese (Coturnix japonica del coturnix) in un incubatore di 38 ° C per 3 giorni. Incubare le uova (estremità smussata uovo) rivolto verso l’alto nella camera d’aria.Nota: L’ambiente umidificato si ottiene inserendo un contenitore di acqua nella parte in…

Representative Results

Il protocollo in dettaglio un metodo per isolare i tessuti embrionali aviaria per essere utilizzato in diversi approcci tecnici di biologia cellulare e dello sviluppo. Questo metodo è stato precedentemente impiegato per studiare le interazioni epiteliale-mesenchymal durante le prime fasi della formazione di timo5. Nel presente documento, nuovi risultati sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2, utilizzando…

Discussion

La procedura di isolamento del tessuto embrionale dettagliata qui è stata migliorata dalle precedenti tecniche per produrre gli embrioni chimerici quaglia-pollo in diversi contesti biologici3,5,6.

Questo approccio è adatto per isolare i tessuti embrionali puri senza la necessità di manipolazione genetica o l’uso di marcatori tessuto-specifici, che spesso sono indeterminati, limitando l’uso di model…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati a Isabel Alcobia per la lettura critica del manoscritto, Mário Henriques per video narrazione e Vitor Proa dal servizio istologia dell’Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, per il supporto tecnico. Siamo particolarmente grati a Paulo Caeiro e Hugo Silva dalla Unidade de audiovisuais (unità audiovisivi), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa per il loro eccezionale impegno alla produzione di questo video. Riconosciamo Leica Microsystems per gentilmente fornire uno stereoscopio equipaggiato con un sistema di video e di Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, s. a per aver contribuito con Quaglia fecondate le uova. Questo lavoro è stato supportato da Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Materials

Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) Pintobar, Portugal Poultry farm 
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) Interaves, Portugal Bird farm 
15 mL PP centrifuge tubes Corning 430052
50 mL PP centrifuge tubes Corning 430290
60 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes Duran group 21 755 48
Metal grid Goodfellows fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter Millipore DTTP01300 0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm Sigma-Aldrich P5112 
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) from supermarket 
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) from supermarket 
Transfer pipettes Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific 2041S 2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette Normax 5426015
Clear plastic tape from supermarket 
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 BMA Biomedicals T-1302
Fetal Bovine Serum Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Standart FBS
Pancreatin Sigma-Aldrich P-3292 Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS) GIBCO, Thermo Fisher Scientific 10010023
QCPN antibody Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  GIBCO, Thermo Fisher Scientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit ELKEM/Silmid RH141001KG To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-30  Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved Fine Science Tools 14085-08 Curved scissors
Insect pins  Fine Science Tools 26001-30 0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula  Fine Science Tools 10087-12 Transplantation spoon
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20 0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10 0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12 Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-17 Skimmer
Wecker Eye Scissor Fine Science Tools 15010-11
Camera Leica Microsystems  MC170 HD
Microscope Leica Microsystems  DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner  Hamamatsu Photonics C13220-01
Stereoscope Leica Microsystems  Leica M80

References

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Cite This Article
Figueiredo, M., Neves, H. Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example. J. Vis. Exp. (144), e58965, doi:10.3791/58965 (2019).

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